1、王志江王志江 生物科学系生物科学系第七章 发酵产品的分离纯化发酵工程篇发酵工程篇第一节第一节 生物下游加工过程概述生物下游加工过程概述一、生物下游加工过程发酵工程篇发酵工程篇1.基本定义：生物下游加工过程 生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得培养液，从上述培养液中分离、精制有关产品的 过程为生物下游加工过程发酵工程篇发酵工程篇生化分离工程生化分离工程 根据分离过程原理（物理化学、化工根据分离过程原理（物理化学、化工原理、传递过程等）来研究分离过程的原理、传递过程等）来研究分离过程的开发和设计中遇到的一些带有共性的技开发和设计中遇到的一些带有共性的技术问题的学科术问
2、题的学科发酵工程篇发酵工程篇2 .2 .生化产品的类型生化产品的类型2.1 2.1 按用途分类按用途分类 食品类食品类 农业用产品农业用产品 医用类产品医用类产品 生物试剂类生物试剂类 发酵工程篇发酵工程篇2.2 2.2 按分子量大小分类按分子量大小分类 分子量分子量 1000Da 1000Da 1000Da：酶、抗原、抗：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类体、多肽、蛋白质类发酵工程篇发酵工程篇2.3 2.3 按发酵时目的产物所在的位置分类按发酵时目的产物所在的位置分类 cellcell内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质重组蛋白质 cellcell外：抗生素
3、（青霉素、红霉素）、外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（胞外酶（-淀粉酶）等淀粉酶）等发酵工程篇发酵工程篇3.3.生物下游加工过程的重要性生物下游加工过程的重要性1) 1)、生化产品的必经的过程、生化产品的必经的过程2) 2)、中药现代化的重要技术平台、中药现代化的重要技术平台3)3)、提高产品竞争力的关键技术之一、提高产品竞争力的关键技术之一发酵工程篇发酵工程篇4. 4.生物下游加工过程工程的研究内容可分生物下游加工过程工程的研究内容可分为：为： （1 1）确立最佳的分离方法）确立最佳的分离方法 （2 2）确定最佳的分离工艺流程和操作）确定最佳的分离工艺流程和操作条件条件 （3 3）分离设
4、备的选型和设计）分离设备的选型和设计发酵工程篇发酵工程篇二、生物下游加工过程的特点二、生物下游加工过程的特点1. 1.培养液成分复杂培养液成分复杂2. 2.目标物质含量低，而杂质浓度高目标物质含量低，而杂质浓度高发酵工程篇发酵工程篇 几种典型产品发酵液的浓度产品典型浓度/（g/L）单克隆抗体0.5酶20抗生素25有机酸100氨基酸100发酵工程篇发酵工程篇3.3.目标物质稳定性差目标物质稳定性差4. 4.下游加工过程有弹性下游加工过程有弹性5. 5. 注意生物安全性注意生物安全性发酵工程篇发酵工程篇三、生物下游加工过程的一般流程三、生物下游加工过程的一般流程动 、 植 物 组 织 、 体 液
5、等胞 外 产 物提 取发 酵 液预 处 理分 离破 碎碎 片 分 离初 步 纯 化 精 制制 成 品培 养 液加加热热沉沉淀淀匀匀化化离离心心沉沉淀淀分分 子子 筛筛无无 菌菌 过过 滤滤酶 反 应调调p pH H 离离心心超超声声萃萃取取吸吸附附离离子子超超滤滤絮絮凝凝过过滤滤胞胞溶溶过过滤滤萃萃取取亲亲和和冻冻干干错错 流流 过过 滤滤 研研磨磨错错 流流 过过 滤滤超超滤滤吸吸附附喷喷干干憎憎水水结结晶晶电电泳泳动 、 植 物 组 织 、 体 液 等胞 外 产 物提 取发 酵 液预 处 理分 离破 碎碎 片 分 离初 步 纯 化 精 制制 成 品培 养 液加加热热沉沉淀淀匀匀化化离离心心
6、沉沉淀淀分分 子子 筛筛无无 菌菌 过过 滤滤酶 反 应调调p pH H 离离心心超超声声萃萃取取吸吸附附离离子子超超滤滤絮絮凝凝过过滤滤胞胞溶溶过过滤滤萃萃取取亲亲和和冻冻干干错错 流流 过过 滤滤 研研磨磨错错 流流 过过 滤滤超超滤滤吸吸附附喷喷干干憎憎水水结结晶晶电电泳泳 酶酶发酵工程篇发酵工程篇例子：紫杉醇的纯化过程简介红豆衫树皮红豆衫树皮萃取萃取预处理预处理层析层析紫杉醇紫杉醇 蛋白质的分离纯化技术蛋白质的分离纯化技术第二节第二节 产品的分离纯化产品的分离纯化发酵工程篇发酵工程篇v概述概述v影响蛋白质稳定性的因素影响蛋白质稳定性的因素v蛋白质的分离提纯技术蛋白质的分离提纯技术v小结
7、小结发酵工程篇发酵工程篇v蛋白质是一类重要的生物大分子，英文名蛋白质是一类重要的生物大分子，英文名称称proteinprotein，字源出自希腊文，字源出自希腊文,它有它有“最原初的最原初的”、“第一重要第一重要”的意思的意思发酵工程篇发酵工程篇分离蛋白质的目的分离蛋白质的目的v研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质，需要纯的均一的蛋白质样品。性质，需要纯的均一的蛋白质样品。v研究蛋白质的生物功能，需要纯品保持它的天研究蛋白质的生物功能，需要纯品保持它的天然构象。然构象。v制药工业中，需要把某种特殊功能的蛋白质提制药工业中，需要把某种特殊功能的蛋白
