1、1六、膜片钳技术六、膜片钳技术2膜片钳技术运用微玻管电极（膜片电极膜片钳技术运用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆giga giga ohm seal,10ohm seal,101010欧姆（欧姆（GG） 以上的阻抗使之以上的阻抗使之对接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片对接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（膜片）与其周围在电学上分隔，在此区域（膜片）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（离子电流（pApA级）进行检测记录。级）进行检测记录。34膜片钳技术膜片钳
2、技术An electrical wave, which propagates along the nerve fiberCaused by the sequential opening of Na+ and K+ channelsBeing generated at the axon hillock by the integration of excitatory and inhibitory synaptic inputs Hodgkin 和和 Huxley 1952: 动作电位是神经细胞膜通透性改变的结果动作电位是神经细胞膜通透性改变的结果单通道的到来单通道的到来：1969人工膜上的人工膜
3、上的短杆菌肽通道短杆菌肽通道Individual Channel Currents superimpose to Noise:单通道电流单通道电流有噪音叠加有噪音叠加7l19761976年德国马普生物物理化学研究所年德国马普生物物理化学研究所NeherNeher和和SakmannSakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到位的同时，记录到AChACh激活的单通道离子电流，激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳（从而产生了膜片钳（patch clamppatch clamp）技术）技术膜片钳技术发展的历史膜片钳技术发展的历史89 内尔内尔(N
4、eher) 萨克曼萨克曼(Sakmann) （1944-） （1942-） （德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家） （德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）10Patch Clamp (1976 ve sonras)11第一次记录第一次记录:12l19801980年年SigworthSigworth等在记录电极内施加等在记录电极内施加5-50 cmH5-50 cmH2 2O O的负压吸引，得到的负压吸引，得到10-100G10-100G的高阻封接的高阻封接（Giga-sealGiga-seal），大大降低了记录时的噪声，实），大大降低了记录时的噪声，实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电
5、现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。流的突破。13第一次记录第一次记录:改进改进: 千兆欧（千兆欧（G）封接）封接14l19811981年年HamillHamill和和NeherNeher等对该技术进行了改等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有从而使该技术更趋完善，具有1pA1pA的电流灵的电流灵敏度、敏度、1m1m的空间分辨率和的空间分辨率和10s10s的时间分的时间分辨率。辨率。15l19831983年年1010月月Single-Channel RecordingSingle-Channel
6、 Recording一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann Sakmann 和和NeherNeher也因其杰出的工作和突出也因其杰出的工作和突出贡献，荣获贡献，荣获19911991年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。16THE PATCH-CLAMP TECHNIQUEErwin NeherBert SakmannGermany(1991 Nobel Laureates) gigaseal17 1983年年10月第一版月第一版 Single-Channel Recording封面封面1819202122（二）膜片钳记录的基本模式（二）膜片钳记录的基本模式1.
7、 贴附式记录模式贴附式记录模式 (Cell-attached or On cell mode)2. 内膜向外记录模式内膜向外记录模式 (Inside-out mode)3. 外膜向外记录模式外膜向外记录模式 (Outside-out mode)4. 全细胞记录模式全细胞记录模式 (Whole-cell recording)23CELL-ATTACHED24Pipette HolderP: pipetteO: O-ringsTd: threadsT: teflon body sectionsA: aluminium body shieldsAg: chlorided silver electro
8、deS: silicone tubing to apply suctionBNC: connector pin 26微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。此时可看极施加一负压，形成高阻抗封接。此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。以利于不失真的观察一个通道的活动状态。27Looking through the microscopePatch pipetteEjection pi
9、petteCell body50mIsolated neuronalcell bodymaintained inculturepatch-clamp techniquefor recordingelectrical activityDEET3132INSIDE-OUT33电极接触细胞电极接触细胞负压吸引形成负压吸引形成形膜囊泡形膜囊泡提起电极提起电极,囊泡与细胞脱离囊泡与细胞脱离ABCD大鼠肌球细胞大鼠肌球细胞ACh受体单通道电流受体单通道电流34OUTSIDE-OUT35WHOLE-CELL19:073619:0737穿孔膜片钳法穿孔膜片钳法其特点是不打破电极腔下的细胞膜片，而代之其特点是不
