1、生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程第五章 沉淀分离5.1 概述5.2 盐析法5.3 有机溶剂沉淀法5.4 非离子多聚物沉淀法5.5 其他沉淀法5.1 概述 沉淀的概念沉淀的概念 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相的过程的过程。在生物工业、有机化工工业、无机化工工业及实验室分析中，沉淀都是分离与纯化中最常用的方法之一。 沉淀： 溶质溶质固相固相5.1 概述 沉淀的作用沉淀的作用有二： 一是浓缩浓缩，通过沉淀目的产物由液相变成固相，浓缩倍数可达几十倍至数百倍； 二是纯化纯化，通过沉淀固液分相后，除去留在液相（如果目的产物是固相）或沉积在固相中（目的产物留在液
2、相）的杂质。 沉淀法操作步骤沉淀法操作步骤 ：首先加入沉淀剂；首先加入沉淀剂；沉淀剂的陈化，促进粒子生长；沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物。离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。5.1 概述 沉淀分离的应用沉淀分离的应用 沉淀分离具有成本低、收率高、浓缩倍数大和操作简单等优点，因而广泛应用于氨基酸、酶制剂、抗菌素等生物工业中。 对于某些不需纯度要求的生物产品（如工业用酶制剂），沉淀分离是一种常用提取方法提取方法。 但对于某些纯度要求很高的生物产品，在沉淀分离中，浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀分离通常作为初步分离初步分
3、离的一种方法。 5.1 概述 沉淀剂的选择 沉淀剂的作用是降低溶质的溶解度使之析出，除考虑沉淀效果外还需考虑下列因素：（1）沉淀剂对目的产物的结构与活性是否有破坏作用；（2）沉淀剂是否容易除去（离子交换、蒸发、萃取等）；（3）沉淀剂是否有毒性。5.1 概述 沉淀的分类：沉淀的分类：沉淀法有许多种，根据所用沉淀剂的不同，生物工业中常用的沉淀方法有如下几种： 盐析法盐析法：多用于蛋白质和酶的分离纯化。 有机溶剂法有机溶剂法：多用于生物小分子、多糖及核酸类产品的分离与纯化，有时也用于蛋白质和酶的沉淀。 等电点沉淀法等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其它方法结合
4、使用。5.1 概述 非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法：用于生物大分子，是发展很快的一种方法。 生成盐类复合物沉淀法生成盐类复合物沉淀法：用于多种化合物（其中主要是酸性或碱性化合物），其中小分子物质的沉淀应用较多。 选择变性沉淀法选择变性沉淀法：热变性或酸碱变性沉淀法，常用于除去某些不耐热及在一定pH值下易变性的杂蛋白。但应以在实验条件下所分离物质的活性不受影响为前提。5.2 盐析法 一般说来，所有固性溶质都可以在溶液中加所有固性溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出入中性盐而沉淀析出，这一过程称为盐析盐析。盐析法具有如下特点： （1 1）成本低成本低，不需要什么特别昂贵的设备； （2）
5、操作简单、安全操作简单、安全； （3）对许多生物活性物质具有稳定作用对许多生物活性物质具有稳定作用； （4）存在产品与杂质的共沉作用存在产品与杂质的共沉作用，因而它只能作为初步纯化初步纯化。 5.2.1 基本原理基本原理 5.2.1.1盐析原理盐析原理 蛋白分子的表面蛋白分子的表面同时含有带电荷的亲水基团亲水基团和不带电荷的疏水基团疏水基团。 蛋白质的溶解度差别取决于蛋白质分子中极性基团与非极性基团的比例和这些基团的排列位置。 5.2.1.1盐析原理盐析原理（1）水合作用水合作用： 在水溶液中，蛋白质分子中的亲水基团吸聚着许多水分子，这种作用称为水合作用。这些水分子在蛋白质分子的表面形成一层水
