1、第四章第四章 离心和沉淀分离法离心和沉淀分离法 大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变化范围很宽。化范围很宽。 浓度可高达每单位体积含浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低的不溶性固体，又可低至每单位体积仅含至每单位体积仅含0.1%。 粒径的变化可以从直径约为粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为的微生物，到直径为1mm的不溶性物质。的不溶性物质。 对于这些浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，对于这些浓度较小，粒径较大，硬度较强
2、的不溶物，我们可以采用过滤方法分离。我们可以采用过滤方法分离。 而有些发酵液，使用助滤剂有利于过滤分离，而还有而有些发酵液，使用助滤剂有利于过滤分离，而还有一些发酵液则不行。一些发酵液则不行。问 题固液分离：第一选择为过滤， 过滤技术难处理的发酵液如何处理？ 第二选择离心分离。离心法与过滤法的比较离心法与过滤法的比较比较比较项目项目浓缩物浓缩物设备设备经济经济适用性适用性处理量处理量应用应用范围范围离心法离心法悬浮液或悬浮液或浆体浆体需需专用设备专用设备成本高成本高小小实验室范围实验室范围过滤法过滤法滤饼滤饼不需不需专用设备专用设备成本低成本低大大实验室实验室工业范围工业范围离心分离原理离心分
3、离原理 离心力：离心力： Stocks Force(粘滞吃力粘滞吃力)：离心沉降速度：离心沉降速度：分离因子定义分离因子定义Fr：离心力/重力加速度(g)的比值意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数，用于离心机的分类离心技术分类离心技术分类按分离因子按分离因子Fr分类分类 1)、常速离心机Fr 8000-15000g 4)、超速离心机，Fr = 20,000 1,000,000g二、沉淀分离法二、沉淀分离法 （一）概述定义利用某种沉淀剂使目标产物或杂质的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程 与结晶联系与结晶联系 在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在化学反应的沉淀或结晶。
4、区别区别结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出。2、类型盐析沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法高分子聚合物沉淀法金属离子沉淀法沉淀法操作步骤 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； 沉淀物的陈化，促进晶体生长； 离心或过滤，收集沉淀物；沉淀分离的目的：（1）通过沉淀使目标成分浓缩和去除杂质；（2）通过沉淀将已经纯化的产物由液态变为固态，便于保存和进一步加工。沉淀法用于分离纯化应该是是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。沉淀法的沉淀法的优点：优点： 设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产，在产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利，收率越高；沉
5、淀法的沉淀法的缺点：缺点： 所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，所以沉淀法所得的产品纯度通常都比结晶法低，过滤也较困难。 应用沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质(酶)的分离提取，无论是实验室规模还是工业生产，沉淀法都得到了普遍应用,工业上利用蛋白质溶解度之间的差异从天然原料如血浆、微生物抽提液、植物浸出液和基因重组菌中分离蛋白质混合物已有50多年的历史了。沉淀法分离蛋白质的特点有沉淀法分离蛋白质的特点有：1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小1050倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水
6、解酶混合的溶液中分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降到最低。（二）盐析沉淀法 定义在高浓度中性盐存在下，使目标产物的溶解度降低而产生沉淀的过程2.盐析原理 首先需要了解蛋白质的特性： 是高分子两性电解质，主要由疏水性不同的氨基酸组成，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。大部分蛋白质溶于水，是以亲水胶体的形式或大分子溶液存在的。蛋白质溶液的稳定性电荷稳定性： 两性电解质，由于静电斥力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系空间稳定性： 蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞
7、，形成稳定的胶体溶液。 可以通过降低蛋白质周围的水电层和双电层厚度降低蛋白质的稳定性而使蛋白质沉淀。盐析示意图n破坏水化层n中和电荷3.盐析过程当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象低盐浓度下，蛋白质溶解度增大（2）“盐析”现象高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：A.无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；B.中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；离子强度对盐析过程的影响 盐析沉淀平衡式（Cohn经验公式） S蛋白质溶解度，mol/L; I离
8、子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价IKSslog221iiZcI，Ks常数和Ks的物理意义 截距常数,与盐的种类无关，但与蛋白质的种类、温度和pH值有关。(= log S0) Ks盐析常数，与温度、pH值无关，与蛋白质和无机盐的种类有关。经验方程的图示 在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度(即离子强度)达到沉淀的目的，称为“Ks” ” 分级盐析分级盐析法法。 （Ks盐析：盐析：固定pH ，温度，改变盐浓度）2.2.在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“”分级盐折法。分级盐折法。 （ 盐析：盐析：固定离子浓度，改变pH ，温度） 由于蛋白质对离子强度的变化非常敏