10、打破电极腔下的细胞膜片，而代之以利用在细胞膜上形成高离子通透的小孔来构成以利用在细胞膜上形成高离子通透的小孔来构成可通透性电路。其方法是在电极内液中加入一种可通透性电路。其方法是在电极内液中加入一种多烯抗生素制酶菌素（多烯抗生素制酶菌素（nyatatinnyatatin）或（二性酶素）或（二性酶素B B）等。他们可在细胞膜的双凝脂层中形成孔道。小等。他们可在细胞膜的双凝脂层中形成孔道。小孔的大小只允许一价离子通过，而不允许大分子孔的大小只允许一价离子通过，而不允许大分子通过，所以它具有不破坏细胞内环境的优点。通过，所以它具有不破坏细胞内环境的优点。 383940膜片钳实验结果（示例）膜片钳实验
11、结果（示例）41单个离子通道的离子流特征：单个离子通道的离子流特征：开关式交替出现开关式交替出现-瞬间状态转移瞬间状态转移pA pA 级电流，噪声样涨落级电流，噪声样涨落开放的门控现象开放的门控现象42（一）单通道电导：（一）单通道电导：不同跨膜片电压下，将电流与电压作图，不同跨膜片电压下，将电流与电压作图，可以得到：可以得到：1.1. 通道的单位电导通道的单位电导2.2. 反转电位（反映通透的是什么离子）反转电位（反映通透的是什么离子）43图图3-11 经过离子单通道的电流振幅随着跨膜电压的变化而变化经过离子单通道的电流振幅随着跨膜电压的变化而变化44图图3-12 I-V曲线曲线 45从I-
12、V曲线与零电流轴的交点，可以得到通道的反转电位Vrev。反转电位也就是虽然通道开放，也没有电流流经该通道的跨膜电压值，说明此时离子通过通道的驱动力为零。反转电位可以反映通透的是什么离子。如果是某个通过单一离子的通道，反转电位就是该离子的平衡电位。 46电阻：电阻：47One result from patch clampstudies was the finding that ion channels conduct currentsin an all or nothing fashion484950-90-80-70-60-50-40-30-20-1010203040-125-100-75-
13、50-252550TE Cells/nicotine response(NYSTATIN/KF)7/7/00-90-80-70-60-50-40-30-20-1010203040-125-100-75-50-252550Current (response in mm)Holding Potential(mV)51离子通道是药物作用的靶点离子通道是药物作用的靶点例如例如: Ca: Ca+- -拮抗剂拮抗剂 对对 照照 尼 群 地 平525. 数据分析数据分析53Patchmaster/Pulse软件面板54基本采集软件Pulse/XChart55基本分析软件PulseFit56Pulse系列软件
14、中的online analysis57膜片钳技术的主要应用1. 1. 在心脏电生理研究中的应用：在心脏电生理研究中的应用： 膜片钳技术可以用来分析心肌静膜片钳技术可以用来分析心肌静息电位及其自发去极化的机制，对钠、息电位及其自发去极化的机制，对钠、钾、钙和乙酰胆碱通道的调控机制进行钾、钙和乙酰胆碱通道的调控机制进行更深入的了解。此外，膜片钳技术也可更深入的了解。此外，膜片钳技术也可以用来分析心脏在病理状态下引起通道以用来分析心脏在病理状态下引起通道活性和受体功能改变的机理，从而可以活性和受体功能改变的机理，从而可以从根本上对各种心脏病进行诊断和治疗。从根本上对各种心脏病进行诊断和治疗。58膜片
15、钳技术的主要应用2. 2. 在血管研究中的应用：在血管研究中的应用： 小动脉的平滑肌张力对外周血管阻小动脉的平滑肌张力对外周血管阻抗及血压起着决定性作用，而动脉平滑抗及血压起着决定性作用，而动脉平滑肌细胞上膜电位是动脉张力及动脉直径肌细胞上膜电位是动脉张力及动脉直径的主要调节者。使用膜片钳技术可以对的主要调节者。使用膜片钳技术可以对平滑肌膜电位进行监控和分析，得到其平滑肌膜电位进行监控和分析，得到其活动的详细机理。活动的详细机理。59膜片钳技术的应用膜片钳技术的应用l 离子通道动力学性质的研究离子通道动力学性质的研究l 泵功能的分析泵功能的分析l 受体性质分析受体性质分析l 细胞的胞吐与胞吞功
16、能测定细胞的胞吐与胞吞功能测定l 细胞内钙测定与膜片钳的结合细胞内钙测定与膜片钳的结合l 分子生物学与膜片钳的结合分子生物学与膜片钳的结合 l 其它其它60离子通道动力学性质的研究离子通道动力学性质的研究（以海马脑片全细胞记录模式为例）（以海马脑片全细胞记录模式为例）IA currents2nA20msNa+ currentsIK currentsVh=- 80mV 40mV-60mVl 电压门控性电压门控性全细胞电流全细胞电流612nA10ms-50mVConditioning pulsesTesting pulsesVh =-90mVl 钠 通 道 的 失 活钠 通 道 的 失 活622n
17、A20ms-50mVVh= -90mVl 钠通道失活后的恢复钠通道失活后的恢复63 电压门控性电压门控性IK电流电流5ms2nA6450ms1nAVh= -70mV70mV-50mV70mV60mV50mV 电 压 门 控 性电 压 门 控 性 钙 电 流钙 电 流65细胞内钙测定与膜片钳的结合细胞内钙测定与膜片钳的结合 采用钙荧光测定技术和膜片钳技术同采用钙荧光测定技术和膜片钳技术同时进行的手段，可实时地监测单一细胞内时进行的手段，可实时地监测单一细胞内游离钙浓度的变化与通道电现象变化的对游离钙浓度的变化与通道电现象变化的对应关系。应关系。6667A-F：胞内钙与胞内钙与sEPSC频率的对应
18、情况。频率的对应情况。G(彩图彩图)：在没有突触后在没有突触后膜的情况下，突触前末膜的情况下，突触前末梢内胞内钙的荧光变化。梢内胞内钙的荧光变化。烟碱能增加钙荧光强度。烟碱能增加钙荧光强度。下图：下图：mEPSC对照对照烟碱烟碱恢复恢复烟碱烟碱对照对照68分子生物学与膜片钳的结合分子生物学与膜片钳的结合 l 通道、受体等的异源性表达：应用最多通道、受体等的异源性表达：应用最多的就是爪蟾的卵母细胞。通过异源性表达的就是爪蟾的卵母细胞。通过异源性表达可对通道、受体等的结构与功能进行分析；可对通道、受体等的结构与功能进行分析；l 反义寡核苷酸技术的应用：可对通道或反义寡核苷酸技术的应用：可对通道或受体亚单位组成及功能进行鉴别。受体亚单位组成及功能进行鉴别。
