1、核酸与蛋白质的生物核酸与蛋白质的生物 合成及基因工程合成及基因工程第一节第一节 DNA的生物合成的生物合成一一. DNA的半保留复制的半保留复制 Watson和和Crick开创性的论文，对开创性的论文，对DNA双螺双螺旋的描述以这样一段陈述结尾：旋的描述以这样一段陈述结尾：“不出我们的意不出我们的意料，我们所假设的特异性配对立即提示一种遗传料，我们所假设的特异性配对立即提示一种遗传物质可能的复制机制。物质可能的复制机制。” 复制时复制时, 每一条每一条DNA链在新链合成中充当模链在新链合成中充当模板，按碱基配对方式形成两个新的板，按碱基配对方式形成两个新的DNA分子，每分子，每个分子都含有一条
2、新链和一条旧链，这种复制方个分子都含有一条新链和一条旧链，这种复制方式即半保留复制式即半保留复制(semiconservative replication)。DNA复制可能的三种方式复制可能的三种方式新链新链旧链旧链DNA的半保留复制的半保留复制表明表明DNA在代谢上在代谢上的稳定性，保证亲的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定代的遗传信息稳定地传递给后代。地传递给后代。 （但（但DNA在代谢上的在代谢上的稳定性并非指稳定性并非指DNA是是一种惰性物质。）一种惰性物质。）半保留复制半保留复制亲亲代代第第一一代代第第二二代代半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据 1958年年Meselson和和St
3、ahl用同位素用同位素15N标标记大肠杆菌记大肠杆菌DNA，首，首先证明了先证明了DNA的半保的半保留复制。留复制。由由Meselson和和Stahl设设计证明计证明半保留复制的实验被誉为半保留复制的实验被誉为 生物学最美丽的实验生物学最美丽的实验MeselsonMeselson和和StahlStahl于于4242年以后在最年以后在最初他们相遇的一颗树下重逢时的合影初他们相遇的一颗树下重逢时的合影Meselson Meselson 和和StahlStahl的证明的证明DNADNA半保留复制的实验流程半保留复制的实验流程 重重轻轻杂和杂和 DNA杂和杂和 DNA 复制是一个高度协调的过程，母链解
4、链和复复制是一个高度协调的过程，母链解链和复制同时进行。制同时进行。（一）概念（一）概念 复制子复制子(replicon)：从一个从一个DNA复制起点开始，复制起点开始，最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。基最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。基因组能独立进行复制的单位。因组能独立进行复制的单位。 起点起点(origin)：控制复制起始，是约含有控制复制起始，是约含有100200个碱基对的一段个碱基对的一段DNA。细胞内存在着能识。细胞内存在着能识别起点的特殊蛋白质。别起点的特殊蛋白质。终点终点(terminus)：终止复制的序列位点终止复制的序列位点.复制叉复制叉(replication
5、 fork)：复制开始后由于复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。成在显微镜下可看到的叉状结构。原核生物：只有一个复制子原核生物：只有一个复制子真核生物：多个复制子，多个起点，形成多个真核生物：多个复制子，多个起点，形成多个 “复制眼复制眼”或或“复制泡复制泡”（二）起始点和方向（二）起始点和方向 1. 原核生物和真核生物复制都是在原核生物和真核生物复制都是在DNA分子分子特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的保守顺序保守顺序GATC和和TTATCCACA，多次出现，可
6、，多次出现，可被酶识别。被酶识别。 2. 方向：大多是双向、对称复制方向：大多是双向、对称复制, 也有单向或也有单向或不对称的。不对称的。 3. 速度：速度： 原核生物复制叉移动快原核生物复制叉移动快(约约105bp/min); 真核生物复制叉移动慢真核生物复制叉移动慢 (约约51025103bp/min) 概述概述以原来的以原来的DNA两条链作为模板，两条链作为模板，4种种dNTP为为前体，需要前体，需要Mg2模板模板DNA需要解链需要解链半保留复制半保留复制需要引物需要引物主要是主要是RNA，少数是蛋白质，少数是蛋白质 复制的方向始终是复制的方向始终是53 具有固定的起点具有固定的起点 多
7、为双向复制，少数为单向复制多为双向复制，少数为单向复制 半不连续性半不连续性 具有高度的忠实性具有高度的忠实性（一）（一）DNA聚合酶聚合酶 ( DNA polymerase, DNA-pol )lDNA聚合酶是一种催化依赖模板的由脱氧核苷聚合酶是一种催化依赖模板的由脱氧核苷三磷酸前体合成三磷酸前体合成DNA的酶。的酶。l1956 年年 Arthur kornberg 等首先从大肠杆菌等首先从大肠杆菌中发现中发现DNA聚合酶，其后在广泛不同的生物中都聚合酶，其后在广泛不同的生物中都找到有这种酶。找到有这种酶。以大肠杆菌为代表的以大肠杆菌为代表的 “-复制复制”系统为系统为例例DNA聚合酶的反应
