1、第二章第二章 基因工程操作的工具酶基因工程操作的工具酶2.1 基因工程工具酶基因工程工具酶1.工具酶的概念工具酶的概念2.限制性内切酶限制性内切酶3.DNA聚合酶聚合酶4 DNA连接酶连接酶5.碱性磷酸酶碱性磷酸酶6 末端转移酶末端转移酶7 核酸酶核酸酶S18 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶1.工具酶的概念工具酶的概念应用与基因工程的各种酶的总称应用与基因工程的各种酶的总称.切切:连连:修饰修饰:主要从细菌中分离得到，核酸水解酶。酶识主要从细菌中分离得到，核酸水解酶。酶识别特定的核苷酸顺序，但在细菌本身的别特定的核苷酸顺序，但在细菌本身的DNA中，这些顺序已被甲基化修饰，因而中，这些顺序已被甲基
2、化修饰，因而不被水解；这些酶仅限于水解外源不被水解；这些酶仅限于水解外源DNA以以保护自身，故称之为保护自身，故称之为“限制性限制性”酶。酶。以内切方式水解以内切方式水解DNA，产物的，产物的5为为p， 3 为为OH。Luria和和Human发现：发现：K噬菌体噬菌体 -EcoliB噬菌体噬菌体- Ecoli广泛存在于原核细菌广泛存在于原核细菌 。由宿主控制的对外源由宿主控制的对外源DNA的限制的限制(restriction)和对内源和对内源DNA的修饰的修饰(modification)现象称现象称为宿主细胞的为宿主细胞的限制和修饰限制和修饰作用。作用。作用：作用：一：保护自身一：保护自身DN
3、A不受限制；不受限制；二：破坏入侵的外源二：破坏入侵的外源DNA，使之降解。，使之降解。 Smith和和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特异性的切割种酶，能够特异性的切割DNA，这个酶被，这个酶被命名为命名为Hind I,这是第一个分离到的限制性这是第一个分离到的限制性内切核酸酶。内切核酸酶。指限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别指限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链双链DNA分子中的某种特定核酸序列，并由分子中的某种特定核酸序列，并由此切割此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切双链结构的酶统称为限制性内切酶。酶。根据限制性内切酶的识别顺序与切割
4、位置是根据限制性内切酶的识别顺序与切割位置是否一致，将它们分成三类。否一致，将它们分成三类。 型型限制性内切酶：型型限制性内切酶： 型限制性内切酶：型限制性内切酶： 型限制性内切酶：型限制性内切酶：I型限制性核酸内切酶具有核酸内切酶、甲基化型限制性核酸内切酶具有核酸内切酶、甲基化酶、酶、ATP酶和酶和DNA解旋酶四种活性，其切割解旋酶四种活性，其切割作用是作用是随机随机进行的，一般在距离识别位点上进行的，一般在距离识别位点上千碱基对以外的随机位置上切割，千碱基对以外的随机位置上切割，不产生特不产生特异片段。异片段。 型限制性核酸内切酶是由两个亚基组成的蛋白型限制性核酸内切酶是由两个亚基组成的蛋
5、白质复合物，具有限制与修饰双重作用。质复合物，具有限制与修饰双重作用。切割位点则在识别序列一侧的若干碱基对处，切割位点则在识别序列一侧的若干碱基对处，无无序列特异性，只与识别位点的距离有关序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且，而且不同酶的这一距离不同不同酶的这一距离不同 。 型限制性内切酶：型限制性内切酶：3个基本的特征：个基本的特征：在在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子；识别序列的碱基数一般为分子；识别序列的碱基数一般为4、6、8个个bp,识别位点经常是一种回文序列的识别位点经常是一种回文序列的DNA.限制性酶的识别序列一般为限制性酶的识别
6、序列一般为48个核苷个核苷酸，这些序列大多呈回纹结构。酸，这些序列大多呈回纹结构。Eco R识别识别6个核苷酸序列，在特定的个核苷酸序列，在特定的G-A之间切割之间切割DNA分子。分子。 5 GA A- T T C 3 3 C T T A AG 5 Pst 酶切酶切5 C T G CAG 3 3 GAC GT C 5 Sma酶切酶切5 C C C GG G 3 3 G GG C C C 5 Bal酶切识别酶切识别6个核苷酸的序列，在特定的个核苷酸的序列，在特定的G-C之间切割之间切割DNA分子：分子：5 T G G CC A 3 3 G AC GG T 5 2个单链断裂部位在个单链断裂部位在D
7、NA分子上的分布通分子上的分布通常不是彼此直接相对的；常不是彼此直接相对的；Pst 酶切酶切5 C T G CAG 3 3 GAC GT C 5 断裂结果形成的断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的片段往往具有互补的单链延伸末端。单链延伸末端。EcoR：5 GA A- T T C 3 3 C T T A AG 5 按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：其后再按发
