1、植物基因工程植物基因工程第二章 分子克隆常用工具酶 Tel: 87286939 Office: 园林楼园林楼6202 每一单链具有每一单链具有 5 5-3-3极性极性 两条单链间以氢键连接两条单链间以氢键连接 两条单链，极性相反，反向平行两条单链，极性相反，反向平行 以中心为轴，向右盘旋以中心为轴，向右盘旋Structure and featuresDNA 的基本结构的基本结构34Replication5分子克隆操作过程： 克隆目的基因将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成重组DNA导入宿主细胞筛选、鉴定扩增和表达。6 工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关
2、的各种酶系统称为工具酶。 要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来，需 要 各 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶 （ r e s t r i c t i o n endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要 DNA 聚合酶（polymerase）等。 因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。78 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNADNA连接酶连接酶 DNADNA聚合酶聚合酶 核酸酶核酸酶 核酸修饰酶核酸修饰酶用于核酸操作的常用工具酶用于核酸操作的常用工具酶910常用的工具酶性质及功能11第一节第一节 分子
3、克隆最常用两个工具酶分子克隆最常用两个工具酶 12限制性内切酶限制性内切酶 Restriction enzymes 13 限制性内切酶是一种能识别 DNA 上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一种内切核酸酶。1415二、二、 限制性核酸内切酶的命名原则限制性核酸内切酶的命名原则 16 一般分子量为一般分子量为60kd60kd，单链多肽，最适，单链多肽，最适 pH pH 为为 6 68 8 NaCl NaCl有抑制作用，能被有抑制作用，能被Mg2+Mg2+激活，巯基有保护作用激活，巯基有保护作用 对热不稳定，通常贮存于对热不稳定，通常贮存于2020环境。为避免反复
4、环境。为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有冻溶使酶失活，商品酶均含有5050甘油，使用时添加甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。三、限制性核酸内切酶学特性三、限制性核酸内切酶学特性17 它对底物要求有特异它对底物要求有特异的序列，通常的识别序列的序列，通常的识别序列是是4 bp 6bp，有些则，有些则为为7bp8bp，甚或多于，甚或多于8bp。 多数限制酶的识别序多数限制酶的识别序列为回文结构，在识别序列为回文结构，在识别序列内或其附近水解列内或其附近水解DNA链链中的磷酸二酯键。中的磷酸二酯键。1819202122232425
5、温度：一般温度：一般3737 盐离子浓度：盐离子浓度：NaNa，Mg2Mg2 缓冲体系：具有稳定缓冲体系：具有稳定 pH pH 环境的环境的Tris-HClTris-HCl缓冲体系缓冲体系 DTTDTT用于保持酶用于保持酶 稳定性和活性稳定性和活性 反应体积和甘油浓度：反应体积和甘油浓度： 商品化的限制性内切核酸酶均加商品化的限制性内切核酸酶均加5050甘油作为保护剂，一般在甘油作为保护剂，一般在-20-20保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的1010，否则甘油浓度，否则甘油浓度过高，影响酶切反应过高，影响酶切反应 反应时间：通常为反应时
6、间：通常为1 1h h；进行大量进行大量DNADNA酶切反应时一般让酶解过夜酶切反应时一般让酶解过夜 DNADNA纯度和结构纯度和结构 DNADNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、样品中所含的蛋白质、有机溶剂、 RNARNA等杂质会影等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNADNA，DNADNA的甲基化位的甲基化位置会影响酶切反应。置会影响酶切反应。26II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系型限制性核酸内切酶酶解反应体系27Star activity “星星”活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度