8、质提纯到规定的要求，特别是要把干扰或拮抗性质纯到规定的要求，特别是要把干扰或拮抗性质的成分除去。的成分除去。影响蛋白质稳定性的因素影响蛋白质稳定性的因素温度温度蛋白酶蛋白酶缓冲溶液缓冲溶液摇动剪切摇动剪切高压高压发酵工程篇发酵工程篇蛋白质的提取与纯化技术蛋白质的提取与纯化技术v蛋白质的提取v蛋白质的分离纯化发酵工程篇发酵工程篇v提取：把蛋白质从原来的组织或细提取：把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，保持胞中以溶解的状态释放出来，保持天然状态。天然状态。v分离纯化：将所要的蛋白质与其他分离纯化：将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来杂蛋白分离开来。发酵工程篇发酵工程篇蛋白质的提取蛋白质
9、的提取va. a.水溶液提取水溶液提取vb. b.有机溶剂提取有机溶剂提取发酵工程篇发酵工程篇水溶液提取应注意的因素:v盐浓度vpH值v温度v对提取物的保护v表面活性剂发酵工程篇发酵工程篇盐浓度v稀浓度可以促进蛋白质的溶解,同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取时加入少量NaCl等中性盐,一般浓度为0.15mol/l为宜.发酵工程篇发酵工程篇pH值v蛋白质是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内.发酵工程篇发酵工程篇蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化v根据蛋白质溶解度不同的分离方法v根据蛋白质分子大小差别的分离方法v根据蛋
10、白质带电性质进行分离v根据配体特异性的分离方法v其它发酵工程篇发酵工程篇蛋白质溶解度不同的分离方法v蛋白质的盐析(根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法)v等电点沉淀法(各种蛋白质的等电点有差别,利用调节溶液pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀)v低温有机溶剂沉淀法(利用与水可混合的有机溶剂降低溶液的介电常数,导致蛋白质溶解度降低而析出)发酵工程篇发酵工程篇根据蛋白质分子大小的差别的分离方法v透析与超滤(透析法:利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开)(超滤法:利用高压力或离心力强使水及小分子物质通过半透膜,而蛋白质大分子被截留在膜上,达到分离)v凝胶过滤(利用凝胶颗
11、粒为固定相,小分子物质能进入颗粒内部,而大分子却排阻在外,当混合液通过凝胶柱,溶液中的物质就按不同分子量大小筛分开了)发酵工程篇发酵工程篇凝胶过滤原理凝胶过滤原理发酵工程篇发酵工程篇 两组分的凝胶层析分离及洗脱曲线两组分的凝胶层析分离及洗脱曲线 发酵工程篇发酵工程篇根据蛋白质带电性质进行分离v电泳法(各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数的不同而在电场中的迁移率不同而得以分开)v离子交换层析(当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后,通过改变pH或离子强度使吸附的蛋白质洗脱下来)发酵工程篇发酵工程篇根据配体特异性的分离方法v亲和色谱
12、法(利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化)发酵工程篇发酵工程篇发酵工程篇发酵工程篇v亲和层析是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。发酵工程篇发酵工程篇其它其它v扩张床吸附扩张床吸附吸附介质颗粒在向上流动的上清的作用下扩吸附介质颗粒在向上流动的上清的作用下扩张起来，上清中的目标蛋白被吸附于介质张起来，上清中的目标蛋白被吸附于介质上，而细胞和其碎片将通过柱子而流出去，上，而
13、细胞和其碎片将通过柱子而流出去，而洗脱目标蛋白时从相反方向将吸附介质而洗脱目标蛋白时从相反方向将吸附介质压紧，再用洗脱缓冲液将目标蛋白洗下来。压紧，再用洗脱缓冲液将目标蛋白洗下来。通过扩张床吸附技术可大大减少上清的处通过扩张床吸附技术可大大减少上清的处理时间。理时间。发酵工程篇发酵工程篇小结小结v蛋白质的纯化无固定的模式，不同的蛋蛋白质的纯化无固定的模式，不同的蛋白质有不同的纯化方法，同一种蛋白质白质有不同的纯化方法，同一种蛋白质也可采取不同的纯化方法，但最终得到也可采取不同的纯化方法，但最终得到的蛋白质其稳定性和纯度也有所差别，的蛋白质其稳定性和纯度也有所差别，这就涉及到操作者的实践经验及对纯化这就涉及到操作者的实践经验及对纯化艺术的理解艺术的理解。发酵工程篇发酵工程篇 Thank you all Thank you all！
