1、1 主讲人：孙启慧主讲人：孙启慧v1. 中药质量标准方法学验证的意义？中药质量标准方法学验证的意义？v2. 中药质量标准方法学验证的主要内中药质量标准方法学验证的主要内 容及方法？容及方法？23方法学验证的目的方法学验证的目的 方法学验证：是对测定方法的评价方法学验证：是对测定方法的评价, ,是建立新方法的研究是建立新方法的研究 内容和依据。内容和依据。 证明采用的方法是否适合于相应的检测方法或分析要求；证明采用的方法是否适合于相应的检测方法或分析要求； 新建立的检测方法、改变原检测方法、工艺变更、处方变更新建立的检测方法、改变原检测方法、工艺变更、处方变更 等均须验证。等均须验证。4需验证的
2、分析方法类型需验证的分析方法类型v鉴别（薄层鉴别）鉴别（薄层鉴别）v限量检查（重金属含量限度检查）限量检查（重金属含量限度检查）v含量测定含量测定v溶出度、释放度溶出度、释放度v残留物（农药残留）、添加物（食品添加剂）等的限度检查残留物（农药残留）、添加物（食品添加剂）等的限度检查5需验证的分析方法内容需验证的分析方法内容 已有重现性验证，不需验证中间精密度。已有重现性验证，不需验证中间精密度。重现性只有在该分析方法将被法定标准采用时做。重现性只有在该分析方法将被法定标准采用时做。如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充。如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充。v专属性专属性v线性线
3、性v检测限、定量限检测限、定量限v精密度（重复性、中间精密度、重现性）精密度（重复性、中间精密度、重现性）v稳定性稳定性v准确性（回收率）准确性（回收率）v耐用性耐用性67专属性（专属性（SpecificitySpecificity）v专属性定义专属性定义: :专属性系指在其他成分可能存在下，采用的方法能正确专属性系指在其他成分可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。如方法不够专属，应采用多个方法予以补充。察其专属性。如方法不够专属，应采用多个方法予以补充。v鉴别：确证被测物
4、是否符合其特性；鉴别：确证被测物是否符合其特性；v检查：确保采用的分析方法可检出被测物中杂质或应控制物的准确含检查：确保采用的分析方法可检出被测物中杂质或应控制物的准确含量，如有关物质、有毒成分、重金属、溶剂残留量等；量，如有关物质、有毒成分、重金属、溶剂残留量等；v含量测定：提供样品中被测物含量的准确结果。含量测定：提供样品中被测物含量的准确结果。8专属性专属性常用的试验方法 v空白阴性对照试验空白阴性对照试验v比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱峰的吸收光谱的比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱峰的吸收光谱的一致性一致性9专属性专属性空白阴性对照试验的试验要求：空白阴性对照试验的试验要
5、求：n TLCTLC：目测观察，空白阴性对照应不得显与供试品检测成分：目测观察，空白阴性对照应不得显与供试品检测成分相应的斑点。相应的斑点。n HPLC/GC/TLCSHPLC/GC/TLCS：空白阴性对照色谱中，在与相应对照品保：空白阴性对照色谱中，在与相应对照品保留时间相应的位置留时间相应的位置应无色谱峰或其峰面积小于应无色谱峰或其峰面积小于5%5%胃灵颗粒质量标准研究胃灵颗粒质量标准研究专属性专属性10图图 芍药苷含量测定芍药苷含量测定HPLC色谱图色谱图a 芍药苷对照品；芍药苷对照品；b供试品；供试品；c白芍阴性对照品；白芍阴性对照品；1.芍药苷芍药苷11线性关系考察（线性关系考察（L
6、inearityLinearity） 线性系指在设计的范围内，测试结果与供试线性系指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物浓度（质量）直接呈正比关系的程度。品中被测物浓度（质量）直接呈正比关系的程度。12线性试验方法：线性试验方法：v制备梯度浓度对照品溶液，以相同体积进样测定峰面积值，制备标准制备梯度浓度对照品溶液，以相同体积进样测定峰面积值，制备标准曲线，并以峰面积值与对照品浓度（或量）作线性回归，计算线性方曲线，并以峰面积值与对照品浓度（或量）作线性回归，计算线性方程和相关系数；程和相关系数；v制备同一浓度的对照品溶液，以不同体积进样测定，同法处理；制备同一浓度的对照品溶液，以不同体积进
7、样测定，同法处理；v线性测定的浓度应尽量在一较宽的范围，线性测定的浓度应尽量在一较宽的范围，一般使待测成分峰面积处于一般使待测成分峰面积处于标准曲线的中间浓度左右为宜；标准曲线的中间浓度左右为宜；v计算相关系数，要求：计算相关系数，要求： TLCSTLCS：R R0.990.99，HPLC-UVHPLC-UV：R R0.9990.999，HPLC-HPLC-ELSDELSD：R R0.995 0.995 13胃灵颗粒质量标准研究胃灵颗粒质量标准研究线性关系考察：线性关系考察：进样量（g）0.15150.3030.6060.9091.212峰面积134.9269.3539.4809.91080.
