1、QQ5D(R4)用于生物技术产品及生物 制品生产的细胞基质的来源和鉴定Q目录2.XXXXXX前言本指导原则的目的是对用于生产生物技 术产品及生物制品的人和动物细胞系、 微生物细胞系及其细胞库的制备和鉴定 建立合适的标准提供指导意见。本文件 还为申请产品上市时在这些方面应申报 哪些资料提出了建议。本指导原则涵盖了所有具备细胞库系统 的细胞基质。这里的“细胞基质”是指微生物细胞或来自于人或动物的细胞系， 它们具有生产供人类体内或体外使用的生物技术产品及生物制品的全部潜能。 体外诊断试剂不在本文件范围之内。目的目的范围范围2.XXXXXX前言基本原理基本原理由于细胞源性的生物制品存在外来污染的可能性
2、，用于制备 产品的细胞特性存在改变的可能性，重组DNA (rDNA)制品的质 量也与细胞基质中构建的表达载体有关。因此，细胞基质的特 性以及与之相关的事件将影响产品的质量和安全性。为有效地 控制产品质量，需对细胞基质操作的各方面进行适宜的控制。为确保制品的质量和安全性，需提供一份支持性文件，记载生 产生物技术产品及生物制品的细胞基质的历史，还应记载它们全部 或部分来源于母细胞系的历史，以便将细胞基质在研究和开发阶段 所发生的事件与生产制品所用的特定细胞基质相联系来全面评估其 风险。1. 细胞基质的来源、历史和产生1.1 细胞的来源应说明所用细胞基质的细胞来源，引证科学文献上的相关参考 资料。直
3、接从实验室获得的资料是首选的，如果没有这些资料，也 可以利用文献。1. 细胞基质的来源、历史和产生1.1 细胞的来源 对于人源细胞系，应提供原供体组织或器官的起源、人种和地理位置、年 龄、性别和一般的生理状况。如有材料，应将供体致病因子的检查结果与 健康状况或病史一并报告。特别是人二倍体成纤维细胞，由于供体的年龄 可能影响细胞系的体外寿命，应尽可能提供。 对于动物细胞系，应提供物种、品系、饲养条件、组织或器官的起源、地 理位置、年龄和性别、致病因子的检查结果以及原供体的一般生理状况。对于微生物细胞，应提供产生细胞系的物种、株和已知的遗传和表型特征。 如可能，还应提供其致病性、毒素产物和其他生物
4、危害方面的资料。1. 细胞基质的来源、历史和产生1.2 细胞的历史 应记录细胞的培养历史，包括最初分离细胞的方法、细胞体外培 养的方法以及建立细胞系的方法。还应提供所有对基因操作和筛 选的描述、细胞内源性和外源性因子的鉴别、特性和检测结果等 资料。 应保存用于开发细胞系的方法学资料。在细胞系的构建期间，会 采用包括细胞融合、转染、筛选、克隆分离、克隆、基因扩增和对特定培养条件或培养基的适应等方法中的一种或多种使细胞系 具有所需的特性。这些方法学资料有助于了解细胞系的详细历史。1. 细胞基质的来源、历史和产生1.3 细胞基质的产生对于重组产品，细胞系是指克隆自一个祖细胞且含有所需序列的 转染细胞
5、。对于非重组产品或非重组疫苗，细胞系是指来源于那些选择用作 制备主细胞库且未经进一步修饰的母细胞系的细胞。对源于杂交瘤的产品，细胞基质是指骨髓瘤母细胞系和其他母细 胞系融合后产生的杂交瘤细胞系，如免疫脾细胞。1. 细胞基质的来源、历史和产生1.3 细胞基质的产生对于重组产品，选择合适的母细胞系是关键的一步。母细胞系 通常是未转染的受体细胞系。建议采用经鉴定的母细胞库，但这不是必需的。特别是当多个细胞系产生于同一种母细胞系时，采用鉴 定的母细胞库能提供一套对主细胞库(MCB)进行质量评估的信息。比如，骨髓瘤细胞系可以作为母细胞系建立杂交瘤细胞系。1. 细胞基质的来源、历史和产生1.3 细胞基质的
6、产生关于细胞基质的产生，应提供详细的制备过程中接触的转染因 子。应提供培养基的组分，特别是提供关于人或动物来源的物质， 如血清、酶、水解产物或其他活细胞方面的资料。提供的资料还应 包括来源、制备和质控方法、检测结果和质量保证。还应提供上述 有关方面的文献。这些资料将用于详细分析外源因子来源的可能途 径，并作为制品风险-收益评估的一部分。1. 细胞基质的来源、历史和产生用连续传代培养的细胞生产生物技术产品及生物制品的最大优 点是每批产品都有一个经检定过的共同起源，即保存的细胞库。生 产商可制备自己的细胞库，也可从外部获得。生产商应对每个细胞 库进行检验，以确保其质量。2. 细胞库2. 细胞库二级
