1、1常规监测室常规监测室 1、预处理预处理2、取、取水样水样10mL稀释到稀释到50mL，加入，加入1.0mL酒石酸钾酒石酸钾钠钠，摇匀，加入，摇匀，加入1.0mL纳氏试剂纳氏试剂（上清液上清液），显色），显色10min，于，于420nm，2cm比色皿比色，得到吸光度。比色皿比色，得到吸光度。3、实验需同时进行、实验需同时进行平行、加标实验平行、加标实验。4、用实验得到的吸光度，录入系统，、用实验得到的吸光度，录入系统，对比标准曲线，对比标准曲线，得到水样的氨氮浓度。得到水样的氨氮浓度。氨氮分析步骤：氨氮分析步骤：1 概述概述2 光吸收的基本定律光吸收的基本定律 3 分光光度仪器分光光度仪器4
2、显色反应与显色条件的选择显色反应与显色条件的选择 5 分光光度法仪器测量误差及其消除分光光度法仪器测量误差及其消除 6 质量控制质量控制7 分分光光度计使用光光度计使用注意事项注意事项基本内容基本内容3一、概述一、概述IrIoItIa 分光光度法又名吸光光度法，是建立在物质对光的分光光度法又名吸光光度法，是建立在物质对光的选择性吸收的基础之上的分析方法。选择性吸收的基础之上的分析方法。 利用有色溶液对可见光的吸收进行定量测定，称为利用有色溶液对可见光的吸收进行定量测定，称为比色法。比色法。4比色法：比色法：利用溶液颜色的深浅来测定溶液中有色利用溶液颜色的深浅来测定溶液中有色 物质的浓度物质的浓
3、度目视比色法比色法光电比色法分光光度法：分光光度法：用分光光度计进行的比色分析的方法用分光光度计进行的比色分析的方法可见分光光度法分光光度法 紫外分光光度法红外分光光度法5(1) 方法方法灵敏度高：测定下限可达灵敏度高：测定下限可达103106mol/L。(2) 方法方法的准确度能满足微量组分测定的要求。的准确度能满足微量组分测定的要求。(3) 操作简便快速，仪器操作简便快速，仪器设备简单。设备简单。(4) 应用应用广泛广泛:几乎所有的无机离子和有机化合物都几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定。可直接或间接地用吸光光度法进行测定。分光光度法的特点分光光度法的特点
4、6物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收（1）.光的基本性质光的基本性质电磁辐射按波长顺序排列，称电磁波谱。电磁辐射按波长顺序排列，称电磁波谱。(真空紫外真空紫外)远红外远红外中红外中红外近红外近红外可见可见近紫外近紫外远紫外远紫外10nm200nm中层中层电子电子200nm 400nm价电价电子子400nm 750nm价电价电子子760 nm 2.5 m分子分子振动振动2.5 m 5.0 m分子分子振动振动5.0 m 1000 m分子分子转动转动肉眼可见肉眼可见7（2）、物质对光的选择性吸收）、物质对光的选择性吸收 当光通过透明的物质时，具有某种能量的光子被当光通过透明的物质时，具有某种能
5、量的光子被吸收，而另外能量的光子不被吸收。吸收，而另外能量的光子不被吸收。光子是否被物光子是否被物质吸收，既决定于光子的能量，又决定于物质的内质吸收，既决定于光子的能量，又决定于物质的内部结构。部结构。8仅当照射光的光子的能量与被照射物质粒子的仅当照射光的光子的能量与被照射物质粒子的基态和激发态的能级差相当时才能被光吸收。基态和激发态的能级差相当时才能被光吸收。 hhEEE21基态基态 激发态激发态 E1 E2M + h M *M + 热M + 荧光或磷光分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同。分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同。9互补色光互补色光10互补光：互补光：透射光
6、与吸收光组成白光，故称为互补色光透射光与吸收光组成白光，故称为互补色光 /nm颜色颜色互补光互补光400-450紫黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红蓝绿蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光不同颜色的可见光波长及其互补光11 物质的颜色物质的颜色：是是由于物质对不同波由于物质对不同波长的光具有选择性长的光具有选择性的吸收作用而产生的吸收作用而产生的。的。即物质的颜色由透过光的波长决定即物质的颜色由透过光的波长决定溶液的颜色：溶液的颜色：