8、4表表 芍药苷线性范围芍药苷线性范围图图 芍药苷标准曲线芍药苷标准曲线14范围：v范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。用的高低限浓度或量的区间。v考察的区间应尽可能覆盖日后样品可能的含量范围。考察的区间应尽可能覆盖日后样品可能的含量范围。v验证试验过程中除取样量和进样量可改变外，一般不得改验证试验过程中除取样量和进样量可改变外，一般不得改动实验操作过程中规定的如溶剂体积、提取时间、萃取次动实验操作过程中规定的如溶剂体积、提取时间、萃取次数等。数等。15拓展拓展1 1：检测限：检测限 检测限指供试品中被测物
9、能被检出的最低量检测限指供试品中被测物能被检出的最低量 试验方法试验方法 采用已知浓度的对照品进行试验采用已知浓度的对照品进行试验v直观法直观法 如薄层色谱检测成分的检出量或毒性成分检出限量的确定。如薄层色谱检测成分的检出量或毒性成分检出限量的确定。在薄层板上，以已知浓度的对照品点样，依法展开、显色后在薄层板上，以已知浓度的对照品点样，依法展开、显色后目测观察目测观察，可检出的最小量可检出的最小量为检测限。为检测限。v仪器法（信噪比法）仪器法（信噪比法）用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠
10、地度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3 1或或2 1时相应浓度或时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。注入仪器的量确定检测限。16拓展拓展2 2：定量限：定量限（Limit of Quantitative, LOQLimit of Quantitative, LOQ） 定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度其测定结果应具一定准确度和精密度。 试验方法：一般以试验方法：一般以1010倍于噪音倍于噪音的对照品溶液重
11、复点样或进样的对照品溶液重复点样或进样5-65-6次，次，计算重复点样或进样的峰面积值的计算重复点样或进样的峰面积值的RSD%RSD%。当。当RSD%RSD%3%3%（薄层扫描法）（薄层扫描法）或或2%2%（高效液相色谱法（高效液相色谱法/ /气相色谱法）的浓度（或量）为方法的定气相色谱法）的浓度（或量）为方法的定量限。量限。若若RSD%RSD%较大，应重新调整对照品溶液的浓度，进行测定较大，应重新调整对照品溶液的浓度，进行测定 注：中药不需要做定量限，定量限属于有关物质方法学中的一项，主要是考注：中药不需要做定量限，定量限属于有关物质方法学中的一项，主要是考察仪器能检测的该品种的最小浓度。察
12、仪器能检测的该品种的最小浓度。17 精密度（精密度（PrecisionPrecision） 精密度系指在规定的测试条件下，精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀标准品同一个均匀标准品，经，经多次取样测定所得结果之间的接近程度多次取样测定所得结果之间的接近程度( (离散程度离散程度) ) 精密度包括一下三方面：精密度包括一下三方面： 重复性重复性(Repeatability) (Repeatability) 中间精密度中间精密度(Intermediate precision) (Intermediate precision) 重现性重现性(Reproducibility) (Reproduci
13、bility) v精密度考察应使用均匀稳定的、可信的样品。如果得不到，精密度考察应使用均匀稳定的、可信的样品。如果得不到，可用人为配制的样品进行研究。可用人为配制的样品进行研究。18重复性重复性(Repeatability)(Repeatability) 重复性重复性: :在相同操作条件下，由同一个分析在相同操作条件下，由同一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度。精密度。19重复性重复性v实验要求：实验要求： 在规定范围内，在规定范围内，取样品取样品6 6份份，按供试品制备方法，平，按供试品制备方法，平行制备行制备6 6份供试品进样分析，对测定结
