1、食品安全检验技术食品安全检验技术实验实验 课程简介：课程简介： 食品安全检验技术食品安全检验技术面向面向“食品质量与安全食品质量与安全”专业专业本科生，主要介绍食品中危害残留物质的检验。本实验课程本科生，主要介绍食品中危害残留物质的检验。本实验课程为该课程的实验教学环节，要求学生能根据检验内容选择合为该课程的实验教学环节，要求学生能根据检验内容选择合适的分析方法，根据检测结果对食品安全性进行评价。共有适的分析方法，根据检测结果对食品安全性进行评价。共有学时数学时数2020学时，实验教学内容包括：学时，实验教学内容包括：“蔬菜中有机磷和氨基蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的生物化学测定甲酸酯类农药
2、的生物化学测定”等。实验教学中包括技能型等。实验教学中包括技能型和综合型实验环节，以提高学生的安全检测操作能力和综合和综合型实验环节，以提高学生的安全检测操作能力和综合应用能力。应用能力。u实验一实验一 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的生物化学法蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的生物化学法测定（综合型）测定（综合型）u实验二实验二 对虾中氯霉素含量的酶联免疫吸附试验法检测对虾中氯霉素含量的酶联免疫吸附试验法检测（技能型）（技能型）u实验三实验三 鱼体中组胺含量的分光光度法检测鱼体中组胺含量的分光光度法检测 （技能型）（技能型）u实验四实验四 饮料中食用合成着色剂的测定（设计型）饮料中食用合成着色
3、剂的测定（设计型）目目 录录【实验目的【实验目的】p 通过实验进一步掌握蔬菜中农药残留量生物通过实验进一步掌握蔬菜中农药残留量生物化学法测定的基本原理和实验方法，比较两种常化学法测定的基本原理和实验方法，比较两种常见的生物化学测定法，酶抑制率法和速测卡法的见的生物化学测定法，酶抑制率法和速测卡法的异同；培养学生综合运用理论知识，分析和解决异同；培养学生综合运用理论知识，分析和解决问题的能力。问题的能力。 实验一实验一 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的生物化学法测定的生物化学法测定【实验原理【实验原理】p 生物化学测定方法根据其检测手段又可分为速测卡法和酶生物化学测
4、定方法根据其检测手段又可分为速测卡法和酶抑制率法。速测卡法的原理是根据胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯抑制率法。速测卡法的原理是根据胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸和靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸酯类（红色）水解为乙酸和靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化水解、变色的过程发生改农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药变，由此可判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。的存在。p 酶抑制率法的原理是在一定条件下，有机磷或氨基甲酸酯酶抑制率法的原理是在一定条件下，有机磷或氨基甲酸酯类农药对
