1、原生质体培养方法原生质体培养方法液体浅层培养固-液体双层培养固体平板培养琼脂糖珠培养l 液体浅层培养液体浅层培养: :Liquid thin layer cultureLiquid thin layer culture将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养口后进行培养优点：优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物新鲜培养基和转移培养物缺点：缺点：原生质体分布不均匀，常发生原生质体粘连现原生质体分布不均匀，常发生原生质体粘连现象而影响其进一步生长和发育；难以跟踪观
2、察某一个象而影响其进一步生长和发育；难以跟踪观察某一个细胞的发育情况；一旦污染，全皿报废细胞的发育情况；一旦污染，全皿报废l 固体平板培养固体平板培养: :Solid cultureSolid culture固体培养也就是琼脂糖包埋培养。低融点琼脂糖可在固体培养也就是琼脂糖包埋培养。低融点琼脂糖可在3030C C左右融化与原生质体混合而不影响原生质体的生左右融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿命活动。混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养底部，封口后进行培养优点：优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于可以跟踪观察单个原
3、生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率统计原生质体分裂频率缺点：缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必须操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必须合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀l 液体固体双层培养液体固体双层培养: :Liquid solid cultureLiquid solid culture即在培养皿底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生即在培养皿底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面质体悬浮液滴于固体培养基表面优点：优点：固体
4、培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性培养基，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成原生质体的分裂和细胞团的形成缺点：缺点：不易观察细胞的发育过程不易观察细胞的发育过程Semi-permeable membrane on solid mediumSemi-permeable membrane enhances embryo regeneration in citrus protoplast c
5、ulturel 琼脂糖珠培养琼脂糖珠培养: :Agarose bead cultureAgarose bead culture将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约5050l l一滴的量滴于直径一滴的量滴于直径6 6 cmcm的培养皿，待其固化后向的培养皿，待其固化后向其中添加其中添加3 3mlml液体培养基并于摇床上低速旋转培养液体培养基并于摇床上低速旋转培养( (ThompsonThompson等，等，1986)1986)。培养过程中，通过调整液体培培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步养基的渗透压来调节培
6、养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成成原生质体发育与植株再生原生质体发育与植株再生细胞壁再生细胞分裂与生长愈伤组织形成植株再生1. 1. 细胞壁再生细胞壁再生原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整细原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整细胞壁胞壁新合成的细胞壁可用新合成的细胞壁可用0.10.1荧光增白剂（荧光增白剂（CalcofluorCalcofluor）染色后在荧光显微
7、染色后在荧光显微镜下观察，可见到绿色荧光围绕细胞表面，证明细胞壁已形成。也可用高渗镜下观察，可见到绿色荧光围绕细胞表面，证明细胞壁已形成。也可用高渗溶液产生质壁分离的方法、电子显微镜观察技术和冰冻蚀刻法等进行再生细溶液产生质壁分离的方法、电子显微镜观察技术和冰冻蚀刻法等进行再生细胞壁的研究胞壁的研究原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，之后在质的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，之后在质膜与片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐
8、渐形成不定向的纤维团，最后膜与片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁形成完整的细胞壁只有能形成完好细胞壁的再生细胞才能进入细胞分裂阶段只有能形成完好细胞壁的再生细胞才能进入细胞分裂阶段2. 2. 细胞分裂和生长细胞分裂和生长原生质体培养数天后，胞质增加，细胞器增殖，原生质体培养数天后，胞质增加，细胞器增殖，RNARNA、蛋蛋白质及多聚糖合成增加，不久即可发生核的有丝分裂及胞白质及多聚糖合成增加，不久即可发生核的有丝分裂及胞质分裂质分裂原生质体一般培养原生质体一般培养2 27 7 d d开始第开始第1 1次分裂，但第次分裂，但第1 1次分裂的次分裂的时间随