8、现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌从流感嗜血杆菌d株（株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到）中先后分离到3 种限制酶，种限制酶， 则则分别命名为分别命名为Hind、Hind和和Hind。常见的限制性内切酶常见的限制性内切酶限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点EcoR GAATTCHind GTPyPuACHind AAGCTTBsuR I GGCCPst CTGCAGSma CCCGGGXba TCTAGAXho CTCGAGBamH GGATCCNot GCGGCCGC 5 GAATTC-3 EcoRI G AATTC 5 粘端 3 CTTAAG-5
9、CTTAA G 5 CTC GAG-3 Pst I CTCGA G 3 GAG CTC-5 G AGCTC 3 粘端 5 CCC GGG-3 Sma I CCC GGG 平末端 3 GGG CCC-5 GGG CCC a、粘性末端互补 -CTCGAAGCTTGTTC- - GGCAAGCTTACT- -GAGCTTCGAACAAG- - CCGTTCGAATGA HindIII酶解 HindIII酶解 -CTCGA- - AGCTTGTTC- - GGCA- - AGCTTACT- -GAGCTTCGA- -ACAAG- - CCGTTCGA- - ATGA- 混合退火 -G G C A A
10、G C T T G T T C- -C C G T T C G A A C A A G- 切口 -AAGCTT- -TCTAGA- -TTCGAA- - AGATCT HindIII Xba I -A CTAGA- -TTCGA T Klenow酶填补 -AAG CTAGA- -TTCGA TCT- - A A G C T A G A - - T T C G A T C T - -AAGCCCGGGTCG- - GGAGGTTAACCT- -TTCGGGCCCAGC- - CCTCCAATTGGA SmaI酶切AAGCCC-OH P-GGGTCG- - GGAGGTT-OH P-AACCTTT
11、CGGG-P OH-CCCAGC- - CCTCCAA-P OH-TTGGA- 混合退火 OH P -GGAGGTT GGGTCG- -CC TCCAA CCCAGC1.同位酶：具有相同的识别序列，但是酶切位同位酶：具有相同的识别序列，但是酶切位点不同。点不同。SmaI(CCCGGG)和和XmaI (CCCGGG),识别识别序列相同，但切割位点不同，前者产生平头序列相同，但切割位点不同，前者产生平头末端，后者产生黏性末端它们是一对同位酶。末端，后者产生黏性末端它们是一对同位酶。 2.同尾酶：具有不同的识别序列，但是酶切产同尾酶：具有不同的识别序列，但是酶切产物有相同的末端结构。物有相同的末端结
12、构。如如BamH I(5-GGATCC-3)与与Bgl(5-AGATCT-3)的酶切片段可以彼此连接起来的酶切片段可以彼此连接起来 。3.同裂酶：来自不同物种，但是识别序列和同裂酶：来自不同物种，但是识别序列和酶切位点均相同。酶切位点均相同。 例如：例如： Hpa5-GTTAAC-3；Hinc酶切酶切GTYRAC高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端极端pH值等，值等， 会使一些核酸内切酶的识别会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的星活和切割序列发生低特异性，即所谓的星活性（性（Star activity）现象）现象.EcoR I在正
13、常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也）时，也可切割可切割5PuPuATPyPy3或者或者5AATT3大肠杆菌中的甲基化酶大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶甲基化酶: 可在可在5 GATC3序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。位置上引入甲基。 dcm甲基化酶甲基化酶 此酶在序列此酶在序列5CCAGG3或或5CCTGG3中的胞嘧啶中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoR II。 3腺嘌呤脱氧核苷酸(3 d AMP )HOHO-POCH2OOHHHN
14、H2NHNNCHN9HONONHCCH3NH25胞嘧啶核苷酸(5 CMP )HOHO-POCH2OO-HHOHOH甲基化酶在基因工程中用途甲基化酶在基因工程中用途: 许多许多II类限制性内切酶，都存在着相对类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。而使其免受切割。 在合适的温度和缓冲液中，在在合适的温度和缓冲液中，在20l反应体系反应体系中，中，1 h完全降解完全降解1gDNA所需要的酶量，所需要的酶量，称为一个单位的限制性核酸内切酶。称为一个单位的