8、特点：聚合酶的反应特点： 4 4种种dNTP底物：底物：(dATP dGTP dCTP dTTP)； 接受模板指导接受模板指导: 解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链； 需引物提供需引物提供3-OH； 新链生长方向：新链生长方向： 53； 产物产物DNA性质性质与模板相同。与模板相同。 此外此外, DNA复制过程中还需其它酶和蛋白质因子复制过程中还需其它酶和蛋白质因子.模板模板DNA链链引引 物物新加入的新加入的dNTP脱氧核糖脱氧核糖亲核攻击亲核攻击53生长的生长的DNA链链* * 引物引物 (primer) 是一个和模板链互补的线性片段是一个和模板链互补的线性片段, 其上带其上带有能与
9、核苷酸相结合的游离有能与核苷酸相结合的游离3-OH. 引物通常是寡聚引物通常是寡聚RNA.1. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 pol 也称也称Kornberg酶酶, 是各种是各种DNA聚合酶中研究聚合酶中研究最透彻的，它的一些特点代表了最透彻的，它的一些特点代表了DNA聚合酶的聚合酶的基本特点：基本特点：（1） pol 的性质的性质 分子量：分子量：103 000，单链，球形，活性部位，单链，球形，活性部位含含 Zn2， 电镜下可以看到二聚体，每个细胞电镜下可以看到二聚体，每个细胞有有400个酶分子。个酶分子。（2）功能：）功能： 53聚合酶活性；聚合酶活性； 酶与模板结合后构象改变，识
10、别碱基，正酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正 确配对后才发挥聚合作用确配对后才发挥聚合作用( (对底物进行专一性核对对底物进行专一性核对) ) 3 5外切酶活性；外切酶活性； 主要是对新生主要是对新生DNA链进行链进行校对校对，防止，防止“错配错配” 53外切酶活性。外切酶活性。 主要是对主要是对DNA损伤的修复损伤的修复，以及在，以及在DNA复制复制时时RNA引物的切除及其空隙的填补引物的切除及其空隙的填补 可见，可见，DNA pol是是1 1个多功能酶。个多功能酶。（DNA复制过程中碱基配对要受到复制过程中碱基配对要受到双重核对双重核对）2. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 pol
11、(1) 多亚基多亚基, 聚合酶亚基聚合酶亚基 (单链单链) 分子量为分子量为88 000, 每个细胞有每个细胞有100个酶分子个酶分子（2）功能：）功能： 53聚合酶活性；聚合酶活性； 35外切酶活性。外切酶活性。 （该酶无该酶无53外切酶活性外切酶活性 ） 目前认为该酶主要参与目前认为该酶主要参与DNA损伤的修复。损伤的修复。3. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 pol 真正的真正的DNA复制酶，复制酶，1972年发现年发现 （1）pol 是真正起复制作用的酶是真正起复制作用的酶，由由10种种亚基组成亚基组成不对称二聚体不对称二聚体, 、组成核心酶组成核心酶 （2）功能：）功能： 53聚
12、合酶活性；聚合酶活性； 35外切酶活性。外切酶活性。 该酶在原核细胞中主要负责该酶在原核细胞中主要负责DNA链的延伸，是链的延伸，是复制延长中真正起催化作用的酶。复制延长中真正起催化作用的酶。 (该酶该酶无无53外切酶活性外切酶活性) E. coli DNA 聚合酶聚合酶不对称二聚体不对称二聚体 可滑动的可滑动的 夹持器亚基夹持器亚基催化亚基催化亚基3 5 外切酶亚基外切酶亚基前导链前导链 合成合成后随链后随链 合成合成 夹持器夹持器装置装置催化亚基催化亚基 亚基保持核心酶亚基保持核心酶 的二聚体结构的二聚体结构亚基具有亚基具有53方向合成方向合成DNA的催化活性的催化活性亚基具有亚基具有35
13、外切酶活性，起校对功能，外切酶活性，起校对功能， 可提高聚合酶可提高聚合酶复制复制DNA的保真性的保真性 亚基可能亚基可能起组建的作用起组建的作用亚基犹如夹子，亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住功能是识别引物、夹住DNA 分子向前滑动分子向前滑动 亚基亚基起着促使核心酶二聚化的作用起着促使核心酶二聚化的作用其余的亚基构成其余的亚基构成 -复合物，复合物，主要功能是帮助主要功能是帮助 亚基夹住亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有（也称夹子装置器），并有 增强核心酶活性的作用增强核心酶活性的作用DNA 聚合酶聚合酶 pol pol pol 亚基数目亚基数目 1 7 105 3 聚合酶活性聚合酶活