9、植物种类、分离原生质体的材料、原生质体质量、时间随植物种类、分离原生质体的材料、原生质体质量、培养基成分和培养条件而异培养基成分和培养条件而异用幼苗下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞、未成熟种用幼苗下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞、未成熟种子的子叶等分离原生质体，一般比用叶肉分离原生质体容子的子叶等分离原生质体，一般比用叶肉分离原生质体容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快3. 3. 愈伤组织形成愈伤组织形成 1）多数情况下，原生质体培养多数情况下，原生质体培养2 2周后，周后，可形成多细胞团，可形成多细胞团，3周后形成肉眼可周后形成肉眼可见的小细胞团，见
10、的小细胞团，5-6周后形成直径周后形成直径1 1 mm的小愈伤组织的小愈伤组织 2）原生质体培养原生质体培养15-20 0天后，需要及天后，需要及时添加新鲜培养基，同时降低渗透压，时添加新鲜培养基，同时降低渗透压，否则细胞团不会继续生长。待小愈伤否则细胞团不会继续生长。待小愈伤组织长至组织长至1 1 -2mm时，应及时转移至时，应及时转移至固体培养基使其进一步生长固体培养基使其进一步生长 4. 4.植株再生植株再生原生质体培养再生的愈伤组织可直接转移到分化培养基，一步成苗原生质体培养再生的愈伤组织可直接转移到分化培养基，一步成苗（器官发生）。愈伤组织也可通过体细胞胚发生，先形成胚状体，再（器官
11、发生）。愈伤组织也可通过体细胞胚发生，先形成胚状体，再诱导生芽、生根。不同植物种属，其再生方式不同诱导生芽、生根。不同植物种属，其再生方式不同仙客来原生质体的再生仙客来原生质体的再生香蕉原生质体再生香蕉原生质体再生Assani等等2006看护培养看护培养Sugarbeet （糖糖甜菜）甜菜）callus and protoplast regeneration影响原生质体培养的主要因素影响原生质体培养的主要因素 p 基因型基因型 番茄与秘鲁番茄有性杂交后性状分离的遗传分析表明，其愈伤组番茄与秘鲁番茄有性杂交后性状分离的遗传分析表明，其愈伤组织再生能力受织再生能力受2 2个显性基因决定个显性基因决
12、定( (KoornneefKoornneef等等1987)1987)。ChengCheng和和Veilleux(1991)Veilleux(1991)对芙薯对芙薯( (S. phureja)S. phureja)原生质体培养能力进行遗传原生质体培养能力进行遗传分析，证明从原生质体培养到形成愈伤组织受分析，证明从原生质体培养到形成愈伤组织受2 2个独立位点的显个独立位点的显性基因控制性基因控制( (ChengCheng等等1991)1991) DuditsDudits等（等（19911991）以苜蓿不同基因型深入研究，表明某个基因型）以苜蓿不同基因型深入研究，表明某个基因型在离体培养时难以形成体
13、细胞胚。若将对激素调节有作用的发根在离体培养时难以形成体细胞胚。若将对激素调节有作用的发根农杆菌农杆菌rolrolB B和和rolrolC C基因引入并表达，可能促使其体细胞胚形成基因引入并表达，可能促使其体细胞胚形成p 原生质体来源原生质体来源 供体材料类型：供体材料类型：向日葵幼叶、子叶和下胚轴原生质体培养，只有下胚轴向日葵幼叶、子叶和下胚轴原生质体培养，只有下胚轴原生质体培养得到了细胞团和体细胞胚，而幼叶和子叶原生质体均未获得成原生质体培养得到了细胞团和体细胞胚，而幼叶和子叶原生质体均未获得成功功 供体细胞的分化程度：供体细胞的分化程度：同一个基因型的植株生长在不同的环境条件下，同一个基
14、因型的植株生长在不同的环境条件下，其生理状态会有改变。供试植株最好生长在控制条件下，以提高原生质体的其生理状态会有改变。供试植株最好生长在控制条件下，以提高原生质体的细胞分裂频率和再生能力，并且可提高实验重复性细胞分裂频率和再生能力，并且可提高实验重复性 柑橘：柑橘：叶肉原生质体无论单独培养还是共培养均不能再生，只有胚性愈叶肉原生质体无论单独培养还是共培养均不能再生，只有胚性愈伤组织来源的原生质体才能再生伤组织来源的原生质体才能再生p 起始培养密度与培养基起始培养密度与培养基起始培养密度：适宜密度为起始培养密度：适宜密度为1-51-510105 5/ /mlml 培养基激素水平：培养基激素水平
15、：柑橘不添加外源激素，也可再生柑橘不添加外源激素，也可再生培养基营养成分完全性：培养基营养成分完全性：越丰富越好越丰富越好Protoplast density counting25格格16格（格（0.1mm3）的血球计数板计算公式：）的血球计数板计算公式：原原生质体细胞数生质体细胞数 / ml = 80小格（左上、右上、左下、右下、中小格（左上、右上、左下、右下、中5 5个中格）个中格）内原生质体细胞个数内原生质体细胞个数/ /80 400 104 稀释倍数稀释倍数1ml=1cm3=1000mm3三、原生质体再生植株遗传及变异三、原生质体再生植株遗传及变异 染色体变异染色体变异植株性状变异植株
16、性状变异染色体变异染色体变异 染色体倍性变异是原生质体再生植株的常见变异类型染色体倍性变异是原生质体再生植株的常见变异类型 原生质体再生植株的倍性与分离原生质体的起始材料有关原生质体再生植株的倍性与分离原生质体的起始材料有关 由茎尖、叶肉和胚性组织细胞分离的原生质体能较好保持原来的由茎尖、叶肉和胚性组织细胞分离的原生质体能较好保持原来的倍性倍性 用悬浮培养细胞，特别是长期继代培养的细胞系分离的原生质体用悬浮培养细胞，特别是长期继代培养的细胞系分离的原生质体，较易出现染色体倍性及数目的变化，较易出现染色体倍性及数目的变化 GrosserGrosser等（等（19841984）报道，由三叶草叶肉原
17、生质体再生的植株为二）报道，由三叶草叶肉原生质体再生的植株为二倍体（倍体（2 2n=16n=16），），而由培养细胞分离的原生质体再生的植株为四倍而由培养细胞分离的原生质体再生的植株为四倍体（体（2 2n=32n=32）l原生质体再生植株变异还与植物种类有关：原生质体再生植株变异还与植物种类有关：马铃薯易变马铃薯易变，柑橘不易变，柑橘不易变植株表型变异与育种植株表型变异与育种 原生质体再生植株表型变异：原生质体再生植株表型变异：包括植物学性状、抗性包括植物学性状、抗性变异、育性变异、育性/ /果实无核、成熟期等果实无核、成熟期等 变异程度的大小与起始材料及培养过程中产生的变异程度的大小与起始材料及培养过程中产生的变异有关变异有关 原生质体再生植株变异可为体细胞遗传学研究和原生质体再生植株变异可为体细胞遗传学研究和品种改良提供有益的材料品种改良提供有益的材料 从原生质体培养再生植株已选育一些新品种从原生质体培养再生植株已选育一些新品种（体细（体细胞突变育种）胞突变育种）