7、、极端低离子强度、极端ppH值等，会使一些核酸内切值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。 在 名 称 右 上 角 加 一 个 星 号在 名 称 右 上 角 加 一 个 星 号 (*)表 示表 示 , 如如EcoR*：AATT ；EcoR：GAATTC 必须采用规范的实验步骤必须采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条应用推荐的反应条件。件。28位点偏爱（位点偏爱（site preference） 某些限制性内切酶对不同位置的某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割同一个识别序列表现出不同的切割效率。效率。29第
8、二节第二节 DNA连接酶连接酶 DNA Ligase30一、一、DNA连接酶性质连接酶性质 3132两种DNA连接酶比较 二、常用连接酶二、常用连接酶33三、三、DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件343536o直接用直接用T4 DNAT4 DNA连接酶连接：效率不高，较少采用。连接酶连接：效率不高，较少采用。o同聚物加尾连接平末端同聚物加尾连接平末端DNADNA片段：先用末端核苷酸转片段：先用末端核苷酸转移酶，给平末端移酶，给平末端DNADNA分子加上同聚物尾巴后再用分子加上同聚物尾巴后再用DNADNA连接酶进行连接连接酶进行连接o用衔接物连接平末端用衔接物连接平末端DNADNA分子：目的
9、是在平末端分子分子：目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNADNA连接连接373839四、重组四、重组DNA实验的一般程序实验的一般程序o选用一种对载体选用一种对载体DNADNA只具唯一限制识别位点的限制酶只具唯一限制识别位点的限制酶（如（如EcoR IEcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性作位点特异的切割，形成全长的具粘性末端的线性末端的线性DNADNA分子分子o再将外源再将外源DNADNA片段也用同一种酶作相同的消化。片段也用同一种酶作相
10、同的消化。o混合，加入混合，加入DNADNA连接酶。由于具有相同的（如连接酶。由于具有相同的（如EcoR IEcoR I）粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经DNADNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNADNA分子。分子。40第二节第二节 其他分子克隆工具酶其他分子克隆工具酶41o 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I Io K1enowK1enow片段片段o T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶o Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶o 逆转录酶逆转录酶：依赖于：依赖于RNARNA的的DNA
11、DNA聚合酶聚合酶o RNARNA聚合酶聚合酶4243基本用途基本用途44大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment) 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I经枯草杆菌蛋白酶处理经枯草杆菌蛋白酶处理, ,获得获得N N端三分之二的大肽段端三分之二的大肽段, ,即即Klenow Klenow 酶。酶。 Klenow Klenow 酶仍拥有酶仍拥有5353的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性和和3535的核酸外切酶活性，但失去了的核酸外切酶活性，但失去了5 35 3的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。 454647 有有35的核酸外切酶活性和的核酸外切酶活性和 53的的D
12、NA聚合酶活性。聚合酶活性。 在无在无dNTP时，可以从任何时，可以从任何 3-OH端外切端外切 T4 DNA T4 DNA 聚合酶聚合酶 (T4 phage DNA polymerase)48 基本用途基本用途49505152 反转录酶反转录酶(reverse transcriptase) 主要用途：转录主要用途：转录 mRNA mRNA 成为成为 cDNA cDNA 制备基因片段制备基因片段53双向外切双向外切DNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNA链链5455 功能：功能： 降解降解 ssDNA 或或 ssRNA 形成形成 5-磷酸末端的磷酸末端的单或寡核苷酸片段。单或寡核苷酸片段。56