7、细胞库即主细胞库（MCB）传代产生 工作细胞库(WCB)，通常被认 为是在连续生产产品时细胞基 质供应的最实际方法。单级细胞库即仅建有MCB而没有WCB， 如果每年生产的产品仅需有限 的几支细胞时，这种情况原则 上也是允许的。2.1 细胞库系统2.1 细胞库系统MCB与WCB的区别MCB直接从最初的克隆或源于最初克隆的初级主细胞库中制得。对某些类型的细胞，不必从克隆制备细胞库(如二倍体细胞）。WCB来源于一支或多支MCB，WCB是直接用于生产的细胞。新制 备的WCB应通过鉴定和检测，以证明合格。MCB和WCB在诸如培养基组分和培养条件方面也许有差别，制备MCB和WCB的培养条件也许与产品生产时
8、不同。2. 细胞库2.1 细胞库系统在一些微生物表达系统中，对每批新细胞基质进行新的转化，这 种新的转化要使用经过彻底检验的宿主细胞库和质粒库，每次转化的 细胞基质库都要经过检验。这个转化的细胞基质库可被看作MCB， 它是生产用细胞基质的来源。宿主细胞库、质粒库和MCB都需用适 宜方法进行保存。因为细菌和酵母的转化通常是重复性好、操作容易， 不像转染后生动物细胞那样复杂，因此，这种经过改变的表达系统是符合要求的。生产商应提供有关宿主细胞、重组DNA分子(如质粒)、 转化及细胞建库的方法以及鉴定结果等方面的资料。2. 细胞库2.2 细胞建库的步骤 细胞建库通常是逐步增加容器数量或扩大容器培养以获
9、得足够量的细胞，并 将其分装到足够量的容器中。为确保每个容器中的内容物完全一致，如培养 细胞采用多个器皿的，应把所有培养器皿中的细胞混合再分装。将悬浮在培养基中的一批细胞，定量分装到无菌容器中并在适宜条件下密封 和贮藏。例如，含有细胞冻存剂的培养基中的动物细胞，在规定和控制的条 件下，分装到密封容器中冷冻，然后转移到液氮中或在相当的超低温条件下 保存。其他的保存和贮藏方法也是可用的，但要根据细胞的性质而定。总之， 应使细胞保持一定的生存能力，来满足生产及产品一致性的要求。2. 细胞库2.2 细胞建库的步骤 生产商应说明所用建库系统的类型、细胞库的大小、所用的容器和密闭 系统，制备细胞库的方法，
10、包括所用的冻存剂、培养基以及细胞保存和 贮藏的条件。生产商应阐明避免微生物污染和实验室中其他类型细胞交叉污染的方法。 还应介绍可追踪细胞库容器的方法，包括记录系统，以及能经受保存、 贮藏和复苏而不会丢失的容器标签。2. 细胞库2.2 细胞建库的步骤注意事项避免被污染的细胞基质（或细胞库）用于生产是十分重要的， 否则，由于受污染的细胞库不能使用，必须重新生产细胞库，这将 延误产品上市或开发的时机。应该认识到没有哪一种细胞库检测方 案能检测出所有可能潜在的污染。因此，只有在细胞建库期间采取 预防措施，才能确保细胞不被污染，为生产提供可靠的细胞基质。3. 细胞库2.2 细胞建库的步骤注意事项为确保持
11、续正常生产，生产商应采取预防措施，防止如火灾、 断电和人为错误等事故的发生而造成的细胞库不能用于生产。生产 商应提供预防计划，例如，在多个冷藏罐中分别保存细胞库，使用 备用电源，使用自动液氮填充系统，将部分MCB和WCB保存在较远 的场所，及MCB的再生等。2. 细胞库2.2 细胞建库的步骤注意事项在生产中体外细胞的寿命应从解冻一个或多个容器MCB开始算 起。对于二倍体细胞系，其体外寿命应以细胞的倍增水平估算，还 应检测二倍体细胞发生衰老时的细胞倍增水平。2. 细胞库3. 细胞库鉴定和检测的一般原则对建库细胞基质的鉴定和检测是生物技术产品及生物制品质量 控制的重要组成部分。通过对MCB的鉴定，
12、生产商可评估是否存在 来自其他细胞系的细胞、外源和内源因子以及其他污染物。检测的 目的是为了证实用于生产的细胞基质的特性、纯度和适用性。在有 些情况下，其他方面如致癌性或细胞核学的检测也是有用的。对某一细胞基质选择何种检测方案要根据细胞的生物学特性（如生长的需求）、培养历史（包括人源和动物源性生物试剂的使用）以及可应用的试验方法而定。细胞基质的鉴定程度将影响以后的生产阶段所需的常规检测的类型或水平。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则生产商应对每个MCB作一次纯度试验和鉴别实验，对将要注册的 每一产品在细胞培养期间作一次稳定性试验。生产商应对每一个WCB作纯度检测和必要的鉴别试验。申请人应参考IC