15、限制性核酸内切酶。 酶过量可导致识别序列的特异性下降酶过量可导致识别序列的特异性下降 。 1浓缩的酶液要稀释（不能用水）浓缩的酶液要稀释（不能用水）2 低温保存低温保存一一20稳定保存稳定保存 (1).DNA的纯度的纯度 。 DNA制剂中的其他杂质，如蛋白质、酚、氯仿、制剂中的其他杂质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠酒精、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠(SDS)以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制限制性以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制限制性核酸内切酶的活性。核酸内切酶的活性。 (2).DNA的甲基化程度的甲基化程度 。内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列内切酶不能够切割甲基
16、化的核苷酸序列 。通常使用丧失了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质通常使用丧失了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒粒DNA。 若要使用合成的衔接物修饰若要使用合成的衔接物修饰DNA片段的末端，片段的末端，被酶切之前，通过甲基化将内部的限制酶识别被酶切之前，通过甲基化将内部的限制酶识别位点保护起来。位点保护起来。（3）酶切反应的温度）酶切反应的温度 。大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度是大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度是37，但，但 Sma是25，ApaI是30 （4）DNA的分子结构。的分子结构。超螺旋的质粒超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线所需要的酶量要比消化线性的性的DNA高达高达20倍
17、倍 。（5）限制性核酸内切酶的缓冲液。）限制性核酸内切酶的缓冲液。标准缓冲液的组分包括：标准缓冲液的组分包括：氯化镁、氯化钠或氯化钾、氯化镁、氯化钠或氯化钾、TrisHCl、一一巯基乙醇或二硫苏糖醇巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白以及牛血清白蛋白蛋白(BSA)等。等。酶活性需要酶活性需要2价阳离子，通常是价阳离子，通常是Mg2+。分为两类：分为两类：依赖于依赖于DNA的的DNA聚合酶，包括大肠杆菌聚合酶，包括大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（全酶）、大肠杆菌（全酶）、大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶I的的Klenow大片段酶、大片段酶、T4 DNA聚合酶、聚合酶、T7DNA聚合酶和耐高温的聚合
18、酶和耐高温的DNA聚合酶等。聚合酶等。依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶，有逆转录酶。聚合酶，有逆转录酶。 (1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：也称为也称为Kronberg酶，是酶，是Kronberg等等1956年发年发现的第一个现的第一个DNA聚合酶。聚合酶。 具有三种酶活性a、5 -3DNA聚合酶活性CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCTGGCTATCGGA Mg2+ dNTP GGCTATCGGAb、3 -5 外切酶活性CGCATCG-OH E.coli DNA pol I CGC ATCGGCG Mg2+ dNTP G
19、CG校正作用。校正作用。c、5 -3外切酶活性CGCATTAG E.coli DNA pol I CATTAGGCGTAATC Mg2+ GCGTAATC(2).Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，Klenow片段或K1enow聚合酶。只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5 -3外切酶活性。具有具有53聚合酶活性；聚合酶活性；35外切酶活性。外切酶活性。 Klenow酶的基本用途：酶的基本用途：a.补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5粘性末端粘性末端b.DNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记c.cDNA第二链的合成第二链的合成d.双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DN