13、应用：应用： 分析分析DNADNA：RNARNA杂交体结构（杂交体结构（S1 mappingS1 mapping）。确定内）。确定内含子部位。含子部位。 切除切除DNADNA片段上的单链末端，形成平末端片段上的单链末端，形成平末端. . 切开切开 cDNA cDNA 合成过程中形成的发夹环合成过程中形成的发夹环 在限制酶位点上产生小缺失在限制酶位点上产生小缺失5758RNase-Free DNase 是一种DNase I（核酸内切酶）， 可以降解双链或单链 DNA。RNase H： 特异性地水解杂交到 DNA 链上的 RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单
14、链或双链DNA。 RNase A：广泛应用的核酸内切酶。对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。Rnase 酶非常稳定，常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。 DEPC 处理。59 功能：催化去除功能：催化去除 DNA、RNA 上的上的 5 端磷酸端磷酸基团基团, 从从DNA片段上除去片段上除去5磷酸以防自身连磷酸以防自身连接。接。 用途：在用途：在DNA连接之前常用它处理克隆载体连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接。以防止载体自身连接。60Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)61T4-多核苷酸磷酸激酶多核
15、苷酸磷酸激酶6263功能：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，功能：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，沿着沿着55到到 3 3加到加到 DNA DNA 链的链的 3 3- -OH OH 末端。该过程不末端。该过程不需要需要DNADNA模板，对双链、单链模板，对双链、单链 DNA DNA 都适用。经常用于人都适用。经常用于人工粘性末端的构建。工粘性末端的构建。 64原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。不被相应的限制酶所切割。 Dam 甲基化酶可在甲基化酶可在 GAmTC
16、 序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤 N6 位位置上引入甲基。受其影响的酶有置上引入甲基。受其影响的酶有Bccll II、MbbooII等。等。 Dcm 甲基化酶识别甲基化酶识别 CCmAGG 或或 CCmTGG 序列，序列，在第二个胞嘧啶在第二个胞嘧啶 C 的的 C5 位置上引入甲基。位置上引入甲基。受其影响的酶有EccooR IIII等6566思考题：思考题：u 载体构建的工具酶主要有那些类型？u 限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制与修饰。核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响其酶活性的因素。u T4 DNA连接酶的性质及用途.u Klenow 酶的基本性质及用途。u
17、 其他工具酶的用途。67练练 习习 题题681. 一种一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb HindIII 3kb 、7kb EcoRI/PstI 2、3、5kb PstI 10kb HindIII/PstI 1、3、6kb 将各限制酶位点绘制在将各限制酶位点绘制在DNA分子上。分子上。 2. 另一另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。分子上。 EcoRI 1、3、6kb EcoRI/HindIII
18、1、3kb HindIII 4、6kb EcoRI/PstI 1、3、5kb PstI 2、8kb HindIII/PstI 2、6kb 3.下图中的一段下图中的一段DNA分子上有两个限制酶分子上有两个限制酶PstI和和EcoRI识别位点，识别位点，两位点相距两位点相距10bp，现有一研究生要分析，现有一研究生要分析EcoRI右侧右侧500bp区域内区域内的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定区，他应如何设计此实验？假定EcoRIPstI间的间的10bp除去后并除去后并不影响任何结果分析，但不
19、影响任何结果分析，但PstI位点左侧的位点左侧的DNA不能除去不能除去 6910bp 500bp PstI EcoRI 4. 假如假如PstI位点为另一限制酶位点为另一限制酶HindIII，实验又该如何设计？，实验又该如何设计？ 5. 现有一研究者打算将一现有一研究者打算将一EcoRI DNA片段克隆到一个片段克隆到一个DNA分子分子的的 BamHI 位点以便位点以便 DNA 扩增，但扩增后的扩增，但扩增后的 DNA 分子又可用分子又可用BamHI 限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。 6. 一研究生要将一质粒（一研究生要将一质粒（pI）上的）上的B