7、被吸收光色的互补色被吸收光色的互补色1213完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄光吸收黄光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意复合光复合光蓝光蓝光无色无色黑色黑色物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系（3）、）、吸收光谱或吸收曲线吸收光谱或吸收曲线 吸收曲线：测定某种物质对不同波长单色光的吸吸收曲线：测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以收程度，以波长为横坐标波长为横坐标，吸光度为纵坐标吸光度为纵坐标作图。作图。400480560640720 nm0.40.81.21.6AKMnO4 溶液的吸收曲线溶液的吸收曲线DCBA A、B、C、D代表不同浓代表不同浓度下的吸收曲线度下的吸收曲
8、线。max14（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max。（2）对于不同物质，它们的吸收曲线形状和）对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则则不同。不同。（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据物质定性分析的依据之一。之一。吸收曲线的讨论吸收曲线的讨论15（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度吸光度 A 有差异，在有差异，在max处吸光度处吸光度A 的差异最大。的差异
9、最大。此特性可作为物质此特性可作为物质定量分析的依据定量分析的依据。16二、光吸收的基本定律二、光吸收的基本定律 朗伯朗伯-比尔定律比尔定律（1）、朗伯）、朗伯比尔定律比尔定律IrIoItIa 一束一束平行平行单色单色光照射透明溶液时，光的一部分被吸收，光照射透明溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿的表面反射。一部分透过溶液，一部分被器皿的表面反射。17. 朗伯定律朗伯定律(Lamberts law). 比尔定律比尔定律(Beers law)0tA=lg(I /I )=K b 0tA=lg(I /I )=K c A：吸光度：吸光度lgotIAI18 朗伯朗伯-比尔定律比尔定律
10、A = lg (I0/It) =KbcA 吸光度吸光度(absorbance)b 介质厚度介质厚度(length/cm)c 浓度浓度(concentration)K 吸光系数吸光系数(absorptivity)0tIT =IT透光度透光度(Transmittance)A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT = Kbc=10=10T-Kbc-AT: 透过光强度透过光强度It与入射光强度与入射光强度Io之比。之比。19（2）、比例常数）、比例常数K吸光系数吸光系数a 当当c 用用gL-1表示，表示，b用用cm表示时，表示时，K用用a表示，称为表示，称为吸光系数，其单位为吸光
11、系数，其单位为 L(g.cm)-1 ，则：则：A = a b clgotIAK bcI摩尔吸光系数摩尔吸光系数 当当c用用molL-1表示，表示，b用用cm表示时，表示时，K用用表示，表示，称为摩尔吸光系数，其单位为称为摩尔吸光系数，其单位为Lmol-1.cm-1。则：。则：A =b c在数值上等于浓度为在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为、液层厚度为1cm时该溶时该溶液在某一波长下的吸光度。液在某一波长下的吸光度。20u 越大越大表明该物质的吸光能力越强，用光度表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的法测定该物质的灵敏度越高灵敏度越高。 105：超高灵敏；：超高灵敏； =(610