6、化膜水化膜。 由于水膜的存在，各蛋白质分子间彼此隔开，使蛋白质分子在水中呈溶解状态。 稳定的亲水溶液分子间彼此隔开形成水化膜水分子亲水基团水合作用5.2.1.1盐析原理盐析原理（2）盐溶作用盐溶作用(Salt-in)(Salt-in)： 蛋白质在低盐浓度下发生盐溶蛋白质在低盐浓度下发生盐溶，这是因为当向蛋白质溶液中加入少量中性盐时，中性盐离子对蛋白质分子表面亲水基团（及水活度）的影响，增强了蛋白质分子与水分子的相互作用力，从而使蛋白质的溶解度增大。 蛋白质溶液少量中性盐 增加蛋白质分子与水分子的相互作用蛋白质溶解度5.2.1.1盐析原理盐析原理蛋白质在高盐浓度下发生盐析，这是因为当中性盐浓度增
7、加至一蛋白质在高盐浓度下发生盐析，这是因为当中性盐浓度增加至一定程度时，蛋白质表面电荷被大量中和（亲水基团被大量中性盐定程度时，蛋白质表面电荷被大量中和（亲水基团被大量中性盐离子所包围），水分子离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏离子所包围），水分子离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质分子相互聚集而沉淀。水区域间的相互作用，使蛋白质分子相互聚集而沉淀。 （3）盐析作用（盐析作用（Salting-out)Salting-out)： 加入大量中性盐 蛋白质溶液亲水基团被中性盐包围 疏水基团的相互作用蛋白质相互聚集（溶解度下降） 暴露疏水区域水分子离开蛋白质lgS （溶解
8、度）I （离子强度） 盐溶盐析 图5-1 溶液离子强度与蛋白质浓度的关系5.2.1.2 Cohn方程式 蛋白质盐析时，蛋白质的溶解度与盐浓度的关系可由Cohn经验公式来表示： （5-1）其中： （5-2）式中：S 蛋白质的溶解度（g/L） I 离子强度 mi i离子的摩尔浓度（mol/L） Zi i离子所带的电荷数（即离子的价数） 盐析常数，与盐的种类无关 KS 盐析常数，与温度和pH无关IKSslg221iiZmI 关于关于值：值： （1）值与盐的种类无关，值与盐的种类无关，在式（5-1）中，令I=0，则： =lg S0 （5-3） S0表示在纯溶剂中（即I=0）蛋白质的溶解度，由此可见是一
9、个与盐的种类无关的常数。值的大小主要决定于蛋白质的性质。 （2）值不可能直接测定值不可能直接测定 值是假定离子强度I=0时，用外推法求出的。事实上由于盐溶作用的存在，I=0时的溶解度比低盐溶液要低。 （3）值随温度和值随温度和pH而变而变 关于关于KS主要取决于蛋白质和盐的种类，取决于蛋白质和盐的种类，而与温度和而与温度和pH无关。无关。 （1）KS与蛋白质种类的关系与蛋白质种类的关系对于不同的蛋白质，KS值的变化不是很大，大多不超过1倍。一般地：组成相同的蛋白质蛋白质，分子量越大分子量越大，KS较大较大，沉淀所需用盐量越少用盐量越少；蛋白质分子不对称分子不对称性越大性越大，KS值较大值较大，
10、越容易沉淀越容易沉淀。如表5-2所示为采用硫酸铵盐析时不同蛋白质的盐析常数。 表5-2 硫酸铵对不同蛋白质的盐析常数 蛋白质 马血红蛋白 马肌红蛋白 卵青蛋白 纤维蛋白原 KS 0.71 0.94 1.22 1.46 （2）KS与盐种类的关系与盐种类的关系 不同种类的盐，对KS的影响较大。KS值较大，就意味着该盐的盐析效果好，其中阴离子的影响较显著阴离子的影响较显著，而阳离子的影响是第二位的。 对于阴离子阴离子，含高价高价阴离子的盐，效果比低价的好比低价的好。常用阴离子的盐析效果排列如下：柠檬酸盐柠檬酸盐POPO4 43-3-SOSO4 42-2-CHCH3 3COOCOO- - ClCl-