13、H指导原则中有关病毒安全性方面的内容，进行 有关试验并在申请制品上市时将试验内容和试验结果一并上报。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则对于含有外源构建表达载体的细胞系，应参照ICH指导原则中有 关rDNA表达载体方面的内容，进行核苷酸和氨基酸序列方面的鉴定。 也可用类似的方法对基因序列明确并已鉴定的某些非重组DNA来源的细胞系的编码序列进行检测。但是，没有必要对那些编码复杂的 天然产品序列进行分析，如相关的基因产品系列、微生物疫苗抗原 或来自于杂交瘤的单克隆抗体。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则 如果条件具备，应鼓励生产商在细胞基质鉴定和检测中使用先进 方法和技术改进，但新方法的特异性、灵敏度和
14、精密度至少应与 现有方法相当。如果理由充分，生产商也可选择对WCB进行鉴定，而不是MCB。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则应采用合适的试验证明建库的细胞就是它本身。鉴别试验可利 用细胞的表型或遗传型特征，但不必作所有的试验。通常对MCB作 鉴别试验，而对每个WCB仅作有限的鉴别试验。3.1 鉴别试验3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.1.1 鉴别试验后生动物细胞对于贴壁生长的人或动物细胞，可采用形态学分析与其他试验相结合的 方法。在大多数情况下，同工酶分析足以确证人或动物细胞库的种属来源； 依据细胞系的历史情况，可采用其他合适的试验。对于种族来源亦可用其他 替代技术予以确认，如用染色体条带分析
15、或种属特异性抗血清的方法。替代 方法可显示其独特的标志物。例如，通过使用染色体细胞遗传学来检测独特 的标记染色体，或用DNA分析来检测基因组多态性。只要能确证其起源物种 或某种已知细胞系独特性标记物的存在，就可认为是适宜的鉴别试验方法。 目标产品的表达可作为鉴别试验的一种补充手段。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则对于大多数微生物细胞，分析细胞在选择性培养基上生长情况就可用 以确证宿主细胞库的宿主细胞种属特性。对于大肠杆菌，由于有许多不同 的株，可考虑采用生物学鉴别方法，如噬菌体分类，作为鉴别试验的补充。 对于质粒库，可按ICH文件中有关表达载体分析的内容进行特性评估。目 标产品的表达也可用以确
16、证微生物表达系统的特性。3.1.2 鉴别试验微生物细胞3. 细胞库鉴定和检测的一般原则评估MCB和WCB的生物学纯度，即游离的外源微生物和外源细 胞污染，是细胞开发和建库的关键部分。在设计和进行这些试验时， 应考虑选择性试剂和抗生素对检测外源微生物污染的影响。3.2 纯度检测3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.2.1 纯度检测后生动物细胞 生物负荷检测： 应采用MCB和WCB的单一容器（容器总数的1%，但不少于2个）检测生物 负荷（细菌和真菌）的存在。目前在欧洲药典、日本药局方或美国药典所 记载的用于测试微生物限度或无菌试验的方法也是适用的。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.2.1 纯度检测
17、后生动物细胞 支原体检测： 应检测MCB和WCB是否存在支原体。目前所用的琼脂和肉汤培养基的方法 以及指示剂细胞培养法是适用的。用于支原体测试的方法在欧洲药典、日本 药局方和FDA “用于生产生物制品的细胞系鉴定的考虑要点”一文中都有记 载。仅用1支MCB或WCB来源的细胞进行测试就可以了。对于非哺乳动物细 胞系，供选择的测试方法或条件应适当，采用哪种方法，生产商应咨询当地 国家或地区的管理机构。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.2.1 纯度检测后生动物细胞 病毒检测： 对于细胞基质中可能污染病毒的检测，应根据细胞系的培养史，通过筛选和 相关的特异性试验，选用可检测广谱病毒的方法。申请人应就