12、）104 ：高灵敏；：高灵敏； 2104 ：不灵敏。：不灵敏。分光光度的灵敏度分光光度的灵敏度与温度、波长及吸收物质本身的性质有关与温度、波长及吸收物质本身的性质有关，与与吸收物质浓度无关。吸收物质浓度无关。 对朗伯对朗伯-比尔定律的偏离比尔定律的偏离CA标准工作曲线图标准工作曲线图正误差正误差负误差负误差 散射光的影响散射光的影响胶体、乳浊液或悬浊液由于散胶体、乳浊液或悬浊液由于散射的作用使吸光度增大，或入射的作用使吸光度增大，或入射光不是垂直通过比色皿产生射光不是垂直通过比色皿产生正偏差正偏差。（1）、物理因素）、物理因素 单色光不纯，导致单色光不纯，导致负偏差负偏差22 吸光质点的相互作
13、用，浓度较大时，产生偏差，吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生偏差， 朗朗伯伯-比尔定律只适合于稀溶液（比尔定律只适合于稀溶液（c 10-2 molL-1 )。 平衡效应，物质的离解、缔合、互变异构及化学平衡效应，物质的离解、缔合、互变异构及化学变化引起的偏离，如：变化引起的偏离，如： Fe(SCN)3 = Fe3+ + 3SCN- Cr2O72- + H2O = 2CrO42- + 2H+ （2）、化学因素）、化学因素23光源光源单色器单色器吸收吸收池池检测系统检测系统稳压电稳压电源源分光光度法的基本部件：分光光度法的基本部件：读数指示器读数指示器24三、分光光度法及其仪器三、分光光度法及其
14、仪器 25（1）. 光源光源(Light source)：发出所需波长范围内：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度的连续光谱，有足够的光强度,稳定。稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯可见光区：钨灯，碘钨灯(320 2500 nm) 紫外区：氢灯，氘灯紫外区：氢灯，氘灯(180 375 nm)（2）. 单色器单色器(monochromator)：将光源发出的连：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。续光谱分解为单色光的装置。 棱镜棱镜 光栅光栅 玻璃玻璃350 3200 nm, 石英石英185 4000 nm26（3）.吸收池吸收池(cell):用于盛待测液及参比溶液用于盛待测液及参比溶液
15、玻璃玻璃 能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区石英石英 不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）（4）. 检测器检测器(detector)： 利用光电效应，将光能转成电流讯号。利用光电效应，将光能转成电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管光电池，光电管，光电倍增管27（5）.读数指示器读数指示器把光电流放大的信号以适当方式显示或记录下来。通把光电流放大的信号以适当方式显示或记录下来。通常使用悬镜式光电反射检流计测定产生的光电流。检常使用悬镜式光电反射检流计测定产生的光电流。
16、检流计光点偏转刻度直接标为吸光度和透光度，测定时流计光点偏转刻度直接标为吸光度和透光度，测定时一般可直接读出吸光度。一般可直接读出吸光度。28 四、显色反应与显色条件的选择四、显色反应与显色条件的选择显色反应显色反应在分光光度分析中，利用显色反应把待测组在分光光度分析中，利用显色反应把待测组分分 转变为有色化合物转变为有色化合物MR，然后再进行测定。，然后再进行测定。 使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有色化合物使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有色化合物的反应叫的反应叫显色反应显色反应。所用试剂称。所用试剂称显色剂。显色剂。 M(待测物待测物)nR(显色剂显色剂)MRn(有色化合物有色化