5、胆碱酯酶有抑制作用，其有抑制率与农药的浓度呈正类农药对胆碱酯酶有抑制作用，其有抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下酶催化乙酰胆碱水解生成胆碱，胆碱在显色相关。正常情况下酶催化乙酰胆碱水解生成胆碱，胆碱在显色剂的作用下产生黄色物质，该黄色在剂的作用下产生黄色物质，该黄色在412nm处有特征吸收峰，处有特征吸收峰，用可见分光光度计或农药残毒快速检测仪进行测定用可见分光光度计或农药残毒快速检测仪进行测定。 【实验步骤【实验步骤】1、速测卡法（纸片法）检测、速测卡法（纸片法）检测 滴滴23滴洗脱液在菜叶正面近叶尖部分，用另一片菜滴洗脱液在菜叶正面近叶尖部分，用另一片菜叶滴叶处轻轻摩擦。叶滴叶处轻轻摩
6、擦。 取一片速测卡，将菜叶上洗出的水滴取一片速测卡，将菜叶上洗出的水滴1滴在白色药片滴在白色药片上，静置上，静置10min。 将速测卡对折，用手捏将速测卡对折，用手捏3min。 打开速测卡，白色药片变蓝色为正常反应，不变蓝或打开速测卡，白色药片变蓝色为正常反应，不变蓝或显淡蓝色说明有过量有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。显淡蓝色说明有过量有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。每批同时做一片无农药对照。每批同时做一片无农药对照。【实验步骤【实验步骤】2、酶抑制率法检测、酶抑制率法检测 取取2g切碎样本，置提取瓶内，加入切碎样本，置提取瓶内，加入20mL提取试剂，提取试剂，震荡震荡12min；倒出上清液，静置
7、；倒出上清液，静置35min。于平底小试。于平底小试管中加入管中加入50L酶液、酶液、3mL样品提取液、样品提取液、50L显色剂，在显色剂，在3738下培养下培养30min。 于待测的小试管内加入于待测的小试管内加入50L底物，倒入比色杯内，进底物，倒入比色杯内，进行仪器测定。同时做对照组（对照组的平底小试管中用行仪器测定。同时做对照组（对照组的平底小试管中用3mL提取试剂代替样本提取液）。提取试剂代替样本提取液）。【注意事项【注意事项】1、速测卡法检测中，当温度低于、速测卡法检测中，当温度低于37时，酶反应的速度随之放时，酶反应的速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间应相对延长。延长时间的确
8、定，慢，药片加液后放置反应的时间应相对延长。延长时间的确定，应以空白对照卡用手指捏应以空白对照卡用手指捏3min时可以变蓝。时可以变蓝。2、速测卡法检测中，预反应后药片表面必须保持润湿。、速测卡法检测中，预反应后药片表面必须保持润湿。3、采用酶抑制率法测定韭菜、生姜、葱、蒜、辣椒、胡萝卜等、采用酶抑制率法测定韭菜、生姜、葱、蒜、辣椒、胡萝卜等蔬菜中农药时，不要剪得太碎，浸提时间不能太长，对于这类蔬菜中农药时，不要剪得太碎，浸提时间不能太长，对于这类蔬菜必要时可采取整株浸提。一些叶绿素含量较高的蔬菜也是蔬菜必要时可采取整株浸提。一些叶绿素含量较高的蔬菜也是如此。如此。4、当温度条件低于、当温度条
9、件低于37时，加入酶液和显色剂后放置反应的时时，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应适当延长，延长时间的确定应以胆碱酯酶空白对照测试间应适当延长，延长时间的确定应以胆碱酯酶空白对照测试3min的吸光度变化的吸光度变化A0值在值在0.3以上，即可往下操作。以上，即可往下操作。5、当吸光度过大无法读取时，说明测定溶液浑浊有干扰。、当吸光度过大无法读取时，说明测定溶液浑浊有干扰。【实验目的【实验目的】p 进一步学习酶联免疫试验法的基本原理和实进一步学习酶联免疫试验法的基本原理和实验方法，确实掌握酶联免疫吸附试验法测定虾肉验方法，确实掌握酶联免疫吸附试验法测定虾肉中氯霉素含量的基本原理、实验方法和结果的
