1、(Molecular Luminescence Analysis)第第6章章 分子发光分析法分子发光分析法第第6章章 红外吸收光谱法红外吸收光谱法 6.1 荧光分析法荧光分析法 6.2 磷光分析法磷光分析法6.3化学发光分析法化学发光分析法Molecular Fluorescence AnalysisMolecular phosphorescence Analysis 分子发光：分子发光：处于基态的分子吸收能量处于基态的分子吸收能量( (电、热、化学和光能等电、热、化学和光能等) )被激发至激发态，被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，
2、此种现象称为出光子，此种现象称为发光发光。 发光分析发光分析包括荧光、磷光、化学发光、包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。生物发光等。物质吸收光能后所产生的光物质吸收光能后所产生的光辐射称之为辐射称之为荧光和磷光荧光和磷光。Molecular Fluorescence Analysis 一、概述一、概述 分子荧光分析法是分子荧光分析法是根据物根据物质的分子荧光光谱进行定性，质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分以荧光强度进行定量的一种分析方法。析方法。 6.1 荧光分法荧光分法分子发光光谱分子发光光谱 分子发光光谱分子发光光谱包括荧光光谱、磷光光谱和包括荧光光谱、磷光光谱和化学
3、发光光谱。化学发光光谱。 荧光和磷光为荧光和磷光为光致发光光致发光，是物质的基态分子，是物质的基态分子吸收一定波长范围的光辐射激发至吸收一定波长范围的光辐射激发至单重单重激发态，激发态，当其由激发态回到基态时产生的二次辐射。当其由激发态回到基态时产生的二次辐射。 荧光荧光由单重激发态向基态跃迁产生。由单重激发态向基态跃迁产生。 磷光磷光由单重激发态先过渡到三重激发态，然由单重激发态先过渡到三重激发态，然后由三重激发态向基态跃迁向基态跃迁产生。后由三重激发态向基态跃迁向基态跃迁产生。 化学发光化学发光是化学反应物或反应产物受反应释是化学反应物或反应产物受反应释放的化学能激发而产生的光辐射。放的化
4、学能激发而产生的光辐射。当当n, L, S三个量子数确定之后，原子能级三个量子数确定之后，原子能级就基本确定了。就基本确定了。用用n、L、S三个量子数描述原子能级的光三个量子数描述原子能级的光谱项（谱项（n2S+1L）。）。L与与S相互作用，可产生相互作用，可产生2S+1个能级稍微个能级稍微不同的分裂，是产生光谱多重线的原因。不同的分裂，是产生光谱多重线的原因。 M=2S+1叫做谱线的叫做谱线的多重性多重性。习惯上将多重性为习惯上将多重性为1、2、3的光谱项分别的光谱项分别称为称为单重态、双重态、三重态单重态、双重态、三重态。光谱项与光谱支项光谱项与光谱支项荧光分析的特点：荧光分析的特点：灵
5、敏 度 高 ：灵 敏 度 高 ： 视 不 同 物 质 ， 检 测 下 限 在视 不 同 物 质 ， 检 测 下 限 在0.1 0.001 g/mL之间。比之间。比UV-Vis的灵敏度高得的灵敏度高得多。多。 选择性好：选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。定性。结构信息量多：结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。光强、荧光量子效率、荧光寿命等。应用不广泛：应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧普遍性、增强荧光的方法有限、外界
6、环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。紫外可见分光光度法的特点紫外可见分光光度法的特点(一一) 灵敏度高灵敏度高 吸光光度法测定物质的浓度下限吸光光度法测定物质的浓度下限(最最低浓度低浓度)一般可达一般可达110-3 %的微量组分的微量组分。对固体试样一般可测到对固体试样一般可测到10-4 10-5%的痕的痕量组分。如果对被测组分事先加以富集，量组分。如果对被测组分事先加以富集，灵敏度还可以提高灵敏度还可以提高1-2个数量级。个数量级。二、基本原理二、基本原理 (一一) 分子荧光的产生分子荧光的产生 处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，处于
7、分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃这种跃迁是迁是符合光谱选律的符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。 在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗
8、磁性，其激发态的平均寿命大约为有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s; 而三重态分而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-41s以上以上(通常通常用用S和和T分别表示单重态和三重态分别表示单重态和三重态)。 根据量子力学的原理，电子的跃迁不能在任根据量子力学的原理，电子的跃迁不能在任意两个能级之间进行，而必须遵循一定的意两个能级之间进行，而必须遵循一定的“选择选择定则定则”，这个定则是，这个定则是 L=1，S=0，J=0，1，但当，但当 J=0 时，时，J=0 的跃迁是不允许的。的跃迁是不允许的。 不符合光谱选择定则的跃迁叫禁戒跃迁。不符合光谱