14、果进行评价；份供试品进样分析，对测定结果进行评价； 或设或设3 3个不同浓度个不同浓度9 9份样品份样品，用，用9 9个测定结果进行评价个测定结果进行评价（高低浓度可以结合范围的考察设计，中间浓度为样品平（高低浓度可以结合范围的考察设计，中间浓度为样品平均浓度，计算均浓度，计算9 9份样品的相对标准偏差）份样品的相对标准偏差）20重复性重复性v测定数据的精度要求测定数据的精度要求一般应满足以下规定一般应满足以下规定 相对标准偏差相对标准偏差(RSD%)TLCS(RSD%)TLCS5%5%，HPLC/GCHPLC/GC3%3%。21中间精密度中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员在同
15、一个实验室，不同时间由不同分析人员, ,用不同设备用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。测定结果之间的精密度，称为中间精密度。 考察的目的：考察随机变动因素对精密度的影响考察的目的：考察随机变动因素对精密度的影响 考察的因素考察的因素: : 不同时间不同时间 、不同分析人员、不同分析人员、 不同设备不同设备 至少至少3 3人采用同一设备或同一人采用人采用同一设备或同一人采用3 3台不同设备，对台不同设备，对同一批样品测定含量。计算不同操作者或不同设备测定的同一批样品测定含量。计算不同操作者或不同设备测定的含量平均值和相对标准偏差。含量平均值和相对标准偏差。 有重现性考察的，可以免做中
16、间精密度。有重现性考察的，可以免做中间精密度。22胃灵颗粒质量标准研究胃灵颗粒质量标准研究中间精密度：中间精密度：人员人员123RSD%A573.6589.3578.5580.58.031.38B564.1559.9567.2563.73.660.65C582.2569.8574.9575.66.231.08 取批号为取批号为2013091020130910的胃灵颗粒粉末的胃灵颗粒粉末9 9份，每份份，每份1g1g，由不同人员按，由不同人员按供试品溶液的制备方法分别制备供试品，每人制备供试品溶液的制备方法分别制备供试品，每人制备3 3份，分别进样份，分别进样20l20l，测定峰面积，结果表明方
17、法中间精密度良好，结果见下表。，测定峰面积，结果表明方法中间精密度良好，结果见下表。表表 芍药苷中间精密度试验芍药苷中间精密度试验SX 23重现性重现性 在不同实验室由不同分析人员、不同设备测定结果在不同实验室由不同分析人员、不同设备测定结果之间的精密度。之间的精密度。 v考察的目的：当分析方法将被法定标准采用时，应考察的目的：当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。进行重现性试验。v目前阶段，该项试验可采用起草和复核试验的测定目前阶段，该项试验可采用起草和复核试验的测定数据进行评价。但应由起草单位根据复核所的复核数据进行评价。但应由起草单位根据复核所的复核数据，报送两个实验室之间的相
18、对标准偏差。数据，报送两个实验室之间的相对标准偏差。稳定性稳定性v考察原料药或者药物制剂在温度，湿度，光线等影考察原料药或者药物制剂在温度，湿度，光线等影响下随时间变化规律的试验方法。响下随时间变化规律的试验方法。v一般稳定性是取一般稳定性是取0h、2h、4h、8h、12h，等各个时，等各个时间点的供试品进样，是为了考察样品在室温情况下间点的供试品进样，是为了考察样品在室温情况下的稳定程度。的稳定程度。24胃灵颗粒质量标准研究胃灵颗粒质量标准研究稳定性：稳定性：25编号编号0h2h4h8h12hRSD%峰面积峰面积589.5590.6581.8573.3563.4579.711.471.98S
19、X 表表8 芍药苷稳定性试验芍药苷稳定性试验26准确度准确度(Accuracy)(Accuracy) 系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，有时也称真实度，一般用回收率有时也称真实度，一般用回收率(%)(%)表示，用于定量的分表示，用于定量的分析方法均需做准确度验证。析方法均需做准确度验证。 以加入对照品测定的回收率表示，一般有空白回收以加入对照品测定的回收率表示，一般有空白回收（制剂空白）和加样回收测定的方法（中药材、复方制剂（制剂空白）和加样回收测定的方法（中药材、复方制剂等）等） 27 试验方法：试验方法：v同一样品，制备相同