14、性 + + + 3 5 外切酶活性外切酶活性 + + +5 3 外切酶活性外切酶活性 + - - - -聚合速度聚合速度(核苷酸核苷酸/分分) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000 持续合成能力持续合成能力 3-200 1 500 500 000功能功能 切除引物切除引物,修复修复 修复修复 复制复制表表 大肠杆菌大肠杆菌3种种DNA聚合酶性质比较聚合酶性质比较（1）DNA的半不连续复制：的半不连续复制： DNA双链复制时，一条链是连续合成的双链复制时，一条链是连续合成的(前导链前导链, leading strand), 另一条链是不连续合成另一条链是不连续合成的的(
15、滞后链或后随链滞后链或后随链, lagging strand), 这种前导链这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制方式称的连续复制和后随链的不连续复制方式称DNA的半不连续复制。的半不连续复制。（二）双链（二）双链DNA复制的分子机制复制的分子机制1、冈崎片段和半不连续复制、冈崎片段和半不连续复制（2）冈崎片段：）冈崎片段： 在不连续的后随链在不连续的后随链DNA合成中形成的合成中形成的DNA短片段短片段，在原核生物有，在原核生物有10002000核苷酸，核苷酸，真核生物约真核生物约100200核苷酸。核苷酸。1968年冈崎发现。年冈崎发现。 3 5 3 5 3 5 3 5 解链方向解链方向
16、领头链领头链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)DNADNA的半不连续复制的半不连续复制3 5 复制叉复制叉起点起点复制叉复制叉延伸延伸延伸延伸起点起点领头链领头链领头链领头链随后链随后链随后链随后链3535DNA的双向复制的双向复制5555555533333332、DNA半不连续复制中的半不连续复制中的RNA引物引物 （1）前导链和滞后链的合成都需要）前导链和滞后链的合成都需要RNA引物。引物。 （2）引物合成酶）引物合成酶(引发酶引发酶)：是以：是以DNA为模板的为模板的RNA聚合酶（合成方向聚合酶（合成方向53）, 合合成的引物长度为成的引物长度为
17、510多个核苷酸。多个核苷酸。 (3) 引物引物RNA的起始和终止的位置受解链酶、的起始和终止的位置受解链酶、引发酶、模板顺序及其二级结构的影响。引发酶、模板顺序及其二级结构的影响。 （4）DNA聚合酶聚合酶切除前导链及冈崎片段的引切除前导链及冈崎片段的引物后物后, 填补空缺，由填补空缺，由DNA连接酶将切口连接。连接酶将切口连接。 RNA引物的合成称作引物的合成称作“引发引发” 。 后随链的合成需多次引发作用，而发动前后随链的合成需多次引发作用，而发动前导链的合成只需一次引发。导链的合成只需一次引发。 前导链的引物一般比冈崎片段的引物略长一前导链的引物一般比冈崎片段的引物略长一些，前者大约为
18、些，前者大约为1060nt，后者通常为几个，后者通常为几个10多个多个nt。 成熟的成熟的DNA是不含是不含RNA的，的，RNA引物最终被引物最终被DNA所置换。所置换。催化两段催化两段DNA之间的连接之间的连接:35535353HOP DNA ligaseNADATPNMNAMP+PPi+ DNA连接酶（连接酶（1967年发现）：年发现）：若双链若双链DNA中中一条链有切口一条链有切口, 一端是一端是3-OH, 另一端是另一端是5-磷酸磷酸基基, 连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。口连接。 但它不能将两条游离的但它不能将两条游离的DNA单
19、链连接起来。单链连接起来。 大肠杆菌和其它细菌的大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶需要连接酶需要NAD+提提供能量供能量; ;在真核生物、病毒和噬菌体中，则要在真核生物、病毒和噬菌体中，则要ATP提供能量。提供能量。3535OHOHP P4. 母本母本DNA双链的分离双链的分离 (1) DNA解链酶解链酶(解螺旋酶解螺旋酶)：通过水解：通过水解ATP将复将复制叉前方的制叉前方的DNA双链打开。每解开一对碱基需要双链打开。每解开一对碱基需要水解水解2个个ATP分子。分子。 (2) 单链结合蛋白单链结合蛋白(single-strand binding protein, SSB)：稳定已被解开的：稳定