20、A序列序列是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有5- 3聚合酶活性和35外切酶活性，需要Mg2+作辅助因子，该酶最适反应温度为7580。主要用途是进行PCR反应。(4) 逆转录酶（依赖于逆转录酶（依赖于RNA的的DNA聚合酶）聚合酶）AMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒）逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒） ,M-MLV逆转录酶（逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒）。鼠白血病病毒）。AMV逆转录酶反应的最适温度为逆转录酶反应的最适温度为4145，最，最适适pH为为8.3。 主要作用是将主要作用是将mRNA反转录成反转录成cDNAa.DNA聚合酶活性聚合酶活性b.RNase H活性活
21、性（特异地降解（特异地降解DNA:RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链链 ） c.DNA内切酶活性内切酶活性d.DNA指导的指导的DNA聚合活性聚合活性来源于来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，噬菌体感染的大肠杆菌，具有：具有：53聚合酶活性聚合酶活性 35外切酶活性，外切酶活性， 外切酶活性对单链外切酶活性对单链DNA的作用比对双链的作用比对双链DNA更强。更强。 外切酶活性比外切酶活性比Klenow酶高酶高1001 000倍。倍。 可以补平或标记带可以补平或标记带3凹陷末端的凹陷末端的DNA分子，分子，可进行平头末端或可进行平头末端或3突出末端的双链突出末端的双链DNA的的标记。标记。 持续
22、合成能力最强的酶。持续合成能力最强的酶。 具有很强的对单链和双链具有很强的对单链和双链DNA的的35外切外切酶活性酶活性. 主要用于催化大分子模板主要用于催化大分子模板(如如M13噬菌体噬菌体)的的引物延伸反应，它可以在同一引物模板上引物延伸反应，它可以在同一引物模板上有效地合成数千个核苷酸且不受二级结构有效地合成数千个核苷酸且不受二级结构的影响；的影响；测序酶是通过化学修饰对T7噬菌体DNA聚合酶进行改造的酶，去除T7噬菌体DNA聚合酶的35外切酶活性，保留聚合活性，具有很强的持续合成能力，是Sanger双脱氧链终止法测序的理想用酶 。1967年发现。年发现。两条两条DNA链之间形成磷酸二酯
23、键。链之间形成磷酸二酯键。DNA ligase.Ecoli和其他细菌：能源（和其他细菌：能源（NAD+).动物细胞及噬菌体：能源（动物细胞及噬菌体：能源（ATP).连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的端连接起来，使之成为一个完整的DNA分分子。子。(1). T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶 不受不受dNTP的抑制，催化的抑制，催化DNA片断的连接。片断的连接。(2). E.coli DNA连接酶连接酶 不能连接平端不能连接平端DNA,不能连接不能连接RNA。DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件Tris-HCl 50 -
24、100 mM ,pH 7.5MgCl2 10 mM,ATP 0.5 - 1 mM,DTT 5 mMVolume: 10 - 20 lT T:4 - 15 , 4 - 16 hr1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下,15 反反应应1 小时，完全连接小时，完全连接1 g -DNA（Hind III片段）所片段）所需的酶量需的酶量.平头双链平头双链DNA片段的连接操作片段的连接操作粘性末端的连接属于分子内部的连接粘性末端的连接属于分子内部的连接.平头末端的连接属于分子间的连接，反应速度慢平头末端的连接属于分子间的连接，反应速度慢.提高平头末端连接效率的方法包
25、括：提高平头末端连接效率的方法包括：a.加大连接酶用量加大连接酶用量.b.加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会撞机会c.加入加入10% PEG8000，促进大分子之间的有，促进大分子之间的有效作用效作用d.加入单价阳离子（加入单价阳离子（NaCl），最终浓度），最终浓度150-200 mM去除去除DNA或者或者RNA的的5磷酸，可防止自身环磷酸，可防止自身环化。化。 5pDNA 5OHDNA 5pRNA 5OHRNA分类：分类：（1）BAP(bacterial alkaline phosphatase） :细菌碱性磷酸酶，来源于大肠杆菌细菌碱性磷酸酶，
26、来源于大肠杆菌 。 活性高，但耐高温和去污剂，抑制其活性较难。活性高，但耐高温和去污剂，抑制其活性较难。（2）CIP（calf intestinal alkaline phosphatase ）:牛小肠碱性磷酸酶，来源于牛小肠碱性磷酸酶，来源于小牛肠小牛肠 。 蛋白酶蛋白酶K消化，消化，EDTA参与下，参与下，65加热加热1小时小时灭活。灭活。 碱性磷酸酶的主要用途有：碱性磷酸酶的主要用途有：（1）5末端标记前的处理；末端标记前的处理；（2）去除）去除DNA片段的片段的5磷酸基团，防止自身磷酸基团，防止自身连接；连接；分子量分子量60000D,在二价阳离子的作用下，催在二价阳离子的作用下，催化