10、分中氯霉素含量的基本原理、实验方法和结果的分析。析。 实验二实验二 对虾中氯霉素含量的酶联免疫吸附对虾中氯霉素含量的酶联免疫吸附试验法检测试验法检测 【实验原理【实验原理】p 抗原与抗体能发生特异性的免疫化学反应。以竞争性抗原与抗体能发生特异性的免疫化学反应。以竞争性酶联免疫反应为例：酶标记抗原与样品或标准体中的非酶联免疫反应为例：酶标记抗原与样品或标准体中的非标记抗原（氯霉素）具有相同的与抗体结合的能力，两标记抗原（氯霉素）具有相同的与抗体结合的能力，两者竞争与固相载体包被的抗体结合反应。洗涤多余的酶者竞争与固相载体包被的抗体结合反应。洗涤多余的酶标抗原，加酶反应的底物后，底物被酶催化显色，
11、故可标抗原，加酶反应的底物后，底物被酶催化显色，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。在整个反应根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。在整个反应当中，样品中氯霉素含量越多，反应显色就越淡。反之，当中，样品中氯霉素含量越多，反应显色就越淡。反之，样品中氯霉素含量越少，则显色越深。样品中氯霉素含量越少，则显色越深。 【实验步骤【实验步骤】1、实验准备、实验准备 从冰箱取出试剂盒，将氯霉素标准溶液、浓缩萃取稀从冰箱取出试剂盒，将氯霉素标准溶液、浓缩萃取稀释液、浓缩洗涤液、酶标记物、底物溶液及微量测试孔释液、浓缩洗涤液、酶标记物、底物溶液及微量测试孔条置于室温下回温条置于室温下回温30min。 配
12、制原倍萃取稀释液及洗涤液：用蒸馏水将配制原倍萃取稀释液及洗涤液：用蒸馏水将10倍浓缩倍浓缩萃取稀释液及浓缩洗涤液都分别用蒸馏水按萃取稀释液及浓缩洗涤液都分别用蒸馏水按1:9的比例稀的比例稀释。释。 【实验步骤【实验步骤】2、样品制备、样品制备 将将3g对虾肉剪碎后放入对虾肉剪碎后放入50mL带塞离心管中，加入带塞离心管中，加入6mL乙酸乙酯，用均质机均质约乙酸乙酯，用均质机均质约1min，再震荡约，再震荡约30s。 离心（离心（3000rpm，10min），取），取2mL上清液至玻璃管上清液至玻璃管中，于中，于50下氮气吹干。下氮气吹干。 于上述玻璃管中加入正己烷于上述玻璃管中加入正己烷2mL
13、，先将残余物完全溶，先将残余物完全溶解后，再加入解后，再加入1mL原倍萃取稀释液，震荡约原倍萃取稀释液，震荡约30s。 离心（离心（3000rpm，10min），用吸管吸去上层液及中），用吸管吸去上层液及中间乳化层部分，弃掉，取下层液备用。间乳化层部分，弃掉，取下层液备用。【实验步骤【实验步骤】3、操作测定、操作测定 取一定的微量测试孔条，于适当微孔中分别加入取一定的微量测试孔条，于适当微孔中分别加入100L标标准溶液（六个浓度）。准溶液（六个浓度）。 在另外的微孔中加入在另外的微孔中加入100L已完成前处理的样品溶液已完成前处理的样品溶液 在每一微孔中加入在每一微孔中加入50L酶标记物。酶标
14、记物。 轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温下避光静置温育轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温下避光静置温育1h。 甩掉微孔中的反应液，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重甩掉微孔中的反应液，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗复洗3次，最后一次甩掉洗液后，在吸水纸上拍干。次，最后一次甩掉洗液后，在吸水纸上拍干。 于每一微孔中加入底物溶液于每一微孔中加入底物溶液100L后，轻敲盘子四周，使后，轻敲盘子四周，使其充分混合，室温下避光静置温育其充分混合，室温下避光静置温育20min。 于每一微孔中加入于每一微孔中加入100L反应终止液，用酶标仪于波长反应终止液，用酶标仪于波长450nm下判读。下判读。【注意事