9、感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。一般粗提蛋白时常用第1种方法，进一步分离纯化时常用第2种方法。盐析法分为两种类型4、盐析剂的选择盐析剂的条件盐析作用要强： 盐析能力 阴离子阳离子；高价阴离子低价阴离子有较大的溶解度，且溶解度受温度的影响尽可能小。盐析用盐必须是惰性的，不致影响蛋白质等生物分子的活性，最好不要引入不易分离的杂质。来源丰富、经济常用盐析剂(NH4)2SO4 、Na 2SO4、磷酸盐、柠檬酸盐等。 最常用最常用 (NH4)2SO4 优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。 次常用次常用Na 2SO4 。缺
10、点：在40度以下溶解度较低，因此主要用于热稳定蛋白。阴阳离子盐析效果 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN-阳离子盐析效果： NH4+ K+Na+ 高价阳离子5、影响盐析的因素 溶质分子种类的影响：Ks和值 溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高； pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量，通常调整体系pH值，使其在pI附近； 盐析温度：大多数情况下，高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降；6、盐析沉淀法的特点 优点：成本低、无需专门的设备、易于操作、安全性高、不会引起生物物质变性失活
11、、适用范围广；缺点：通常选择性不好（非蛋白的杂质夹带沉淀很少）， 往往有共沉淀产物，一般作为粗提纯操作，还需要与其它分离方法联合使用。盐份含量高。（三）有机溶剂沉淀法 定义在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。沉淀机理 （1）降低了水溶液的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。（3 ）有机溶剂的加入会破坏蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团 结合形成疏水层有机溶剂中的蛋白
12、质沉淀有机溶剂沉淀分离的原理示意图3、有机溶剂的选择介电常数小，沉淀作用强对生物分子的变性作用小与水互溶安全、无毒、价廉、易回收等# 常用有机溶剂为：甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇常用的有机溶剂沉析剂 乙醇（浓度60%） ：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮（浓度40-50%） ：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 特点：介电常数小， 60%乙醇的介电常数是48 40-50%丙酮的介电常数是22容易获取4.有机溶剂沉淀的特点 分辨率高； 溶剂容易分离，并可回收使用； 产品洁净（有机溶剂易祛除）； 容易使蛋白质等生物大分子变性失活； 应注意在低温
13、下操作； 成本高 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；一般在0以下，操作时在冰盐浴中进行。 搅拌速度：散热 溶液pH值：通常选在等电点附近 离子强度:离子强度低有利于沉析，盐浓度一般在0.010.05mol/L 生物样品浓度: 蛋白质溶液的起始浓度0.52%，粘多糖起始浓度12%为宜。稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+5、有机溶剂沉淀过程的影响因素（四）等电点沉淀法定义调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。沉淀机理蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点
14、时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。盐离子的影响使蛋白质的实际等电点发生“漂移”， pI偏离（0.5）与阳离子结合， pI升高与阴离子结合， pI降低4、特点沉淀条件温和；不引入新的物质；沉淀效果差。 由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用。（五）高分子聚合物沉淀法定义利用一些水溶性高分子聚合物使目的物溶解度降低而析出固相物的过程沉淀机理非离子型 如聚乙二醇（PEG）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等，机理：类似于有机溶剂沉淀离子型（海藻酸盐、
15、聚丙烯酰胺盐、聚乙烯亚胺）：有机溶剂沉淀+架桥PEG沉淀法机理： PEG分子亲水性强，优先水合，使得蛋白质等从溶剂中析出. 优点 1 体系的温度只需控制在室温条件下； 2 沉淀的颗粒往往比较大，同其他方法相比，产物比较容易收集； 3 PEG非但不会使蛋白质变性而且可以提高它的稳定性， 缺点 PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去，为此需用超滤和液液萃取来解决。广泛应用于核酸、酶的分离非离子型聚合物沉淀法3、特点 沉淀效果较好，条件温和 高聚物的残留 有一定的毒性（阳离子）（六）金属离子沉淀法定义利用一些金属离子与目的物复合，降低其复合物的溶解度而析出固相物的过程沉淀机理 由于金属离子能与蛋白
16、质分子中的特殊部位起反应，从而降低蛋白质的溶解度。例如锌组胺酸残基中的咪唑基结合，使蛋白质的等电点转移，沉淀析出。3. 分类与羧基、胺及杂环等含氮化合物结合；如Mn2+、Fe2 + 、Zn2 + 、Cu2 +等与羧基结合，不与胺及杂环等含氮化合物结合；如Ca2 + 、Ba2 + 、Mg2 + 、Pb2 +等与巯基结合；如Hg + 、Ag + 、Pb2 +等3、特点 沉淀效果很好； 选择性好 容易使生物分子变性 复合物难分解（七）选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂质蛋白变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为选择性变性沉淀法 在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂质的
17、种类、含量及其物理化学性质等有比较全面的了解。使用时需慎重！使用时需慎重！选择性变性的方法 选择性热变性：对于选择性热变性：对于-淀粉酶等热稳定性好淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。蛋白受热变性沉淀而被除去。 选择性酸碱变性：根据欲分离物质所含杂质在选择性酸碱变性：根据欲分离物质所含杂质在不同这不同这pHpH条件下稳定性不同的特性，通过改变条件下稳定性不同的特性，通过改变pHpH使杂蛋白变性沉淀而除去。使杂蛋白变性沉淀而除去。 加入变性剂：根据欲分离物质所含杂质对表面加入变性剂：根据欲分离物质所含杂质对表面活性剂、某些金属离子、有机溶剂敏感性不同，活性剂、某些金属离子、有机溶剂敏感性不同，使得敏感性强的杂蛋白沉淀析出。操作一般在使得敏感性强的杂蛋白沉淀析出。操作一般在冰水浴中进行，以避免蛋白质变性。冰水浴中进行，以避免蛋白质变性。思考题常用的沉淀法有哪几种？简述各自的沉淀机理。生产中常用的盐析剂有哪些？其选择依据是什么？影响盐析的主要因素有哪些？有机沉淀法与盐析沉淀法相比有何优缺点？
