1、主讲：肖贵榜主讲：肖贵榜实验目的：实验目的：掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的一般原理和方法。质的一般原理和方法。熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清中清蛋白与球蛋白的比值。中清蛋白与球蛋白的比值。1 1、巴比妥巴比妥- -巴比妥钠缓冲液巴比妥钠缓冲液(pH=8.6，离子强度 0.075)：称取2.768g巴比妥和15.458g巴比妥 钠,置于大烧杯中，加蒸馏水约600ml，稍加 热溶解，冷却后用蒸馏水定溶至1000ml。置4 保存，备用。2 2、氨基黑、氨基黑10B10B：氨基黑10B 0.5克, 甲醇50ml,冰
2、乙酸10ml ,蒸馏水40ml 。3 3、漂洗液：、漂洗液：取无水乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏 水50ml，混匀置塞试剂瓶内贮存。3 3、0.4N0.4N氢氧化钠：氢氧化钠：称取氢氧化钠16.0g，蒸馏水 加至1000ml氨基黑氨基黑10B 氨基黑10B ,苯胺蓝黑，酸性黑1,萘酚蓝黑，酸性黑10B，Acid Black 1 1. 1. 电泳仪：电泳仪：为电泳提供直流电源。为电泳提供直流电源。2. 2. 电泳槽：电泳槽：为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝。3. 3. 血清加样器血清加样器 ：可用盖玻片或可用盖玻片或X X胶片或微量加样器
3、。胶片或微量加样器。4. 4. 醋酸纤维素薄膜：醋酸纤维素薄膜：2cm2cm8cm8cm5. 5. 其它：其它： 培养皿（直径培养皿（直径9-10cm9-10cm）、滤纸、玻璃板、镊子等。）、滤纸、玻璃板、镊子等。DYY-5型稳压稳流电泳仪DYY-型电泳槽一、电泳的原理 电泳电泳：带电粒子在电场的作用下向着与带电粒子在电场的作用下向着与其电性相反的电极移动的现象。其电性相反的电极移动的现象。 实验原理：实验原理： 以蛋白质为例：以蛋白质为例：PrCOO-NH2PrCOO-NH3+PrCOOHNH3+pHpI pH=pI pH 纤维状分子纤维状分子2 2.缓冲溶液缓冲溶液： A.pHpH值：值：
4、(pH-(pH-pIpI) )越大，越大，Q Q越多，越多，u u越大越大B.离子强度离子强度(I)： 离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数离子电荷的总数，而与溶液中而与溶液中盐类盐类的的性质无关性质无关。溶液的离子强度越高，。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强度越低，质点泳动带电质点的泳动速度越慢；离子强度越低，质点泳动的速度越快。的速度越快。 选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在范围在0.020.
5、2之间。之间。3.电场强度(X):电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。 X越大，越大，u越快。支持物越短，越快。支持物越短， X越大，越大， u越快越快。 电电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。热也增加，影响分离效果。 在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。蛋白质等样品发生热变性而无法分离。依次分为清蛋白、依次分为清蛋白、1 1、2 2、球蛋白球蛋白五个区带五个区带
6、血清蛋白醋血清蛋白醋酸纤维素薄膜电酸纤维素薄膜电泳泳5 5条区带条区带二二. .定量操作定量操作 膜条经过氨基黑膜条经过氨基黑10B10B染色后显出清晰色带。染色后显出清晰色带。 各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。 可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。 用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。实验步骤实验步骤：1 1准备与点样准备与点样：取两条取两条2.52.58cm8cm的膜条的膜条充分浸透在充分浸透在巴比妥缓冲巴比妥缓冲液中液中取出膜条取出膜条滤纸吸去滤纸吸去多余的缓多余的缓冲
7、液冲液无光面距一无光面距一端端1.5cm1.5cm处作处作点样线点样线点样器下端点样器下端粘上薄层血粘上薄层血清清垂直垂直点样点样点样操作示意图点样操作示意图 2 2电泳电泳放置放置膜条膜条点样端置于阴极点样端置于阴极点样面向下点样面向下膜条贴膜条贴紧滤纸，紧滤纸，拉直膜条拉直膜条平衡平衡5分钟分钟通通电电电压：电压：160v时间：时间：60 min关闭关闭电源电源电泳装置电泳装置3 3染色、脱色染色、脱色通电通电完毕完毕取出取出膜条膜条浸于染色液浸于染色液（氨基黑（氨基黑10B10B）中）中3min取出取出膜条膜条依次浸于依次浸于漂洗液漂洗液、各各5min直至直至漂净漂净滤纸吸滤纸吸干薄膜干
8、薄膜预试结果图（供参考）预试结果图（供参考）. .定量定量(两人的膜条共用两人的膜条共用)取试管取试管6支，编号支，编号16试管编号试管编号A1 12 200.4mol/LNaOH 4.0ml4.0ml4.0ml4.0ml4.0ml4.0ml蛋白条带蛋白条带 清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白无蛋白区无蛋白区充分振荡、脱净染料充分振荡、脱净染料比比 色、定色、定 量量15min实验结果实验结果：各样品吸光度值各样品吸光度值清蛋白清蛋白1 1球蛋球蛋白白2 2球蛋球蛋白白球蛋球蛋白白球蛋白球蛋白A1A2A3A仪器型号：仪器型号： 吸收波长：吸收波长：仪器编号
9、：仪器编号：650nm光密度总和光密度总和T TA A1 12 21 1计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。清蛋白（清蛋白（A / A / T T）1001001 1球蛋白（球蛋白（ 1 1 / / T T）1001002 2球蛋白（球蛋白（ 2 2 / / T T）100100球蛋白（球蛋白（/ / T T）100100球蛋白（球蛋白（/ / T T）1001002 2计算出清蛋白与球蛋白之比值（计算出清蛋白与球蛋白之比值（A/A/G G）G=G=1 12 2血清蛋白电泳结果的临床意义血清蛋白电泳结果的临床意义可能相关疾病可能相关疾病清蛋白清蛋白1 1
10、球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白骨髓瘤骨髓瘤* *肾病综合症肾病综合症* * *肾炎肾炎* *肝硬化肝硬化* *急性肝坏死急性肝坏死 * *传染性肝炎传染性肝炎* * *急性感染初期急性感染初期* * * *慢性炎症慢性炎症/ /感染后期感染后期* *低低 球蛋白血症球蛋白血症* *临床上还可用临床上还可用A/GA/G比来表示清球蛋白的量的关系：比来表示清球蛋白的量的关系：正常人正常人A/GA/G1.51.52.52.5注意事项注意事项： 1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤、点样时，
11、应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。效果。 4、点样后膜条的放置：区分电极正负极，膜、点样后膜条的放置：区分电极正负极，膜条点样端接于负极且点样面向下。条点样端接于负极且点样面向下。 5 5、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。不宜过多或过少。 6 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀。带染色不均匀。 1. 1. 电泳时为什么要将点样的一端靠近负极电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？端？ 根据人血清中各蛋白组分的性质，如根据人血清中各蛋白组分的性质，如何估计它们在何估计它们在pH8.6pH8.6的巴比妥巴比妥钠电的巴比妥巴比妥钠电泳缓冲液中的相对迁移速度？泳缓冲液中的相对迁移速度？ 2. 2. 回顾醋酸纤维素薄膜电泳的原理和优点回顾醋酸纤维素薄膜电泳的原理和优点思考与练习思考与练习