18、病毒安全性问 题参考ICH指南，对于那些尚未在该指南中涉及的产品类别，可参考WHO 关于使用动物细胞的有关资料。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.2.1 纯度检测后生动物细胞 细胞交叉污染检测： 细胞基质的纯度会由于污染相同或不同种系的细胞而降低。选择什么样的纯 度试验方法取决于该细胞存在被何种细胞系交叉污染的可能。有时，在同一 实验室会同时培养几种不同的细胞系，在细胞建库过程中，当进行开放性操 作时，应注意避免与其他细胞系同时开放操作而导致交叉污染。在建库的开 放性操作过程中，只要在此操作间有另一种细胞系存在，就应检测该细胞库 细胞中是否污染了另一种细胞系的细胞。在鉴别试验中介绍的细胞特性
19、的检 测方法一般也可用于检测是否与其他细胞系存在交叉污染。另外，从细胞基 质中成功地制得预期产品是说明无交叉污染的另一种旁证。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.2.2 纯度检测微生物细胞在设计检测微生物细胞库中外源微生物因子和外源细胞污染的特异性 试验方法时，应考虑以下问题：建库细胞的性质、科技文献中报道的可能 存在的污染、用于细胞培养的细胞来源、方法和材料以及存在于建库实验 室中的其他生物等等。例如，可考虑采用几种微生物培养基对该微生物细 胞进行培养，其中有些培养基可使细胞生长，有些则不能，培养后采用目 视法对分离的菌落进行鉴定，就可以判断是否有其他微生物污染。3. 细胞库鉴定和检测的一般
20、原则3.3 细胞基质的稳定性细胞鉴定的另一个目的是考察细胞在生产中的适用性。细胞基 质稳定性主要应考虑两个方面，即生产产品的一致性和贮存在规定条件下的细胞能否维持其生产能力。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.3 细胞基质的稳定性 生产产品的一致性 生产产品的一致性是对细胞基质进行评估的主要内容。用于此类评估 的试验类型和试验项目将根据细胞基质的性质、培养方法和所生产的 产品而定。对于含有重组DNA表达载体的细胞系，在其培养达到或超 过体外代次限度时，应通过核酸检测或产品分析，对表达载体上编码 序列的一致性进行验证。对于非重组细胞系，在生产中细胞培养达到 或超过体外代次限度时，应通过核酸检测或
21、纯化蛋白质制品的分析验 证其蛋白质编码序列没有改变。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.3 细胞基质的稳定性如果产品不能按上述方法进行分析，则其他特征诸如形态学特性、生 长特性、生化标志、免疫标志、对预期产品的生产能力或其他相关的 表型或遗传标志等都可用于评估细胞基质的稳定性。在某些情况下， 当无法将MCB细胞的特性直接与达到或超过细胞体外代次限度的生产用细胞比较时，可将生产最初阶段的细胞与达到或超过细胞体外代次 限度的生产用细胞进行特性比较。某些指标，如氧或葡萄糖的消耗量、 氨或乳酸的产率可用于这类检测。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.3 细胞基质的稳定性贮存细胞的生产能力在规定的贮藏条
22、件下，建库细胞的稳定性一般需通过生产临床试验 用样品来验证。当储存的细胞复苏生产临床试验用样品时，对细胞活力的测定数据可证明这些复苏细胞在储存过程中仍然保持活力， 可证实复苏细胞能用于生产所需的产品。以上这些资料需纳入到申 报资料中去，并附上对建库细胞稳定性监测的方案。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.3 细胞基质的稳定性 评估培养期间的稳定性，至少应考察两个时间点。一个时间点是 采用最少传代数的细胞，另一个时间点是申请上市的生产中达到 或超过细胞体外传代限度的细胞。 用于生产的细胞体外传代限度应根据从中试生产规模或生产规模 的细胞扩增代数到建议或超过建议的生产代次限度所得的资料来 确定。如
23、果要延长用于生产的细胞的体外代次限度，应有体外代 次已达到所建议的新限度的研究资料支持。对于二倍体细胞，应 提供拟用于生产条件下的WCB细胞体外有限代次的资料。细胞基质稳定性的验证通常在每个产品上市申请时进行一次。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.4 细胞核学和致瘤性试验根据细胞类型、产品的性质以及生产工艺，决定是否有必要采 用细胞核学和致瘤性试验来评价二倍体细胞系的安全性或鉴定一个 新的细胞系。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.4 细胞核学和致瘤性试验需要做细胞核学和致瘤性试验的情况： 对不能去除活细胞或几乎无下游纯化工艺（如一些传统的活病毒 疫苗）的制品需要做细胞基质的细胞核学和致瘤性