20、浓度的同一样品，制备相同浓度的6 6份份样品（样品取样量减半，以样品（样品取样量减半，以1 1：1 1比例加入对照品）比例加入对照品）v同一样品，制备同一样品，制备3 3个浓度的供试品个浓度的供试品，每个浓度分别制备，每个浓度分别制备3 3份供份供试液，共试液，共9 9份，对照品的加入有以下份，对照品的加入有以下3 3种方式：种方式：28n取相同量样品取相同量样品9 9份份（一般为样品取样量的一半一般为样品取样量的一半），设计），设计3 3个浓度，个浓度，按不同比例加入对照品。按不同比例加入对照品。中间浓度一般按中间浓度一般按1 1：1 1比例加入，比例加入，低、高低、高浓度可选浓度可选0.5
21、0.5：1 1、1.51.5：1 1的比例。加入的对照品的量要适当，保的比例。加入的对照品的量要适当，保证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。n取取3 3个不同量的样品各个不同量的样品各3 3份，每个取样量分别按份，每个取样量分别按1 11 1比例加入对照比例加入对照品，中间浓度应选定在正常测定浓度，其他两个浓度可以品，中间浓度应选定在正常测定浓度，其他两个浓度可以结合范结合范围考察的最高、最低点围考察的最高、最低点进行测定。进行测定。n按标示量计算的组分，可参照化学药品测定方法，取按标示量计算的组分，可参照化学药品测定方法，取9 9份样品
22、，份样品，按按0.80.8：1 1、1 1：1 1、1 1：1.21.2的比例加入对照品（的比例加入对照品（样品取样量减半样品取样量减半）。）。报告的数据：报告的数据： 样品中待测成分含有量样品中待测成分含有量 对照品加入量对照品加入量 测定量测定量 回收率计算值（回收率计算值（% %） 相对标准偏差（相对标准偏差（RSD%RSD%）29测定数据的精度要求测定数据的精度要求v一般应满足以下规定一般应满足以下规定 回收率（回收率（% %） 9595105105 相对标准偏差（相对标准偏差（RSD%RSD%） TLCSTLCS5%5%，HPLC/GCHPLC/GC3% 3% 30胃灵颗粒质量标准研
23、究胃灵颗粒质量标准研究加样回收试验：加样回收试验：31编号编号取样量取样量(g)样品中芍样品中芍药苷含量药苷含量(g)对照品添对照品添加量加量 (g)测定量测定量(g)回收率回收率(%)RSD%10.5014155.9121.2275.698.73101.152.072.0520.5001155.8121.2279.9102.6030.5105156.2121.2284.8103.9640.5198156.2151.5316.0101.8650.5078156.4151.5315.6104.1160.5156157.2151.5310.398.9670.5163156.2181.8343.61
24、00.6780.5224156.2181.8343.299.4290.5044157.0181.8338.7100.02SX 取取1g白芍含量为白芍含量为0.3110mgg-1的胃灵颗粒（批号的胃灵颗粒（批号20130910）粉末）粉末9份，份，分别加入芍药苷分别加入芍药苷101gml-1的对照品的对照品1.2ml、1.5ml和和1.8ml。按照供试品溶。按照供试品溶液的制备方法分别制成低、中、高三个浓度的供试品各液的制备方法分别制成低、中、高三个浓度的供试品各3份，依法进行含份，依法进行含量测定，计算加样回收率和量测定，计算加样回收率和RSD。结果见下表。结果见下表。耐用性耐用性v指测定条件
25、微小的变动，测定结果不受其影响的承指测定条件微小的变动，测定结果不受其影响的承受程度。受程度。v变动因素包括，样品溶液的稳定性，提取次数，时变动因素包括，样品溶液的稳定性，提取次数，时间，流动相比例，柱温，进样口温度，流速，检测间，流动相比例，柱温，进样口温度，流速，检测波长等。波长等。3233举例：举例： 流动相比例、柱温、流速等实验条件的变动均能通过本试验系统适流动相比例、柱温、流速等实验条件的变动均能通过本试验系统适用性试验要求，表明该方法耐用性良好。用性试验要求，表明该方法耐用性良好。验证结果要求如下：验证结果要求如下：v1.专属性实验（制剂）专属性实验（制剂）：以不含被测成分的供试品