17、合物) 显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，其中绝显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，其中绝大多数是配位反应。大多数是配位反应。29对显色反应的要求对显色反应的要求1）、灵敏度高）、灵敏度高 选择选择较大的显色反应（较大的显色反应（一般要一般要为为104 105）。避免共存组分干扰。避免共存组分干扰。2）、选择性好）、选择性好 显色剂只与被测组分反应。显色剂只与被测组分反应。3）、有色物组成固定）、有色物组成固定Fe3+ + 磺基水杨酸磺基水杨酸 三磺基水杨酸铁三磺基水杨酸铁(黄色黄色) （组成固定）（组成固定）Fe3+ + SCN - FeSCN2+、 Fe(SCN)2 + （组成不固定
18、）（组成不固定）304）、有色物稳定性高，其它离子干扰才小。）、有色物稳定性高，其它离子干扰才小。如三磺基水杨酸铁的如三磺基水杨酸铁的Kf =1042 , F- 、H3PO4 对它无干扰。对它无干扰。5）、显色过程易于控制）、显色过程易于控制，而且有色化合物与，而且有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。显色剂之间的颜色差别应尽可能大。maxmax|60nmMRR31显色反应条件的选择（实验确定）显色反应条件的选择（实验确定）（1）、显色剂的用量）、显色剂的用量 ，适当过量，适当过量 M + R = MR (被测组分被测组分) (显色剂显色剂) (有色化合物有色化合物) R过量，反应完全，
19、过量，反应完全，MR稳定，稳定，A值稳定。值稳定。 cRcRcR 适宜的用量通过实验求得适宜的用量通过实验求得(cM、pH一定一定)吸光度吸光度A与显色剂用量与显色剂用量cR的关系会出现如图所的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。示的几种情况。选择曲线变化平坦处。33（1）对金属离子的影响）对金属离子的影响（2）对显色剂浓度的影响）对显色剂浓度的影响（3）影响配合物组成）影响配合物组成（4）配合物的稳定性的影响）配合物的稳定性的影响（5）影响显色剂的颜色）影响显色剂的颜色2）. 酸度酸度M + L = ML34（cM、 cR一定）一定）pH1pHpH2pH353）、显色时温度和时
20、间）、显色时温度和时间T1()T2()t(min)A4）、溶剂的影响）、溶剂的影响，有机溶剂会降低有色物的离，有机溶剂会降低有色物的离解度，从而提高解度，从而提高 显色反应的灵敏度。显色反应的灵敏度。36 影响主要表现影响主要表现干扰离子本身有颜色。干扰离子本身有颜色。与试剂生成有色配合物。与试剂生成有色配合物。 与试剂形成无色配合物而消耗显色剂与试剂形成无色配合物而消耗显色剂与被测离子生成离解度小的化合物。与被测离子生成离解度小的化合物。5）、干扰物质的影响及消除）、干扰物质的影响及消除37(3) 改变干扰离子价态改变干扰离子价态，测，测Ni2+时，时，Fe2+ 有干扰，加入有干扰，加入氧化
21、剂，氧化剂， Fe2+ Fe3+ .(4) 分离干扰离子分离干扰离子，用萃取、沉淀、电解、离子交换等，用萃取、沉淀、电解、离子交换等方法。方法。还可选择适当的参比溶液和入射光的波长等方法来还可选择适当的参比溶液和入射光的波长等方法来消除共存离子的干扰。消除共存离子的干扰。(2) 加入掩蔽剂加入掩蔽剂 ，如用，如用SCN-测定测定Co2+时，时，Fe3+有干扰，有干扰，加入加入 F- :Fe3+ + 6F- = FeF63- ; Fe3+ 被掩蔽。被掩蔽。 常用消除常用消除干扰的方法干扰的方法38(1) 控制酸度控制酸度，使干扰离子不显色。，使干扰离子不显色。 五、分光光度法仪器测量误差及其消除
22、五、分光光度法仪器测量误差及其消除 （545nm）入射光波长的选择入射光波长的选择 原则：原则： 灵敏度最高，干扰最小。灵敏度最高，干扰最小。 一般选择一般选择max为入射光波长。为入射光波长。 39光度计读数范围的选择光度计读数范围的选择任何型号的分光光度计均有一定的读数误差任何型号的分光光度计均有一定的读数误差,这是由这是由于光源不稳定于光源不稳定,读数不准确等因素造成的读数不准确等因素造成的.一定型号的分光光度计透光度读数误差是一常数一定型号的分光光度计透光度读数误差是一常数.（ 0.2 % 2 %）在不同的透光度读数范围内引起的浓度相对误在不同的透光度读数范围内引起的浓度相对误差是不同