11、-NONO3 3- -SCNSCN- - 对于阳离子阳离子，一般地高价高价阳离子（如Mg2+、Ca2+）不不如低价如低价阳离子，常用一价阳离子的盐析效果排列如下： NHNH4 4+ + K K+ + NaNa+ + 而常用盐析剂盐析效果的排列顺序为： NaHNaH2 2POPO4 4 (NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4NaNa2 2SOSO4 4MgSOMgSO4 4NaClNaCl表5-1 不同盐类对碳氧血红蛋白的KS值和值 用不同盐类采用外推法求值时，因温度和pH等条件不同，值会有所变动。如表5-1所示，各种盐类对碳氧血红蛋白的值在3.0左右。 盐种类 磷酸钾 硫酸钠 硫酸铵柠檬
12、酸钠 硫酸镁 3.01 2.53 3.09 2.60 3.23 KS 1.00 0.76 0.71 0.69 0.335.2.1.3 分段盐析法分段盐析法 （1）KS分段盐析法分段盐析法 改变离子强度改变离子强度 对于蛋白质混合物，不同蛋白质在不同离子强度下的不同蛋白质在不同离子强度下的溶解度不同溶解度不同，发生盐析时所需的离子强度也就不同。根据这一原理，采用不同离子强度分步盐析的方法，即可从蛋白质混合物中分离各种不同的组份。如： 硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度 开始析出的蛋白质种类开始析出的蛋白质种类 20% 纤维蛋白原纤维蛋白原 2833% 血红蛋白血红蛋白 3335% 拟球蛋白拟球蛋白 50%
13、 清蛋白清蛋白 80% 肌红蛋白肌红蛋白 这种改变离子强度的分段盐析法称为这种改变离子强度的分段盐析法称为KS分段盐析法分段盐析法，常用于粗蛋白质和酶的分段分离。204060800100总蛋白总蛋白目标蛋白质目标蛋白质最适饱和度是30%，55%5.2.1.3 分段盐析法分段盐析法 （2）分段盐析法分段盐析法改变改变pH和温度和温度 不同蛋白质在不同温度和不同蛋白质在不同温度和pH值下的溶解度不值下的溶解度不同同，因此在一定离子强度下改变混合液pH和温度亦可实现分段盐析的目的。 由于这种方法是通过改通过改值的大小值的大小来实现的，因而叫做做分段盐析法分段盐析法。此法常用于蛋白质的进一步纯化和结晶
14、时使用。 5.2.2 影响盐析的若干因素影响盐析的若干因素 5.2.2.1 蛋白质的浓度与盐析的关系蛋白质的浓度与盐析的关系 从Cohn式可知，当蛋白质浓度较低时，发生盐析时需要较高的离子浓度。 如用硫酸铵盐析碳氧肌红蛋白（COMb）时： 蛋白质起始浓度蛋白质起始浓度 COMb开始沉淀时开始沉淀时硫酸铵的饱和度硫酸铵的饱和度90%的的COMb沉淀析沉淀析出时硫酸铵的饱和度出时硫酸铵的饱和度 30g/L 58%65% 3g/L 66%73% 由此可见，在不同浓度的蛋白质溶液中进行盐析，使用硫酸铵的饱和度是不相同的。 5.2.2.1 蛋白质的浓度与盐析的关系蛋白质的浓度与盐析的关系 用于分步分离提
15、纯时用于分步分离提纯时，一般采用较稀的蛋白质溶液采用较稀的蛋白质溶液，多加一些中性盐，使共沉作用减少至最低限度，一般一般采用的蛋白质浓度为为2.53.0%。 不利于杂质分离易发生杂蛋白共沉作用盐用量利于杂质分离杂蛋白共沉作用少盐用量 蛋白质起始浓度高蛋白质起始浓度高蛋白质起始浓度低蛋白质起始浓度低5.2.2.2 pH对盐析的影响对盐析的影响 蛋白质净电荷越多蛋白质净电荷越多它的溶解度越大溶解度越大 值(lgS0)就越高越高。 改变改变溶液的pH即可改变蛋白质分子所带净电改变蛋白质分子所带净电荷的数量荷的数量从而改变改变值值的大小。 当当pH值为值为蛋白质的等电点（pI）时）时，蛋白质分蛋白质分