27、化dNTP加于加于DNA分子的分子的3羟基端。羟基端。底物：底物： 带带3羟基端单链羟基端单链DNA或带或带3羟基突出端的羟基突出端的双链双链DNA。用途：用途：1.载体或者载体或者cDNA加同聚尾。加同聚尾。2 .标记标记DNA3末端。末端。S 1 核 酸 酶 的 基 本 特 性 ： 来 自 稻 谷 曲 霉 菌核 酸 酶 的 基 本 特 性 ： 来 自 稻 谷 曲 霉 菌（Aspergillus oryzae）水解单链核酸以及双链核酸中的单链区或单链末端，水解单链核酸以及双链核酸中的单链区或单链末端，产生产生5核苷酸和核苷酸和5末端为末端为p的寡核苷酸。的寡核苷酸。Zn2+必需必需,最适最适
28、pH范围为范围为4.0 - 4.3,需要需要NaCl 10 - 300 mM. 降解单链降解单链DNA的速度比降解双链的速度比降解双链DNA快快75000倍。倍。S1核酸酶核酸酶降解单链降解单链DNA或或RNA,产生带产生带5磷酸的单核磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。需要辅助因子苷酸或寡核苷酸。需要辅助因子Zn。用途：用途：(1) 去除去除DNA片断中突出的单链尾以产生平端。片断中突出的单链尾以产生平端。(2) 打开双链打开双链cDNA合成中产生的发夹。合成中产生的发夹。带切口的双链带切口的双链DNAS1核酸酶核酸酶8 .T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶催化催化ATP的的-磷酸基团转移到磷酸
29、基团转移到DNA或或RNA的的5末端。末端。来源于来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。已在多噬菌体感染的大肠杆菌细胞。已在多种哺乳动物细胞中发现了多核苷酸激酶。种哺乳动物细胞中发现了多核苷酸激酶。 用途：用途：1 .标记标记DNA或或RNA5末端。末端。2.对缺乏对缺乏5磷酸基团的磷酸基团的DNA进行磷酸化或者进行磷酸化或者合成接头进行磷酸化。合成接头进行磷酸化。 从牛胰中分离到的内切酶，水解双链从牛胰中分离到的内切酶，水解双链DNA比单链比单链DNA迅速，随着反应进行，双链底迅速，随着反应进行，双链底物减少，单链浓度增加，反应自动减速。物减少，单链浓度增加，反应自动减速。 酶反应的最适酶反应
30、的最适pH在在7左右，左右，Mg2+、 Mn 2+和和 Co2+是激活剂。是激活剂。特异攻击特异攻击RNA上嘧啶残基的上嘧啶残基的3端，切割与相端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。邻核苷酸形成的磷酸二酯键。举例：举例：5pApGpCpCpGpApApUpGpCpApG3 5pApGpCp? 5pApGpCpCpGpApApUpGpCpApG3 5pApGpCpCp GpApApUp GpCp ApGRNaseU2的碱基专一性与的碱基专一性与RNase A互补，特互补，特异水解异水解RNA链中嘌呤核苷酸的链中嘌呤核苷酸的3-磷酸基团磷酸基团与相邻核苷酸的与相邻核苷酸的5-OH之间的键，生成以之
31、间的键，生成以3-嘌呤核苷酸和以嘌呤核苷酸和以3-嘌呤核苷酸为末端的寡嘌呤核苷酸为末端的寡核苷酸。核苷酸。 一种内切核糖核酸酶。特异作用于鸟嘌呤核苷酸一种内切核糖核酸酶。特异作用于鸟嘌呤核苷酸3端磷酸并切断相连的磷酸二酯键。端磷酸并切断相连的磷酸二酯键。举例：举例：5pApGpGpCpCpGpApApGpUpGpCpApGpC 5pApGp Gp ?5pApGpGpCpCpGpApApGpUpGpCpApGpC 5pApGp Gp CpCpGp ApApGp UpGp CpApGp C1 1 工具酶工具酶2 2 限制性内切酶限制性内切酶3 3 聚合酶聚合酶连接酶连接酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶末端转
32、移酶末端转移酶核酸酶核酸酶S1S1T4T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶1.给你一种给你一种mRNA,按适当顺序列出从按适当顺序列出从mRNA 的的cDNA克隆到表达载体你所运用到的所克隆到表达载体你所运用到的所有酶？有酶？ 答案：答案：(1) 逆转录酶逆转录酶 (2)DNA聚合酶聚合酶 (3)S1核酸酶核酸酶 （4）限制性内切酶）限制性内切酶 (末端核苷酸转移酶）末端核苷酸转移酶） (5) DNA连接酶连接酶1 什么是限制修饰？什么是限制修饰？2 在基因工程中应用最广泛的是在基因工程中应用最广泛的是 型限制性型限制性内切酶。内切酶。 3 Eco R 的识别切割序列是：的识别切割序列是： 。4 具有相同的识别序列，相同的酶切位点的具有相同的识别序列，相同的酶切位点的酶叫酶叫 。5 浓缩的酶液可以用水稀释。（浓缩的酶液可以用水稀释。（ ）6 酶切反应的温度是酶切反应的温度是37。（。（ ）7 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶是聚合酶是 。8.防止防止DNA自身环化的酶是自身环化的酶是 。9 能够在能够在DNA分子的分子的3羟基端加羟基端加dNTP的酶的酶是是 。