20、amHI-HindIII片段取代另一片段取代另一质粒（质粒（pII）上的）上的BamHI-XbaI片段，所获重组质粒（片段，所获重组质粒（pIII）上）上的插入片段要求能用的插入片段要求能用BamHI-HindIII进行回收，问如何设计此进行回收，问如何设计此实验？实验？10bp 500bp HindIII EcoRI70 H Xb H5kb pI 1kb 6kb pII .5kb 6kb pIII 1kb B B B 7. 现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示：现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示： 已知已知HinHindIIIdIII克隆片段中的克隆片段
21、中的BamBamHIHI（3kb3kb）片段含有一完整的基）片段含有一完整的基因编码区，现要将此因编码区，现要将此3kb3kb的的BamBamHIHI片段克隆到另一表达载体片段克隆到另一表达载体pBpB的的BamBamHIHI位点，如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相位点，如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是相同的？同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是相同的？ HindIII PstIBamHI PstI BamHIBamHI HindIIIpA 8kb pB0.5 2.5718. 为了检测绿豆核酸酶对为了检测绿豆核酸酶对5-端突起的
22、单链端突起的单链DNA切割是否准确有效，切割是否准确有效，即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常精巧的实验，其中一个实验是将一精巧的实验，其中一个实验是将一XbaI片段插入片段插入pBR322的的Apr基因内的基因内的ScaI位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿豆位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿豆核酸酶的作用确实与预期的结果一致，你能否设计出这一套实验？核酸酶的作用确实与预期的结果一致，你能否设计出这一套实验？(pBR322除含有除含有Apr基因外，还含有基因外，还含有Tcr基因基因)。9. 某研究者计划
23、将具有限制酶某研究者计划将具有限制酶BamHI粘性末端结构的一段低聚核粘性末端结构的一段低聚核苷酸分子插入到一载体的克隆位点区。现假设他已获得具有低苷酸分子插入到一载体的克隆位点区。现假设他已获得具有低聚核苷酸插入的重组质粒，他应做什么实验来检查插入片段的聚核苷酸插入的重组质粒，他应做什么实验来检查插入片段的方向方向 ScaI XbaI片段片段 Tcr（当有外源（当有外源DNA插入，插入， 该基因失活）该基因失活） pBR322 AprTcr72图中字母代表的意义：图中字母代表的意义：N-NotI；Sp-SpeI；SI-SacI；Sf-SflI；H-HindIII；B-BamHI； Xb-Xb
24、aI；S-SalI；K-KpnI；E-EcoRIAprH SI B Xb S K EN Sp SI SfGATCC GG CCTAGpA 10. 一一DNA分子中有一个分子中有一个SmaI识别位点识别位点(CCCGGG), 现有一研究现有一研究生想要将这识别位点顺序完全除去生想要将这识别位点顺序完全除去,现已知该位点及两侧的序现已知该位点及两侧的序列为列为ACCCGGGT,他应该如何设计实验他应该如何设计实验? 11. 一研究者想在下列三种限制酶位点的一研究者想在下列三种限制酶位点的BamHI中插入另外一段中插入另外一段低聚核苷酸低聚核苷酸,该段低聚核苷酸中的限制酶位点如下所示该段低聚核苷酸中
25、的限制酶位点如下所示, 要求要求获得的重组获得的重组DNA分子的各种限制酶位点按一种方式排列分子的各种限制酶位点按一种方式排列, 他他应如何设计实验分离到所需的应如何设计实验分离到所需的DNA分子分子?73 EcoRI BamHI HindIII BamHI SmaI SacI EcoRI PstI BamHI + E B P E SI Sm B H 12. 如何使下列的限制酶识别位点由一种序列变为第二种如何使下列的限制酶识别位点由一种序列变为第二种, 或由第一或由第一种变为第三种种变为第三种? GATC GATATC GATCGATC； TCGA TCGCGA TCGCGCGCGA； Sau
26、3AI EcoRV ClaI TaqI REII BssHI AAGCTT AAGCGCTT HindIII ThaI，HaeII 13.下图的质粒载体中的四环素抗性基因内有一下图的质粒载体中的四环素抗性基因内有一BamHI位点位点, 一研究一研究者想用体外缺失或插入的办法使者想用体外缺失或插入的办法使BamHI位点消除位点消除, 并获得如图所并获得如图所示的重组质粒，他应如何设计此实验示的重组质粒，他应如何设计此实验? 假定密码子的增减对基假定密码子的增减对基因的抗性无任何影响。因的抗性无任何影响。 HindIIIEcoRIEcoRI EcoRIBamHIBamHI位点消除位点消除总长为总长为9kb0.5kbTcr