16、子上的净电荷数为零子上的净电荷数为零，溶解度最小，溶解度最小，值最低。值最低。因此在盐析时常选择溶液pH在该蛋白质的等电点附近。pH两种蛋白质的相对溶解两种蛋白质的相对溶解度会随度会随pHpH而变化很大；而变化很大；随随pH pH 变化变化（1 1）对数关系）对数关系（2 2） 等电点附近有极小值等电点附近有极小值5.2.2.2 pH对盐析的影响对盐析的影响（1）pH值对盐析的影响较大： 由于=lgS0， 当值增加值增加1 1时，溶解度（S S）就增加增加1010倍倍。 对某些蛋白质，在一定盐浓度下，不同的pH下的值相差达3倍以上，也即蛋白质溶解度的变化达1000倍以上。 因此，盐析过程中pH
17、的控制是非常严格的。（2）关于pI值： 在水中或稀盐溶液中在水中或稀盐溶液中测得的蛋白质的蛋白质等电点（pIpI），与高与高盐浓度下盐浓度下所测的结果不一定相同。不一定相同。 因此需根据实际情况调整pH值至蛋白质溶解度最低处，才能获得更好的效果。 5.2.2.3 温度对盐析的影响温度对盐析的影响 一般说来，温度升高，溶质的溶解度增大一般说来，温度升高，溶质的溶解度增大。（1）在低盐溶液或纯水中）在低盐溶液或纯水中，生物大分子的溶解度生物大分子的溶解度大多数在一定范围内随温度的升高而增加；随温度的升高而增加；（2）在高盐溶液中）在高盐溶液中，生物大分子的溶解度随温度的升高生物大分子的溶解度随温度
18、的升高而减少而减少，这是因为较高的温度会使蛋白质分子失水较高的温度会使蛋白质分子失水，因而利于沉淀。（3）尽管较高的温度有利于盐析沉淀，但较高温度易使蛋白质变性和发生共沉作用，因此蛋白质盐析过程通常在室温下进行（25左右），对某些温度比较敏感的酶，则需要在低温下（04）操作。 5.2.3 硫酸铵盐析法硫酸铵盐析法 常用盐析剂：硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、醋酸钠和硫氰化钾等。 硫酸铵硫酸铵：溶解度大：溶解度大，但缓冲能力弱缓冲能力弱，此外因含有NHNH4 4+ +，对蛋白质的分析对蛋白质的分析会带来带来一定影响影响。 硫酸钠硫酸钠：不含氮：不含氮，不影响蛋白质的定量测
19、定；但溶解度较低溶解度较低，一般要在一般要在3030以上操作以上操作效果较好。 5.2.3 硫酸铵盐析法硫酸铵盐析法 表5-3 不同温度下硫酸铵和硫酸钠的溶解度温度（） 0 10 20 25 30硫酸铵 (g/kg水)706.96 730.73 757.16 769.05 780.95(mol/kg水) 5.35 5.53 5.73 5.82 5.91硫酸钠 （g/L） 13.8 18.4 24.8 28.2 32.6(mol/L)0.0970.1300.1750.1990.230硫酸铵的加入有以下几种方法：硫酸铵的加入有以下几种方法：1 1）加入固体盐法）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不
20、增大溶液体积的情用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透
21、析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。5.2.3.1 硫酸铵的预处理 重金属离子的处理（医用）：（1）重结晶；（2）H2S处理除重金属（对巯基敏感） pH调整：（1）当蛋白质的pI5.0时，用氨水5.2.3.2 硫酸铵饱和度的调整（分段盐析）饱和度的调整（分段盐析）（1）加入固体盐法：适加入固体盐法：适合于饱和度较高的场合于饱和度较高的场合。合。 每升硫酸铵溶液从饱
