1、2一、实验目的一、实验目的学习掌握琼脂扩散试验的原理与应用学习掌握琼脂扩散试验的原理与应用熟悉掌握其基本操作方法熟悉掌握其基本操作方法3二、实验原理二、实验原理沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在二者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，二者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，可形成肉眼可见的沉淀物的反应。可形成肉眼可见的沉淀物的反应。免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并
2、产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。见的带状或线状沉淀带。4利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。 沉淀线的形状、位置，与抗原的浓度、扩散速度相关。 5琼脂扩散试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂中进行。又可分为单向
3、琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验两类。6应用（1）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行初步估算。（2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗体）（3）抗原或抗体相对分子量的估计双向琼脂扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排孔型、梅花孔型7单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验 是一种常用的定量检测抗原的方法。将适量稀释后的抗体与等量琼脂混匀，浇注成板，凝固后，在板上打孔，孔径3mm，孔间距10mm，孔中加入抗原，每孔10L，放置湿盒中，37温箱，抗原就会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。24h48h后观察结果，在两者比例适当处形成白色沉淀环。沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。
4、如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。 8910双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。 另外沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原，
5、抗体的特异性和浓度，而且与其分子的大小及扩散速度有关，当抗原体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。 11 图1 双向免疫琼脂扩散孔型 三孔型双孔型梅花孔型1213一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带根据沉淀带出现的数目、位置以及相邻二条沉淀带之根据沉淀带出现的数目、位置以及相邻二条沉淀带之间的融合、交叉、分枝等情况，就可了解该复合抗原间的融合、交叉、分枝等情况，就可了解该复合抗原的组成。的组成。14免疫扩散免疫扩散15 免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验 A：Ag、
6、Ab浓度及扩散率近似；B ： Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；D： 扩散率近似，浓度Ag Ab ；E：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab ；F：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系16 免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验 (1) 沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。(2) 沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。(3) 沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。(4) 沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。A1：待检抗原；A
7、2：标准抗原17免疫学及免疫学检验免疫学及免疫学检验抗体效价滴定抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原，用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的最高稀释倍数为该抗体的效价的效价。 18材料与试剂材料与试剂1 1琼脂粉琼脂粉2 2平皿平皿3 3打孔器打孔器4 4生理盐水或其他缓冲液生理盐水或其他缓冲液5. 5. 抗原、抗体抗原、抗体实验实验 1920操作方法操作方法1称取一定量的琼脂粉，按称取一定量的琼脂粉，按1.5%的比例加入生的比例加入生理理盐水或缓冲液，煮沸融化。盐水或缓冲液，煮沸融化。2将融化的
8、琼脂倒入平皿内，使厚度将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm3mm。自然冷却。自然冷却。3根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径之间的距离，包括两孔的半径35mm）打成梅）打成梅花形孔图。花形孔图。21224挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。5在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。6吸取样品加入孔内吸取样品加入孔内(约约15ul)，以加满为度。，以加满为度。7加毕后，盖上平皿盖，将平
9、皿翻过来，置湿加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，盘中，37自由扩散自由扩散24h48h。232425结果判定结果判定用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。26213456双向免疫扩散凝胶染色图双向免疫扩散凝胶染色图271.双扩散用于疾病诊断：双扩散用于疾病诊断：以以IBD诊断为例，中心孔加诊断为例，中心孔加IBD标准阳性血清，周围孔分别标准阳性血清，周围孔分别加加IBD标准抗原、生理盐水、标准抗原、生理盐水、待检抗原待检抗原1.2.3.4。2.双扩散用于抗体检测：双扩散用于抗体检测：以以免疫鸡免疫鸡IBD抗体检测为例，中抗体检测为例，中心孔加心孔加IBD标准抗原，周围孔标准抗原，周围孔分别加分别加IBD标准阳性血清标准阳性血清.、IBD阴性血清、待检血清阴性血清、待检血清1.2.3.4。