24、试验。用于非 纯化制品的新细胞基质，是否需进行致瘤性试验和染色体分析， 应具体情况具体分析。用已知是致癌的或具有异常细胞核的细胞 系生产含有细胞或未高度纯化的制品时，应在每个产品申报时进 行风险-收益的评估。对于新建的或之前未经鉴定的二倍体细胞，应采用MCB细胞证实 其具有二倍体细胞的细胞核，并确认其潜在的致瘤性。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.4 细胞核学和致瘤性试验不需要做细胞核学和致瘤性试验的情况： 啮齿类动物细胞系或已知为非二倍体的新细胞系不需要作细胞核 学测定，因细胞遗传学分析足以评估细胞基质的特性或纯度。对 文献已记载具有致瘤性的细胞不需重复进行致瘤性试验。 对于高度纯化和不含
25、细胞的制品，只要通过生产工艺验证或通过 批签发检测，表明残留的宿主细胞DNA符合限度要求，通常也不 必进行细胞核学和致瘤性试验。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则3.4 细胞核学和致瘤性试验不需要做细胞核学和致瘤性试验的情况： 用未进行遗传修饰的MRC5或WL-38细胞生产时，不必对这些细 胞进行细胞核学或致瘤性的鉴定，因为对这些细胞系已作了大量 的鉴定工作，并有文献发表。但是，对于每个MRC-5或WI-38的 WCB，生产商应再确认生产用细胞的生长方式符合二倍体细胞的 特点，并具有所预期的代次。3. 细胞库鉴定和检测的一般原则以上指导原则适用于鉴定过的建库细胞制备的生物技术产品及 生物制品。然
26、而，也有许多生物制品尤其是一些病毒疫苗是采用原 代细胞制备的。由于原代细胞是原始组织分离后的第一代细胞，因此不必像鉴 定建库细胞那样在生产之前对其进行全面鉴定。此外，用原代细胞 生产的生物制品通常不进行深加工处理（如纯化）。尽管存在着这 些不同，但对原代细胞基质进行安全性和适用性的检测方法在很多 方面与前文以及其他指南中所介绍的方法类同。4. 原代细胞基质原代细胞生产的生物制品在申请上市时所需提供的与细胞基质 有关的资料，包括三大类：(1) 有关原代细胞的组织来源及用于制备原代细胞基质的动物源性原 材料的资料；(2) 有关原代细胞制备的资料；(3) 为保证制品安全性对原代细胞进行检测的资料。4
27、. 原代细胞基质4.1 组织来源和其他原材料应提供制备原代细胞所用组织来源的动物资料。这些组织通常 取自健康、并经兽医和实验室检测证明无致病因子的动物。如有可 能，供体动物应从封闭的、无特殊病原体的群体中获得。已用于实 验研究的动物不能作为供体。用于制备细胞之前的某个适当时期， 应对动物进行检疫。应提供用于制备原代细胞基质的原材料及组成成分的资料，包 括人和动物源性的所有试剂的特征、来源，以及对动物源性成分证 明检测不出污染物和外源因子的检测方法和结果。4. 原代细胞基质应提供从组织分离细胞、建立原代细胞并维持其培养的方法。4.2 原代细胞基质的制备4. 原代细胞基质4.3 原代细胞基质的检测
28、应提供对原代细胞基质检测的资料以证明其用于生产是合格的。 原代细胞在应用之前不必对其性质作全面的检测和鉴定。细胞基质 的外源因子检测可与生产过程同时进行：包括在生产前、中、后期 对生产的培养物或非感染的对照细胞培养物进行观察；在生产的培 养液或非感染的对照培养液中分别加入各种敏感的指示细胞培养液， 该培养液能检测一定范围的相关病毒，然后检查其细胞病变及血吸 附病毒。必要时，还要用其他方法检查特殊因子，如相关的逆转录 病毒。4. 原代细胞基质小结本讲对用于生产生物技术产品及生物制品的人和动物细胞系、微生物细 胞系及其细胞库的制备和鉴定提供了指导意见，并为申请产品上市时在这些 方面应申报哪些资料提出了建议。本讲主要从细胞基质的来源、历史和产生，细胞库的建库方法、细胞库 鉴定和检测的一般原则，以及原代细胞生产生物制品所需的申请资料四个方 面来介绍对用于生物技术产品及生物制品生产的细胞基质的管理要求。谢谢你的观看谢谢你的观看