22、和度S1增至S2所需加入硫酸铵的克数可用下式计算：2123 . 0100)(533SSSG（2）加入饱和溶液法：加入饱和溶液法：适合于饱和度不高的场适合于饱和度不高的场合合 。 V1升硫酸铵溶液从饱和度S1增至S2所需加入硫酸铵饱和溶液的体积为 ：1212)100()(VSSSV5.3 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 5.3.1 有机溶剂法沉淀原理有机溶剂法沉淀原理 一般水溶液一般水溶液加入有机溶剂加入有机溶剂水溶液的介电常数水溶液的介电常数溶质分溶质分子（蛋白质）之间静电引力子（蛋白质）之间静电引力溶质的溶解度溶质的溶解度。 对于具有表面水化层的生物大分子：生物大分子溶液生物大分子溶液有机溶剂
23、与水作用有机溶剂与水作用表面水化层被压缩表面水化层被压缩生生物大分子脱水物大分子脱水聚集析出。聚集析出。有机溶剂沉淀法具有如下特点：不同溶质的沉淀所要求的有机溶剂浓度不同不同溶质的沉淀所要求的有机溶剂浓度不同，这是这是有机溶剂分步沉淀的基础分步沉淀的基础。其分辨能力比分辨能力比盐析法高盐析法高。溶剂容易蒸发除去溶剂容易蒸发除去，因此适合于适合于制备食品用食品用蛋白质。有机溶剂密度低有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，过滤和过滤和离心分离离心分离都较容易容易。容易使某些生物大分子变性失活容易使某些生物大分子变性失活。有机溶剂易燃易爆，操作常需在低温下进行操作常需在低温下进行。 5.3.2 有机溶剂
24、的选择有机溶剂的选择 选择依据：选择依据： 能和水混溶；能和水混溶； 用量少；用量少； 生物物质活性的损失少；生物物质活性的损失少； 最好无毒性。最好无毒性。 常用溶剂：常用溶剂： 糖类、氨基酸、核苷酸糖类、氨基酸、核苷酸最常用的是乙醇最常用的是乙醇 核酸核酸常用的有乙醇、异丙酮、常用的有乙醇、异丙酮、-二氧基乙醇二氧基乙醇 蛋白质、酶蛋白质、酶乙醇、甲醇、丙酮乙醇、甲醇、丙酮5.3.3 有机溶剂沉淀的影响因素有机溶剂沉淀的影响因素 （1）温度温度 活大分子生物物质变性失有机溶剂用量溶解度采用低温沉淀 （2）pH 接近等电点时等电点时，引起沉淀所需的有机溶剂浓度有机溶剂浓度较少较少，利于提高沉
25、淀效果沉淀效果。 选择适宜的适宜的pHpH可提高分离的分辨能力，利于利于提高分离效果提高分离效果。 （3）样品浓度样品浓度 浓度高时 不利于产品纯化共沉作用大变性可能性少溶剂用量少浓度低时 分离效果好共沉作用少活性物质易变性失活样品回收率低溶剂用量大（4）金属离子的影响 某些高价阳离子某些高价阳离子的存在生物物质的溶解度生物物质的溶解度沉淀沉淀效果效果 如：如：ZnZn2+2+和和CaCa2+2+在一定在一定pHpH值下与呈阴离子状态的蛋白质值下与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，使溶解度大大下降。形成复合物，使溶解度大大下降。0.005M0.005M至至0.02M0.02M的的ZnZn2+2+
26、可以使原来沉淀蛋白质的有机溶剂用量减少可以使原来沉淀蛋白质的有机溶剂用量减少1/31/3至至1/21/2。 高价阳离子与杂蛋白和弱酸盐形成沉淀高价阳离子与杂蛋白和弱酸盐形成沉淀蛋白质分离蛋白质分离提纯效果提纯效果 所以使用高价阳离子时需事先除去杂蛋白及磷酸盐等所以使用高价阳离子时需事先除去杂蛋白及磷酸盐等杂质，以免产生共沉作用。杂质，以免产生共沉作用。（5）离子强度的影响离子强度的影响 中性盐浓度较高时（0.2 mol/L以上），会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度，使有机溶剂的用量增大。有机溶剂的用量增大。因而盐浓度太高时，需要采用透析等方法使盐含需要采用透析等方法使盐含量降低量降低。 对于