9、选择定则的跃迁叫禁戒跃迁。若若两光谱项之间为禁戒跃迁，处于较高能级的原子两光谱项之间为禁戒跃迁，处于较高能级的原子具有较长的寿命，原子的这种状态称为具有较长的寿命，原子的这种状态称为亚稳态。亚稳态。光谱选择定则光谱选择定则基态：基态：电子自旋配对，电子自旋配对，多重度多重度=2s+1=1，为单，为单重态，以重态，以S0表示。表示。激发单重态：激发单重态：分子吸收能分子吸收能量，电子自旋仍然配对，量，电子自旋仍然配对，为单重态，称为激发单为单重态，称为激发单重态，以重态，以S1，S2表示表示激发三重态：激发三重态：分子吸收能分子吸收能量，电子自旋不再配对，量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发
10、三为三重态，称为激发三重态，以重态，以T1，T2.表示。表示。三重态能级低于单重三重态能级低于单重态态(Hund规则规则)图图6.1 分子内的光物理过程分子内的光物理过程 处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛包括振动弛豫豫(VR)、内部转移、内部转移(IR)、系间窜跃、系间窜跃(IX)及外部转及外部转移移(EC)等，
11、等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。境等因素有关。（二）（二） 去活化过程去活化过程(Deactivation) 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括：跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括：1)振动弛豫振动弛豫(Vibrational Relaxation，VR) 在液相或压力足够高的气相中，在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热处于激发态的分子因碰撞将能量以热
12、的形式传递给周围的分子，从而从高的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，振动能层失活至低振动能层的过程，称为称为振动弛豫振动弛豫。荧光、磷光荧光、磷光 能级图能级图 振动弛豫振动弛豫 S0S1S2T1吸光吸光 1吸光吸光 2振动弛豫振动弛豫 在同一在同一电子能级中，电子能级中，电子由高振电子由高振动能级转至动能级转至低振动能级，低振动能级，而将多余的而将多余的能量以能量以热热 的形式发出。的形式发出。2)内转化内转化( Internal Conversion，IC ) 对于具有相同多重度的分子，若对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子较高电子能级
13、的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。S0S1S2T1吸光吸光 1吸光吸光 2内转移内转移荧光、磷光荧光、磷光 能级图能级图3)荧光发射荧光发射 处于第一激发单重态处于第一激发单重态(S1)的电子跃迁至的电子跃迁至基态各振动能级基态各振动能级(S0)时，将得到最大波长为时，将得到最大波长为 3的荧光。的荧光。 注意：注意： 基态中也有振动驰豫跃迁。基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，很明显， 3的波长较激发波长的波长较激发波长 1或
14、或 2都长，而且不论都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为发射出波长为 3的荧光。的荧光。荧光的产生在荧光的产生在10-7-10-9s内完成。内完成。S0S1S2T1吸光吸光 1吸光吸光 2荧光荧光 3荧光荧光4)系间窜跃系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁，指不同多重态间的无辐射跃迁，例如例如S1T1就是一种系间窜跃。通常，就是一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由发生系间窜跃时，电子由S1的较低振的较低振动能级转移至动能级转移至T1的较高振动能级处。的较高振动能级处。 有时，通过热激发，有可能发生有时，通过热激发，有可能发生T
15、1S1，然后由，然后由S1发生荧光。发生荧光。这是产生这是产生延迟荧光的机理。延迟荧光的机理。 荧光、磷光荧光、磷光 能级图能级图S0S1S2T1吸光吸光 1吸光吸光 2荧光荧光 3系间窜跃系间窜跃5)外转换外转换(External Conversion，EC) 受激分子与溶剂或其它溶质分子受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭熄灭”或或“猝灭猝灭”。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越系间窜越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量l 2l 1l 3