23、的差是不同的. .由由Lambert-Beer定律可推导出浓度相对误差公式定律可推导出浓度相对误差公式.透光率读数的准确度是仪器精度的主要指标。透光率读数的准确度是仪器精度的主要指标。40测定结果的精度常用浓度的相对误差测定结果的精度常用浓度的相对误差dc/c表示。表示。AdATTdTcdc lg434.0bcAbdcdAcdcAdATTAln434. 0lgTdTdA434.041TlgTT.cc 4340 AdATTdTcdc lg434.0ccTTTccTTTcc时的可计算不同若透光度测量绝对误差浓度相对误差%,5 . 0:lg434. 0ccTTTccTTTcc时的可计算不同若透光度测
24、量绝对误差浓度相对误差%,5 . 0:lg434. 0 测量误差不仅与仪器的透光度的测量误差不仅与仪器的透光度的T 有关，而有关，而且与其透光度的读数且与其透光度的读数T 值也有关。值也有关。42若透光度刻度的读数的绝对误差为若透光度刻度的读数的绝对误差为T=1%，用不同的，用不同的T代入上式，可得相应浓度测量的相对误差代入上式，可得相应浓度测量的相对误差c/c，作图。，作图。TlgTT.cc 4340 (%)cc 0.20.40.60.81.00246810T0.368432、T在在20%65%(A=0.20.7)范围，相对误范围，相对误差较小。差较小。1、T = 36.8%(A =0.43
25、43)，相对误差最小。相对误差最小。由图可见：由图可见：为了减小浓度的相对误差，提高测定的准为了减小浓度的相对误差，提高测定的准确度，一般应控制溶液确度，一般应控制溶液吸光度吸光度A在最适宜读数在最适宜读数范围范围1.00.15。44参比溶液的选择参比溶液的选择 在吸光度测量中，作为比较的溶液或溶剂称为在吸光度测量中，作为比较的溶液或溶剂称为参参比溶液或空白溶液。比溶液或空白溶液。A总总A试剂试剂A显色剂显色剂A干扰干扰A络合物络合物溶剂溶剂 缓冲剂缓冲剂干扰干扰干扰与显色干扰与显色剂形成络合物剂形成络合物被测物与显被测物与显色剂生成色剂生成n选择参比溶液的总原则是选择参比溶液的总原则是: 使
26、试液的吸光度使试液的吸光度能真正反映待测组分的浓度能真正反映待测组分的浓度.45(1) 试样、试剂、显色剂都无色时，用试样、试剂、显色剂都无色时，用纯水作参比。纯水作参比。(2) 试样无色，试剂、显色剂有色，采用试样无色，试剂、显色剂有色，采用不加试样的空不加试样的空白溶液作参比。白溶液作参比。（试剂空白）（试剂空白）(3)试样有吸收，而显色剂等无色，可采用不加显色剂试样有吸收，而显色剂等无色，可采用不加显色剂的试样为参比。的试样为参比。（试样空白）（试样空白）(4)均有色，有吸收，对试样加入掩蔽剂，褪色后再加均有色，有吸收，对试样加入掩蔽剂，褪色后再加显色剂等作为参比。显色剂等作为参比。(褪
27、色空白褪色空白)46原理：原理： 朗伯朗伯比尔定律（比尔定律（A = b c）方法：方法：（1 1）标准曲线法或工作曲线法）标准曲线法或工作曲线法（2 2）比较法）比较法溶液浓度的测定溶液浓度的测定47 先配制一系列标准溶液，在先配制一系列标准溶液，在最大吸收波长处，测出它们的最大吸收波长处，测出它们的吸光度，作图。吸光度，作图。cA工作曲线图工作曲线图Axcxc1c2c3c4c5A1A2A3A4A51）、工作曲线法）、工作曲线法同条件下测未知液的吸光度，从图中查出未知同条件下测未知液的吸光度，从图中查出未知液的浓度。液的浓度。48 同条件分别测定未知液与标准溶液的吸光度同条件分别测定未知液与
28、标准溶液的吸光度Ax和和A标标，根据朗伯根据朗伯-比尔定律，应有下式：比尔定律，应有下式：2）、）、 比较法比较法xxAbcAbc标标标标ccAAxx/因为：因为：xxAccA标标所以：所以：49平行样品分析平行样品分析同一样品的两份或多份子样在完全相同的条同一样品的两份或多份子样在完全相同的条件下进行同步分析。件下进行同步分析。平行样的测定结果在一定程度上反映了测试平行样的测定结果在一定程度上反映了测试的精密度水平。的精密度水平。加标样品分析加标样品分析 在测定样品时，于同一样品中加入一定量的在测定样品时，于同一样品中加入一定量的标准物质进行测定，将测定结果扣除样品的标准物质进行测定，将测定结果扣除样品的测定值，计算回收率。测定值，计算回收率。加标实验可以反映测试结果的准确度。加标实验可以反映测试结果的准确度。六、质量控制六、质量控制七、分光光度计使用注意事项七、分光光度计使用注意事项