26、试验，：以不含被测成分的供试品试验，其含量测定数值应小于同样条件下供试品测定数值的其含量测定数值应小于同样条件下供试品测定数值的5%5%。v2.2.精密度实验精密度实验：相对标准偏差（：相对标准偏差（RSD%RSD%）应小于）应小于3%3%。v3.3.稳定性实验稳定性实验：相对标准偏差（：相对标准偏差（RSD%RSD%）应小于）应小于3%3%。v4.4.准确度实验准确度实验：其回收率的测定结果应在：其回收率的测定结果应在95%95%105%105%范围范围内，其中对于一些前处理较复杂的方法，其回收率的测定内，其中对于一些前处理较复杂的方法，其回收率的测定结果可在结果可在90%90%110%11
27、0%范围内；准确度实验的相对标准偏差范围内；准确度实验的相对标准偏差（RSD%RSD%）应小于）应小于5%5%。34方法学考察中需要注意的几点方法学考察中需要注意的几点v中药不需要做定量限，做个线性关系考察（至少五个点）和中药不需要做定量限，做个线性关系考察（至少五个点）和加样回收率（三个浓度，每个浓度平行三份）即可；加样回收率（三个浓度，每个浓度平行三份）即可；v稳定性考察不属于精密度，他们是不同的考察项目。稳定性考察不属于精密度，他们是不同的考察项目。v中药单味药材没法做专属性考察，中药复方才能做专属性考中药单味药材没法做专属性考察，中药复方才能做专属性考察。察。35含量测定研究常见问题含
28、量测定研究常见问题v药味的选择问题：一般不应选择水解产物如苷元等作指标；药味的选择问题：一般不应选择水解产物如苷元等作指标；v供试品溶液制备考察不全面供试品溶液制备考察不全面 ：如提取方法、提取溶媒、：如提取方法、提取溶媒、提取时间等；提取时间等；v对照品溶液浓度与供试品不匹配；对照品溶液浓度与供试品不匹配；v标准曲线的制备（标准曲线不过原点）、样品测定不在线标准曲线的制备（标准曲线不过原点）、样品测定不在线性范围之内取样、范围太小、单位等问题性范围之内取样、范围太小、单位等问题3637含量测定研究常见问题含量测定研究常见问题v含量测定低于万分之一含量测定低于万分之一v含量测定限度结果的表示不
29、合理含量测定限度结果的表示不合理v色谱条件的选择色谱条件的选择 应详述理由并附相关图谱应详述理由并附相关图谱v方法改变后应与原方法作比较方法改变后应与原方法作比较v对照品溶液的制备对照品溶液的制备 对照品称量难以达到精密称定的要求对照品称量难以达到精密称定的要求v回收率测定问题回收率测定问题38规范实验记录的原则规范实验记录的原则v原始性原始性 实验过程中的内容应一一记录，特别是没有写入实验过程中的内容应一一记录，特别是没有写入 申报资料中的内容申报资料中的内容v真实性真实性 按照实验的步骤如实记录按照实验的步骤如实记录v逻辑性逻辑性 记录数据与申报资料要对应，不应有缺项、漏记录数据与申报资料
30、要对应，不应有缺项、漏 项，项， 不应有不符合逻辑的事项不应有不符合逻辑的事项v规范性规范性 按要求如实记录，如水分、按要求如实记录，如水分、pHpH等项目到底应记录等项目到底应记录 哪些数据哪些数据参考文献：v1 中国药典v2 张永峰, 姬雪礼, 张泽, 等. 止咳化痰片质量标准研究J, 食品与药品, 2013, 4(15) .v 3 胡煊红. 茯苓多糖提取工艺及质量控制研究D. 西南交通大学硕士学位论文, 2012年. v4 孙佰兴. 注射用熊胆粉含量测定方法学研究D. 延边大学硕士学位论文, 2012年.v5 王婕. 当归药材的质量标准与道地性研究D. 兰州大学硕士学位论文, 2012年.v6 江泽. 补金片、补金胶囊质量标准研究D. 吉林农业大学硕士学位论文, 2011年.v7 杨珊. 可可粉的质量标准研究D. 湖北中医药大学硕士学位论文, 2013年.v8 陈晶, 王京辉, 傅欣彤, 等. 高效液相色谱法测定银杏叶提取物中4个酚类化合物的含量J, 药物分析杂志, 2013, 33(5) : 818-821.3940知识拓展4142