16、 外转换外转换l 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫（三（三 ）荧光效率及其影响因素）荧光效率及其影响因素 荧光量子产率荧光量子产率(荧光效率或量子效率荧光效率或量子效率)，它表，它表示物质发射荧光的能力，常用下式表示。示物质发射荧光的能力，常用下式表示。激发态分子总数发荧光的分子数荧光效率)(f或或 = 发射荧光量子数发射荧光量子数 / 吸收荧光量子数吸收荧光量子数 。 在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移、系间窜跃辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移、系间窜跃和外转移等。和外转移等。很明显，荧光的量子产率，将与上很明显，荧
17、光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。述每一个过程的速率常数有关。若用数学式来表达这些关系，得到若用数学式来表达这些关系，得到 = kf /(kf+ ki) 式中式中: kf为荧光发射过程的速率常数，为荧光发射过程的速率常数， ki为其它有关过程的速率常数的总和。为其它有关过程的速率常数的总和。 凡是能使凡是能使kf 值升高而使其它值升高而使其它ki值降低的因素，值降低的因素，都可增强荧光。都可增强荧光。 实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接近其量子产率在某些情况下接近1，说明，说明 ki很小，很小，可以忽略不计。可以忽略不
18、计。 一般来说，一般来说，kf主要取决于化学结构，而主要取决于化学结构，而 ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。磷光的量子产率与此类似。关。磷光的量子产率与此类似。 分子产生荧光必须具备两个条件：分子产生荧光必须具备两个条件： 分子必须具有与所照射的辐分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发射频率相适应的结构，才能吸收激发光；光； 吸收了与其本身特征频率相吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。量子产率。(1)跃迁类型跃迁类型 对于大多数荧光物质：对于大多数荧光物质：
19、首先，首先，经历经历 或或n 激发，然激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生发生 或或 n跃迁而得到荧光。在跃迁而得到荧光。在这两种跃迁类型中，这两种跃迁类型中， 跃迁常能发出跃迁常能发出较强的荧光较强的荧光( 较大较大)。这是由于。这是由于 跃迁跃迁具有较大的具有较大的 (一般比一般比n 大大100-1000倍倍)。 其次，其次， 跃迁的寿命约为跃迁的寿命约为10-710-9 s，比比n 跃迁的寿命跃迁的寿命10-510-7s要短。要短。在各种跃在各种跃迁过程的竞争中，它是有利于发射荧光的。迁过程的竞争中，它是有利于发射荧光的。 此外，此外，在在跃迁
20、过程中，通过系间窜跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的速率常数也较小。跃至三重态的速率常数也较小。(S1T1能级差较大能级差较大)，这也有利于荧光的发射。，这也有利于荧光的发射。 总之，总之， 跃迁是产生荧光的主要跃迁跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。类型。(2)共轭效应共轭效应 容易实现容易实现 激发的芳香族化合物容易发激发的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少极少(仅少数高度共轭体系化合物除外仅少数高度共轭体系化合物除外)。此外，。此外，增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。 例如：在多烯
21、结构中，例如：在多烯结构中，Ph(CH=CH)3 Ph和和Ph(CH=CH)2 Ph在苯中的在苯中的 分别为分别为0.68和和0.28。 共轭效应使荧光增强的原因共轭效应使荧光增强的原因 ： 主要是由于增大荧光物质的主要是由于增大荧光物质的 ，有利于产生，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。(3)刚性平面结构刚性平面结构 多数具有刚性平面结构的有机多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。分子具有强烈的荧光。因为这种结因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减溶剂或其它溶质分子的
22、相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。少，也就减少了碰撞去活的可能性。(4)取代基效应取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。给给电子基团，如电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2 、 -NR2等，等，使荧光增强。使荧光增强。因为产生了因为产生了p- 共轭作用，增共轭作用，增强了强了 电子共轭程度，使最低激发单重态与基态电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。之间的跃迁几率增大。吸电子基团，如吸电子基团，如-COOH、-NO、-C O、卤素等，会减弱