15、项【注意事项】1、使用前先将试剂盒置于室温下，回温、使用前先将试剂盒置于室温下，回温30min。回温后，取。回温后，取出所需微量测试孔条，将剩余板条立即放回铝箔袋中用胶出所需微量测试孔条，将剩余板条立即放回铝箔袋中用胶带封好，置于带封好，置于4保存。保存。2、浓缩萃取稀释液和浓缩洗涤液使用前必须稀释。、浓缩萃取稀释液和浓缩洗涤液使用前必须稀释。3、每次吸取不同的液体时一定要换移液枪的吸头。、每次吸取不同的液体时一定要换移液枪的吸头。4、加样时必须小心勿溅出微孔外，以免造成其他微孔的污染，、加样时必须小心勿溅出微孔外，以免造成其他微孔的污染，加样品或试剂时枪头请勿接触微孔。加样品或试剂时枪头请勿
16、接触微孔。5、洗涤必须充分，重复、洗涤必须充分，重复3次。次。6、温育时，要盖上塑料片或标签纸，置于暗处，温育时间不、温育时，要盖上塑料片或标签纸，置于暗处，温育时间不够不要随意取出。够不要随意取出。7、试剂盒较贵且量很少，请准确量取，不要造成浪费。、试剂盒较贵且量很少，请准确量取，不要造成浪费。 【实验目的【实验目的】p 通过实验进一步学习并掌握分光光度法检测鱼肉中组通过实验进一步学习并掌握分光光度法检测鱼肉中组胺含量的实验原理和实验方法；培养学生分析和解决问胺含量的实验原理和实验方法；培养学生分析和解决问题的能力。题的能力。 实验三实验三 鱼体中组胺含量的分光光度鱼体中组胺含量的分光光度法
17、检测法检测 【实验目的【实验目的】p 鱼体中的组胺用正戊醇提取后，与偶氮试剂反应显橙鱼体中的组胺用正戊醇提取后，与偶氮试剂反应显橙色，与标准系列比较定量。最低检出浓度为色，与标准系列比较定量。最低检出浓度为5mg/100g。 【实验步骤【实验步骤】1、组胺标准曲线的制备、组胺标准曲线的制备2、样品中组胺的提取、样品中组胺的提取p 取取10g切碎的鱼肉于具塞锥形瓶中，加入切碎的鱼肉于具塞锥形瓶中，加入20mL三氯乙酸三氯乙酸（100g/L），），60水浴中浸泡水浴中浸泡30min，过滤。取，过滤。取2.0mL滤液于滤液于分液漏斗中，加氢氧化钠溶液（分液漏斗中，加氢氧化钠溶液（250g/L）使呈碱
18、性（）使呈碱性（pH 910）。加入）。加入3mL正戊醇，振摇正戊醇，振摇5min，提取三次。合并三次的，提取三次。合并三次的正戊醇提取液并用正戊醇定容至正戊醇提取液并用正戊醇定容至10.0mL。吸取。吸取2.0mL正戊醇正戊醇提取液于分液漏斗中，用盐酸（提取液于分液漏斗中，用盐酸（1:1）振摇提取）振摇提取3次，合并盐酸次，合并盐酸提取液并定容至提取液并定容至10.0mL，备用。，备用。 【实验步骤【实验步骤】3、样品中组胺的测定、样品中组胺的测定p 取取1.0mL盐酸提取液于盐酸提取液于10mL比色管中，加水至比色管中，加水至2mL；同时取同时取0.00、0.20、0.40、0.60、0.
19、80、1.00mL组胺标组胺标准使用液分别置于准使用液分别置于10mL比色管中，加水到比色管中，加水到1mL，再各加，再各加1mL盐酸（盐酸（1:1）；标准管与样品管各加）；标准管与样品管各加3mL碳酸钠溶液碳酸钠溶液（50g/L），），3mL偶氮试剂偶氮试剂，加水至加水至10.0mL，混匀，放，混匀，放置置10min后以零管调节零点，于后以零管调节零点，于480nm处测比色测定，处测比色测定，并绘制标准曲线。并绘制标准曲线。 【注意事项【注意事项】1、偶氮试剂必须临配现用。、偶氮试剂必须临配现用。2、用正戊醇提取三氯乙酸溶液中的组胺时，必须用氢氧、用正戊醇提取三氯乙酸溶液中的组胺时，必须用氢