27、蛋白质和多糖，离子强度为0.01-0.05 mol/L比较合适，少量盐的存在还对蛋白质的活性有保护作用。 5.4 非离子多聚物沉淀法 最早用于 提纯免疫球蛋白5.4.1 原理 沉淀作用是多聚物与大分子发生共沉作用的结果。 与有机溶剂相似，使大分子的水化度降低，促使大分子沉淀。 多聚物与大分子之间以氢键相结合形成复合物。5.4.2 常用非离子多聚物 聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、壬苯乙烯化氧（NPEO）、右旋糖酐硫酸钠等。 PEG亲水性强、无毒、不可燃性，且对蛋白质活性有保护作用，是应用最广的非离子聚合物沉淀剂。5.4.3 影响PEG沉淀法的主要因素（1）沉淀剂浓度，蛋白质溶解度与PEG浓度之间的
28、关系类似于盐析作用：lgS = lgS0 - KsPEG（2）离子浓度：在固定pH值下，盐浓度越高，PEG用量越少。（3）pH：在pI时，PEG用量最小。（4）PEG分子量：在一定范围内，高分子量PEG沉淀的效果较好，但粘度高，操作与分离困难。4000左右最为常用。5.4.4 PEG沉淀法特点（1）操作条件温和，变性失活少。（2）具有极高的沉淀效果，用量较少，PEG浓度一般为10%左右。（3）产物颗粒大，容易收集。5.5 其他沉淀法 等电点沉淀法 生成盐类复合物沉淀法 选择变性沉淀法5.5.1 等电点沉淀法 两性物质氨基酸、核苷酸、蛋白质、酶、核酸等。 等电点沉淀法主要是利用两性物两性物质质分
29、子在电中性在电中性时的溶解度最低时的溶解度最低，而各种两性物质各种两性物质具有不同的等电具有不同的等电点点而进行分离的一种方法。 pH=pI5.5.1 等电点沉淀法（1）等电点法的优点等电点法的优点是，使用的试剂是酸碱，易中和除去，无毒性，适应于食品类生物物质的处理。缺点缺点是在酸性条件下易使蛋白质失活。（2）等电点法较适合于在水中溶解度较低较适合于在水中溶解度较低（或憎水性较强）的两性物质的两性物质。如谷氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪蛋白等；对一些亲水性强的蛋白质，如明胶等则不适应。（3）单独使用单独使用等电点法时提取率较低时提取率较低，为了提高提取率，等电点法常和盐析法、有机
30、溶剂法等其它方法一起使用。5.5.2 生成盐类复合物沉淀法 按使用盐类不同，分为两类： 与酸性功能团作用的金属离子沉淀法 与碱性功能团作用的有机酸沉淀法 特点：（1）盐类复合物溶解度低，极易沉淀析出，但共沉作用明显；（2）要考虑金属离子或酸根离子的除去问题；（3）要防止目的产物发生不可逆沉淀。5.5.2.1 金属离子沉淀法 在碱性溶液中，许多生物物质都能与金属离子形成沉淀，按其作用基团不同分为三类：（1）与羧酸、胺、杂环化合物结合Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+。（2）与羧酸结合，但不与含N化合物结合Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+。（3）与巯基相结合
31、Ag+、Hg2+、Pb2+。5.5.2.1 金属离子沉淀法 常用金属离子： Zn2+ 肽、蛋白质； Ca2+有机酸、蛋白质、核酸； Ba2+ 蛋白质 Mg2+DNA及其它核酸5.5.2.2 有机酸沉淀法 常用有机酸苦味酸、苦酮酸、鞣酸、三氯乙酸（1）有机酸与蛋白质结合时，易发生不可逆沉淀。用此法制备蛋白质时，一般需加入稳定剂，且条件要温和。（2）有机酸根离子的除去：先加无机酸替换，后用乙醚萃取。5.5.3 选择变性沉淀法多用于去除杂蛋白，常用方法有： 表面活性剂法 有机溶剂法 加热变性法 选择性酸碱变性法练习题 某蛋白质混合物A、B、C，已知蛋白A的等电点为8.3，蛋白B的等电点为4.8，蛋白C的等电点为4.6。用硫酸铵盐析（在各自等电点pH值下）时，开始析出时的硫酸铵饱和度，蛋白A为54%，蛋白B为32%，蛋白C为55%。试设计用硫酸铵分段盐析法分离蛋白质混合物A、B、C的工艺路线。