23、甚至会猝灭荧光。、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。 卤素取代基随原子序数的增加而卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。荧光降低。这可能是由所谓这可能是由所谓“重原子效重原子效应应”使系间窜跃速率增加所致。在重原使系间窜跃速率增加所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的概率。加了由单重态转化为三重态的概率。 取代基的空间障碍对荧光也有影响。取代基的空间障碍对荧光也有影响。 立体异构现象对荧光强度有显著的影响。立体异构现象对荧光强度有显著的影响。四四 、金属螯合物的荧
24、光、金属螯合物的荧光 除过渡元素的顺磁性原子会发生除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，线状荧光光谱外，大多数无机盐类金大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。迁，因而不产生荧光。但是，在某些但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分析。荧光，并可用于痕量金属元素分析。(1)螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。性结构，分子处于非同一
25、平面，因而不发生荧光。若这些若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。面结构的增大，常会发生荧光。 如如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。有很强的荧光。(2)螯合物中金属离子的特征荧光螯合物中金属离子的特征荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致导致dd*跃迁和跃迁和ff*跃迁，最终发射的是跃迁，最终发射的是
26、dd*跃迁和跃迁和ff*跃跃迁光谱。迁光谱。35NNHOOHNNOOAlNOHNOZn(不发荧光)(发黄绿荧光)例例 1，2 - 二苯乙烯二苯乙烯反式：反式：平面构型平面构型 强荧光体强荧光体顺式：顺式：非平面构型非平面构型 非荧光体非荧光体C=CHHC=CHHN NN N不产生荧光不产生荧光产生荧光产生荧光CCOO-O-OCOCOO-O-O产生荧光产生荧光不产生荧光不产生荧光 F=0.92CH2OHCH3H3C萘萘VA F(萘萘)= 5 F(VA) 荧光黄荧光黄酚酞酚酞偶氮菲偶氮菲偶氮苯偶氮苯五、影响荧光强度的因素五、影响荧光强度的因素(环境因素）环境因素） 溶剂溶剂对荧光强度的影响对荧光强
27、度的影响 溶剂的影响可分为溶剂的影响可分为一般溶剂效应和一般溶剂效应和特殊溶剂效应。特殊溶剂效应。 一般溶剂效应指的是溶剂的折射率一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。特殊溶剂效应指的和介电常数的影响。特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，如氢键的生成和化合作用。如氢键的生成和化合作用。 一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构。则决定于溶剂和荧光体的化学结构。特殊溶剂特殊溶剂效应所引起荧光光谱的移动值，往往大于一般效应所引起荧光光谱的移动值，往往大于一般溶剂效应所引起的影
28、响。溶剂效应所引起的影响。由于溶质分子与溶剂由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱可能会有显著不同。有的情况，剂中的荧光光谱可能会有显著不同。有的情况，增大溶剂的极性，增大溶剂的极性，将使将使n 跃迁的能量增大，跃迁的能量增大， 跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光峰红移。峰红移。 但也有相反的情况，例如，苯胺、萘磺但也有相反的情况，例如，苯胺、萘磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，醇中，随着醇的极性增大，荧光强度减小，随着醇的极性增大，
29、荧光强度减小，荧光峰蓝移。荧光峰蓝移。因此荧光光谱的位置和强度与因此荧光光谱的位置和强度与溶剂极性之间的关系，应根据荧光物质与溶溶剂极性之间的关系，应根据荧光物质与溶剂的不同而异。剂的不同而异。 如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或溶剂使荧光物质的电力状态改变，则荧光峰溶剂使荧光物质的电力状态改变，则荧光峰位和强度都会发生较大的变化。位和强度都会发生较大的变化。 温度对荧光强度的影响温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。其中一个温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子的内部能量转化作用。当激发原因是分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可