20、氧化钠调节溶液化钠调节溶液pH值至碱性，使组胺游离便于提取；而值至碱性，使组胺游离便于提取；而在用盐酸（在用盐酸（1:1）提取时则必须使溶液呈酸性，使组胺）提取时则必须使溶液呈酸性，使组胺能成为盐酸盐而溶于盐酸提取液中。能成为盐酸盐而溶于盐酸提取液中。3、组胺测定过程中，标准管和测定各管的条件必须控制、组胺测定过程中，标准管和测定各管的条件必须控制一致，保证显色反应的稳定性和一致性。一致，保证显色反应的稳定性和一致性。4、组胺与偶氮试剂的反应须在弱碱性条件下进行，且反、组胺与偶氮试剂的反应须在弱碱性条件下进行，且反应时间控制应时间控制10min。【实验目的【实验目的】p 通过本实验，要求学生熟
21、悉在食品安全性检验过程中，通过本实验，要求学生熟悉在食品安全性检验过程中，综合运用所学理论知识进行实验设计的总体原则和基本综合运用所学理论知识进行实验设计的总体原则和基本方法；掌握薄层色谱方法；掌握薄层色谱分光光度法分离和测定合成着色分光光度法分离和测定合成着色剂的基本原理和实验方法；进一步了解我国食品添加剂剂的基本原理和实验方法；进一步了解我国食品添加剂使用标准对食用合成色素的规定以及我国饮料中添加剂使用标准对食用合成色素的规定以及我国饮料中添加剂的使用情况；培养学生的实验设计能力、独立分析和解的使用情况；培养学生的实验设计能力、独立分析和解决问题的能力以及综合运用知识的能力。决问题的能力以
22、及综合运用知识的能力。 实验四实验四 饮料中食用合成着色剂的测定饮料中食用合成着色剂的测定（设计型实验）（设计型实验） 【实验内容【实验内容】p 学生自主选择市售的各种饮料，根据所学的基础理论学生自主选择市售的各种饮料，根据所学的基础理论知识，结合现有的实验条件，通过查阅相关文献资料，知识，结合现有的实验条件，通过查阅相关文献资料，设计简易可行的实验方案，对饮料中苋菜红、胭脂红、设计简易可行的实验方案，对饮料中苋菜红、胭脂红、柠檬黄、日落黄及亮蓝柠檬黄、日落黄及亮蓝5种食用合成着色剂进行提取、分种食用合成着色剂进行提取、分离以及定性和定量检测。根据我国食品添加剂使用卫生离以及定性和定量检测。根
23、据我国食品添加剂使用卫生标准，对市售饮料中合成着色剂的使用情况进行评价和标准，对市售饮料中合成着色剂的使用情况进行评价和比较。比较。 【实验要求【实验要求】p 本实验要求学生有目的地选择市售饮料（每组至少选本实验要求学生有目的地选择市售饮料（每组至少选择三种，每班至少选择择三种，每班至少选择20种），根据所选饮料的性质和种），根据所选饮料的性质和实验项目要求独立设计实验、准备和完成实验并对实验实验项目要求独立设计实验、准备和完成实验并对实验结果进行分析和讨论；每组提供完整的实验报告一份，结果进行分析和讨论；每组提供完整的实验报告一份，综合各组的实验结果，每班拟写一份湛江市售饮料中合综合各组的实
24、验结果，每班拟写一份湛江市售饮料中合成着色剂使用情况的调查报告。成着色剂使用情况的调查报告。【实验思考题【实验思考题】1、提取分离食用合成着色剂的基本原理是什么？、提取分离食用合成着色剂的基本原理是什么？2、样品前处理过程中吸附色素除了聚酰胺粉还有哪些材、样品前处理过程中吸附色素除了聚酰胺粉还有哪些材料可用？料可用？3、薄层色谱法分离检测合成着色剂的基本原理是什么？、薄层色谱法分离检测合成着色剂的基本原理是什么？4、影响薄层色谱、影响薄层色谱分光光度法检测食用合成着色剂含量分光光度法检测食用合成着色剂含量的因素主要有哪些？如何降低其影响？的因素主要有哪些？如何降低其影响？5、食用合成着色剂混合物的分离方法除薄层色谱法之外、食用合成着色剂混合物的分离方法除薄层色谱法之外还有哪些？试简述其基本原理还有哪些？试简述其基本原理 。