20、已被解开的DNA单链，阻止复性和保单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。护单链不被核酸酶降解。 (3) DNA转轴酶（拓扑异构酶转轴酶（拓扑异构酶）和旋转酶）和旋转酶（拓扑异构酶（拓扑异构酶）: 兼有内切酶和连接酶活性兼有内切酶和连接酶活性, 可可迅速使迅速使DNA两条链断开又接上两条链断开又接上, 消除解链酶产生消除解链酶产生的拓扑张力。的拓扑张力。当引入负超螺旋当引入负超螺旋时需要由时需要由ATP提供提供能量能量, 同复制有关。同复制有关。总结总结: : 原核生物原核生物DNA的复制过程的复制过程:(以大肠杆菌为例以大肠杆菌为例) 双链的解开双链的解开 起始起始-RNA引物的合成引物的合
21、成 DNA链的延伸链的延伸 终止终止B. RNA引物的合成引物的合成 引发体先与引发体先与DNA起始部位双链结合，通过起始部位双链结合，通过引引物合成酶物合成酶形成前导链引物后，再沿形成前导链引物后，再沿53模板模板链与复制叉同向移动，在移动中断断续续形成链与复制叉同向移动，在移动中断断续续形成冈崎片段的冈崎片段的RNA引物。引物。A. 双链的解开双链的解开 DNA旋转酶旋转酶(拓扑异构酶拓扑异构酶)、 DNA解链酶、解链酶、单链结合蛋白协同作用单链结合蛋白协同作用C. DNA链的延伸链的延伸 在在DNA pol 的催化下，以四种的催化下，以四种dNTP为底为底物，在物，在RNA引物的引物的3
22、 端以磷酸二酯键连接上脱端以磷酸二酯键连接上脱氧核苷酸并释放出焦磷酸。氧核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时链的延伸同时进行领头链和后随链的合成。进行领头链和后随链的合成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol前导链的延长：前导链的延长： DNA pol 全酶二聚体的一个亚基与前导链全酶二聚体的一个亚基与前导链的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。滞后链的延长滞后链的延长: DNA pol 全酶二聚体的另一亚基与形成一全酶二聚体的另一亚基与形成一个环的滞后链的模板结合发挥催
23、化作用。个环的滞后链的模板结合发挥催化作用。 由于模板形成环由于模板形成环, 酶向前移动时酶向前移动时, 滞后链合成滞后链合成片段也沿片段也沿53方向生长方向生长, 与酶催化方向一致。与酶催化方向一致。 滞后链片段合成接近前方滞后链片段滞后链片段合成接近前方滞后链片段5末端末端时时, 模板被释放模板被释放, 环消失。继续重复环消失。继续重复, 连续进行。连续进行。 当新形成的冈崎片段延长至一定长度当新形成的冈崎片段延长至一定长度, 其其3-OH遇到上一个冈崎片段时即停止合成。遇到上一个冈崎片段时即停止合成。 一旦冈崎片段合成完成，其一旦冈崎片段合成完成，其RNA引物即被引物即被除去，通过除去，
24、通过DNA聚合酶聚合酶催化合成催化合成DNA取而代取而代之，并形成一个切口，此切口由之，并形成一个切口，此切口由DNA连接酶连连接酶连接封闭。接封闭。D. 复制终止复制终止 细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，在细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，在终止区相遇而停止复制，复制体解体。终止区相遇而停止复制，复制体解体。 这样这样, 以两条亲代以两条亲代DNA链为模板，各自形成链为模板，各自形成一条新的一条新的DNA互补链，结果形成了两个互补链，结果形成了两个DNA双双股螺旋分子。股螺旋分子。 就目前所知，起始阶段是就目前所知，起始阶段是DNA复制中唯一一复制中唯一一个可以受调节的阶段，由于受到调
25、节而使得个可以受调节的阶段，由于受到调节而使得DNA在一个细胞周期中只发生一次复制。在一个细胞周期中只发生一次复制。 细菌复制终止区含有多个约细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子的终止子(terminator)位点，位点，E. coli 有有6个终止子位点。个终止子位点。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA复制终止区的结构复制终止区的结构 复制的保真性复制的保真性 ( fidelity )(主要依赖主要依赖 5 种机制：种机制：5. DNA复制的高度忠实性复制的高度忠实性 大肠杆菌大肠杆菌DNA复制错配率约复制错配率约10-910-10。其染。其染色体中有色体中有4.5106bp，平均每，平均每1
26、 00010 000个细个细胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。（1）四种）四种dNTPs浓度的平衡浓度的平衡（2）DNA聚合酶的高度选择性聚合酶的高度选择性（3）DNA聚合酶的自我校对聚合酶的自我校对(proofreading)（4）错配修复）错配修复（5）使用）使用RNA作为引物并最终被切除、置作为引物并最终被切除、置换换(一一) 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶:至少至少5种种- DNA-pol 现认为其功能只是合成引物现认为其功能只是合成引物DNA-pol 在复制延长中起催化作用在复制延长中起催化作用DNA-pol 校对、修复、填补校对