30、能使激发能转分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。增加，使外转换的去活几率增加。 溶液溶液pH值对荧光强度的影响值对荧光强度的影响 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的合物的荧光与溶液的pH有关。有关。 具有酸性或碱性基团的有机物质，在不同具有酸性或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构值时，其结构 可能发生变化，因而荧光强度将发可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；
31、对无机荧光物质，因生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。性，因而也可使其荧光强度发生改变。 对于金属离子与有机试剂形成的发光对于金属离子与有机试剂形成的发光螯螯合物，合物，一方面一方面pH会影响合会影响合螯螯物的形成，另一方面还会影物的形成，另一方面还会影响响螯螯合物的组成，从而影响它们的荧光性质。合物的组成，从而影响它们的荧光性质。 内滤光作用和自吸收现象内滤光作用和自吸收现象 溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为象称为“内滤
32、光作用内滤光作用”。 内滤光作用的另一种情况是荧光物质的内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光谱的短波长的一端与该物质的吸荧光发射光谱的短波长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。收光谱的长波长一端有重叠。 在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生自身吸收，产生“自吸收自吸收”现象而降低了溶现象而降低了溶液的荧光强度。液的荧光强度。 顺磁性物质的存在，使顺磁性物质的存在，使激发单重态的体系间窜越速激发单重态的体系间窜越速率增大，因而会使荧光效率率增大，因而会使荧光效率降低降低。2 、影响荧光强度的环境因素、影响荧光强度的环境因素因素因素溶剂
33、溶剂一般溶剂效应一般溶剂效应折射率和介电常数的影响折射率和介电常数的影响特殊溶剂效应特殊溶剂效应荧光体和溶剂分子间的荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用如氢键的生成特殊化学作用如氢键的生成同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同温度温度温度上升使荧光强度下降温度上升使荧光强度下降内部能量转化作用增大内部能量转化作用增大碰撞频率增加，使外转换的几率增加碰撞频率增加，使外转换的几率增加酸度酸度化合物所处状态不同化合物所处状态不同电子构型上有所不同电子构型上有所不同荧光强度和荧光光谱不同荧光强度和荧光光谱不同46O H-O3SO-O3S-H+pH 6.4-7.
34、41-萘 酚 -6-磺 酸无 荧 光蓝 色 荧 光-萘胺NH2蓝色荧光NH3+无荧光+ H+pH3.4- 4.8（三）荧光强度与荧光物质浓度的关系（三）荧光强度与荧光物质浓度的关系根据荧光强度的定义式：根据荧光强度的定义式： = If /Ia 荧光强度荧光强度If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia与荧光量子与荧光量子产率产率(荧光量子效率荧光量子效率) 。 If = Ia= f （I0- I）Ia：吸收的辐射强度吸收的辐射强度I0：入射光强度入射光强度荧光池荧光池I0IIf荧光荧光强度强度检测器检测器IIA0lgIf = f （I0- I010-A ） = f I0 （1-10-A ）I =
35、 I010-A! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320AAAIIff将上式展开将上式展开 在荧光浓度很稀在荧光浓度很稀 (A0.05)时，方括号中除第时，方括号中除第一项之外的其他项均可忽略，可得：一项之外的其他项均可忽略，可得： If =2.3 I0 A =2.3 I0 bc 当入射光强度当入射光强度I0 和激发光和激发光 一定时，上式为：一定时，上式为： If = Kc 即，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，但即，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当这种线性关系只有在极稀的溶液中，当A 0.05时时才成立。才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自
36、吸收对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。荧光定量分荧光定量分析依据析依据荧光猝灭荧光猝灭 荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率或荧光效率 f 下降称为荧光猝灭。下降称为荧光猝灭。 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂。荧光猝灭剂。碰撞猝灭碰撞猝灭是指处于激发单重态的荧光
37、分子与猝灭剂分是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式跃迁，荧光效率降低。跃迁，荧光效率降低。 M + 激激 M* M* + Q M + Q +热热自熄灭自熄灭荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。吸收，即自吸收现象。 任何荧任何荧(磷磷)光都具有两种特征光谱：光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧激发光谱与发射光谱。它们是荧(磷磷)光光定性分析的基础。定性分析的基础。1)激发光谱激发光谱 改变激发波长，测量在最强荧改变激发
38、波长，测量在最强荧(磷磷)光发射波长处的强度变化，以激发波长光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到对荧光强度作图可得到荧光激发光谱荧光激发光谱。 激发光谱实质上就是荧光物质的吸激发光谱实质上就是荧光物质的吸收光谱。收光谱。(四四)荧光荧光激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。用于选择最适宜的激发波长。 2)发射光谱发射光谱 发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质，产生不同波长和强度激发波长辐照荧光物质，产生不同波长和强度的荧
39、光，以荧光强度对其波长作图可得的荧光，以荧光强度对其波长作图可得荧光发荧光发射光谱。射光谱。 由于不同物质具有不同的特征发射峰，因由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。 图图6.2 荧光发射光谱荧光发射光谱萘的激发光谱、荧光和磷光光谱萘的激发光谱、荧光和磷光光谱光源光源氙灯和高压汞灯氙灯和高压汞灯激发单色器激发单色器光栅光栅扫描激发光谱，选择激发波长扫描激发光谱，选择激发波长液槽液槽I0 IIf发射单色器发射单色器扫描发射光谱扫描发射光谱消除其它光线的干扰，获得所需的荧光消除其它光线的干扰，获得所需的荧光检测器检测器显示
40、器显示器光电倍增管光电倍增管三、荧光分析仪器三、荧光分析仪器与分光光度计有两点不同与分光光度计有两点不同 两个单色器两个单色器 检测器与激发光互成直角检测器与激发光互成直角1 1、光源、光源 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽更大的发射强度；适用波长范围宽 荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源 荧光光度计中常用荧光光度计中常用高压汞灯高压汞灯和和氙弧灯氙弧灯利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射光源；常用其发射365 nm、405 nm、 436 nm 三条谱线三条谱线以以365 nm 的
41、谱线最强的谱线最强应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源2、单色器、单色器 荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱析，不能获得光谱 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。得荧光光谱。 第一单色器作用：第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长佳激发波长 ex ，用此激发光激
42、发液池内的荧光物质，用此激发光激发液池内的荧光物质 ex。 第二单色器作用：第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长干扰光，用来选择测定用的荧光波长 em。 在选定的在选定的 em 下测定荧光强度，定量分析。下测定荧光强度，定量分析。3、液槽（样品池）、液槽（样品池） 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边。光，只能用手拿棱或最上边。4、检测器、检测器 把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号, 放大放大, 直接转成荧光强度。荧直接转成荧光强度。荧光的强
43、度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。度计采用光电倍增管。 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可 大大提大大提高荧光强度。高荧光强度。5、读出装置（显示器）、读出装置（显示器） 记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱。射光谱。(一一)无机化合物的分析无机化合物的分析 大多数无机离子与溶剂之间的相互作用很强，其大多数无机