27、、修复、填补(类似类似E.coli DNA pol I )DNA-pol 线粒体线粒体DNA合成合成DNA-pol 核核DNA修复修复 四、真核细胞四、真核细胞DNA的复制的复制（DNA指导指导 下的下的DNA合成）合成）推测在复制叉上有一个推测在复制叉上有一个DNA pol, 以合成引物以合成引物; 两个两个DNA pol, 分别合成前导链和滞后链。分别合成前导链和滞后链。1 1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。向复制，多复制子。2、冈崎片段长约、冈崎片段长约200bp.3、真核生物、真核生物DNA复制速度比原核慢。复
28、制速度比原核慢。4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。制起点。5、真核生物有多种、真核生物有多种DNA聚合酶。聚合酶。6、真核生物线性染色体两端有、真核生物线性染色体两端有端粒端粒结构，防止染色体结构，防止染色体间的末端连接。由间的末端连接。由端粒酶端粒酶负责新合成链负责新合成链5 端端RNA引引物切除后的填补，亦保持物切除后的填补，亦保持端粒端粒的一定长度
29、的一定长度。五、五、反转录作用反转录作用（RNA指导的指导的DNA合成）合成）v定义定义: 以以RNA为模板为模板, 按照按照RNA中的核苷酸顺序中的核苷酸顺序合成合成DNA的过程称为反转录的过程称为反转录(reverse transcription, RT)。该过程由反转录酶催化进行。该过程由反转录酶催化进行。v1970年年Temin和和Baltimore同时分别从同时分别从(鸡鸡)劳氏肉劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分病毒中分离出反转录酶，迄今已知的致癌离出反转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有病毒都含有反转录酶。反转录酶。+RNA+RNA
30、+DNA-DNA-RNA+RNA+DNA-DNA-DNA+DNA+v病毒病毒RNARNA的反转录过程的反转录过程 （以前病毒形式整合到宿主细（以前病毒形式整合到宿主细胞胞DNADNA中而使细胞恶性转化）中而使细胞恶性转化） 单链病毒单链病毒RNARNA RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子 双链双链DNADNA（前病毒）（前病毒） 反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶v 逆转录酶是多功能酶，兼有逆转录酶是多功能酶，兼有3 3种酶的活性：种酶的活性： RNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性 DNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性 核糖核酸酶核糖核酸酶H的活性，专一水解的活性，专一
31、水解RNA-DNA杂交分子杂交分子 中的中的RNA，可沿，可沿5 和和3两个方向起核酸两个方向起核酸外切酶外切酶的的 作用，切除杂交分子中的作用，切除杂交分子中的RNAv反转录酶也和反转录酶也和DNA聚合酶一样聚合酶一样, 沿沿53 方向合成方向合成 DNA, 并要求短链并要求短链RNA作引物。作引物。l cDNA：利用反转录酶可合成出与任何：利用反转录酶可合成出与任何RNA模板模板（mRNA，tRNA或或rRNA）的碱基序列互补的）的碱基序列互补的DNA互补互补DNA（complementary DNA, cDNA）。）。l 几乎所有真核生物几乎所有真核生物mRNA分子的分子的3 末端都有一
32、段末端都有一段polyA, 当加入寡聚当加入寡聚dT作为引物时，作为引物时，mRNA就可作为就可作为模板，在反转录酶催化下在体外合成与其互补的模板，在反转录酶催化下在体外合成与其互补的cDNA，为研究真核结构基因提供了有效途径。，为研究真核结构基因提供了有效途径。反转录酶发现的理论和实践意义：反转录酶发现的理论和实践意义：不能把不能把“中心法则中心法则”绝对化，遗传信息也可以从绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索，已经病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索，已经成为研究这些学科的有力工具。成为研究这些学科的有力工具。