44、离子与溶剂之间的相互作用很强，其激发态多以非辐射跃迁方式返回基态，发荧光者甚少。激发态多以非辐射跃迁方式返回基态，发荧光者甚少。但很多无机离子可以与一些有机化合物形成有荧光的但很多无机离子可以与一些有机化合物形成有荧光的络合物，利用这一性质可对其进行荧光测定。络合物，利用这一性质可对其进行荧光测定。 能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物，通常含有两个或两个以上的官多数是芳香族化合物，通常含有两个或两个以上的官能团，能与金属离子形成五元环或六元环的螯合物。能团，能与金属离子形成五元环或六元环的螯合物。由于螯合物的生成，分子的刚性平
45、面结构增大，使原由于螯合物的生成，分子的刚性平面结构增大，使原来不发荧光或荧光较弱的化合物转变为强荧光化合物。来不发荧光或荧光较弱的化合物转变为强荧光化合物。四、荧光分析法的应用四、荧光分析法的应用 另一类络合物是三元离子缔合物。另一类络合物是三元离子缔合物。 罗明丹罗明丹B为阳离子荧光染料，为阳离子荧光染料，Au3+、Ga3+ 、Tl3+等阳离子首先与等阳离子首先与Cl-、Br-等等X-形成形成二元络阴离子，再与罗明丹二元络阴离子，再与罗明丹B缔合成荧光化缔合成荧光化合物。合物。 署红署红为阴离子染料，为阴离子染料，Ag+与邻菲咯啉形与邻菲咯啉形成二元络阳离子，再与署红缔合后可使其荧成二元络
46、阳离子，再与署红缔合后可使其荧光猝灭，由荧光降低的程度也可对光猝灭，由荧光降低的程度也可对Ag+进行进行分析。分析。(二二)有机化合物的分析有机化合物的分析 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发生荧光的很少，一般需要与某些试剂本身能发生荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析，如丙三醇与苯胺在反应后才能进行荧光分析，如丙三醇与苯胺在浓硫酸介质中反应生成发射蓝色荧光的喹啉，浓硫酸介质中反应生成发射蓝色荧光的喹啉，据此可以测定据此可以测定0.12gmL 的丙三醇。的丙三醇。 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，芳香族化合物因具有共轭的不饱和体
47、系，多数能发生荧光，可直接用荧光法测定。多数能发生荧光，可直接用荧光法测定。激发光谱激发光谱和和荧光光谱荧光光谱荧荧光光强强度度 I波长波长 (nm)300400500硫酸奎宁的两个光谱硫酸奎宁的两个光谱 ex,max fl,max可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷磷)光光谱图光光谱图 三维荧光光谱三维荧光光谱 ex 蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图 蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱一、概述一、概述 磷光分析法是以分子磷光光谱磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有机化合物和进行定量分析来
48、鉴别有机化合物和进行定量分析的一种方法。的一种方法。 磷光分析法在药物分析，临床磷光分析法在药物分析，临床分析等领域的应用日益发展。分析等领域的应用日益发展。 6.2 磷光分析法磷光分析法二、二、 基本原理基本原理(一一) 磷光的产生和磷光强度磷光的产生和磷光强度 磷光是处于激发三重态的分子跃迁返回基态磷光是处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。时所产生的辐射。1. 磷光的特点：磷光的特点： 磷光波长比荧光的长磷光波长比荧光的长(T1S1)； 磷光寿命比荧光的长磷光寿命比荧光的长(磷光为禁阻跃迁产生，磷光为禁阻跃迁产生，速率常数小速率常数小)； 磷光寿命和强度对重原子和氧敏感磷光寿命
49、和强度对重原子和氧敏感(自旋轨道自旋轨道耦合，使耦合，使kISC增加增加)。2.磷光强度磷光强度: IP=2.3 PI0 bc 式中，式中， IP：磷光强度，磷光强度， P：磷光效率，磷光效率， I0 ：激发光的强度，激发光的强度，b：试样池的光程，试样池的光程， ：磷光物质的摩尔吸收系数磷光物质的摩尔吸收系数 ， c：磷光物质的浓度。磷光物质的浓度。 在一定的条件下，在一定的条件下， p、Ip 、k、b 均为常均为常数，因此上式数，因此上式 可写成：可写成： Ip=Kc(二二) 温度对磷光强度的影响温度对磷光强度的影响1. 随着温度降低，分子热运动速率减慢，磷光逐渐增强。随着温度降低，分子热
50、运动速率减慢，磷光逐渐增强。2. 低温磷光低温磷光(液氮液氮) 由于磷光寿命长，由于磷光寿命长，T1的非辐射跃迁的非辐射跃迁(内转换内转换)几率增几率增加，碰撞失活加，碰撞失活(振动弛豫振动弛豫)的几率、光化学反应几率都增的几率、光化学反应几率都增加，从而降低磷光强度。因此有必要在低温下测量磷光。加，从而降低磷光强度。因此有必要在低温下测量磷光。同时要求溶剂：同时要求溶剂： 易提纯且在分析波长区无强吸收和发射；易提纯且在分析波长区无强吸收和发射； 低温下形成具有足够粘度的透明的刚性玻璃体。低温下形成具有足够粘度的透明的刚性玻璃体。常用常用的溶剂：的溶剂： EPA乙醇乙醇+异戊烷异戊烷+二乙醚二
