1、中药生物技术 1.1中药现代化简介 1.1.1 中药：在中医理论的指导下，利用植物、动物和矿物来治疗和预防疾病的药物。 1.1.2 中药现代化：将传统的中医药理论、优势及特色与现代科学技术相结合，利用新工艺、新辅料、新设备、研究现代中药。 1.1.2 我国中药事业的发展概况 丰富的中药资源： 古籍所载多种目前已查明种 建国以来对古籍文献的整理刊行：如神农本草经,本草纲目等. 中药新著的编撰: 中药新学科的建立: 中药教育的振兴: 中药产业的发展: 1.1.3 国际上天然药物的发展趋势 日本、韩国和我国的台湾地区，将中药制成提取物应用，提取物干燥成颗粒或细粉，作为药用原料。 优点：药材内的有效成
2、分利用率高，配药方便，省却了煎煮过程，称量准确，成份明确，制备中成药剂型，工艺简单、规范。 目前，天然药物占药品市场的30%，且需求量日益增大。日本每年以15%的速度增长，占国际市场的80%，天然药物新剂型90%是日本首创。美国每个医学院校都有天然药物有效成分的提取研究。 1.1.4 中药现代化的必要性 我国中药发展现状：中药材过度开发，生产粗放，质量不稳，部分药材农残、重金属超标；品种混乱，中药饮片加工水平低，炮制规范不统一，质量难以保证；中成药单一产品重复生产，主要成份含量差异大，只占国内药品消费市场的1/4，滞后于西药的发展；中药企业大多不规范，产品质量标准未能与国际接轨；新药开发和中药
3、开发投资不足，只占国际市场的4%-5%，绝大多数是中药材原料。 实现中药现代化的必要性：随着社会的发展，人类疾病谱和医疗模式已发生了很大的变化。各种替代医学和传统医学已发挥着越来越大的作用，人类回归自然的呼声越来越高。中药已被更多的国家所接纳。国际上已有170多家公司从事传统药物的研究和开发国外众多跨国集团激烈竞争和亚洲国家传统医药产品冲击，使得我国占5%的国际市场份额日渐萎缩。因此，中药不能拘于传统，应不断创新发展，与国际社会接轨，才能在竞争中立于不败之地。 1.1.5 中药现代化的实施 实施计划：97年“中药现代化科技行动划”，01年“现代中药产业化专项实施方案”，02年“中药现代化发展纲
4、要”。 主要目标：中药现代化（科学内涵建设）和现代化中药（医药产业开发）。 主要措施：加强中药药效物质基础的研究；加强中药提取、分离、分析共性技术平台的建设，即国际通用的7个质量标准和规范GAP、GLP、GCP、GMP、GSP、GUP、GEP； 加强新药开发的临床试验。 1.1.6 中药现代化研究的技术和方法简介 关键是问题是：提取、分离、精制工艺现代化和工程化；质量控制标准化、规范化。即实现“有效、安全、可控”。 超临界萃取技术： 原理：SF在温度和压力均高于临界温度与压力，密度与粘度发生变化，具有惊人的溶解能力，用它可溶解多种物质，然后提取其中的有效成分。 常用超临界流体：水、二氧化碳、氨
5、等，常用的是二氧化碳，优点是，低温、产品无溶剂残留、产品质量稳定、流程简单、效率高、耗能少。 在中草药有效成分提取中的应用：国内外对单味中药的提取种类。超临界萃取技术的优点及应用规律。条件；脂类及亲脂性小分子物质易于提取；亲水性物质须加表面活性剂。 超微粉碎技术： 传统的中药粉碎方法及特点 锤击式、球磨式、流动式、万能粉碎机等，均存在加工中产生大量热能，导致有些有效成分分解等弊端。 超微粉碎技术的应用研究概况 优点：快速、低温；粒体超细、超纯、均匀、收率高；节省原料、利用率高。与传统粉碎技术比较具有的3个优点。 超微粉碎技术与中药现代化：提高有效成分的提取率；改善现有中药固体制剂的品质；开发中
6、药新剂型、新品种。 纳米载药技术： 纳米载药控释系统是运用纳米技术而产生大的一种新型药物载体，具有靶向性、缓释性和表面可修饰性等特点。该系统是纳米级的胶态给药系统粒径介于10-1000纳米 的固体颗粒，其内的药物可通过囊壁沥滤、渗透和扩散释放出来，或基质本身的溶蚀释药。具有较好的包封率对药物可控释、避免降解、泄露以及良好的靶向性。使药物在体内延长作用时间，减少药物剂量减少药物的毒副反应。 纳米技术在中药领域中的应用： 近年来，提取技术的提高，使中药的高度纯化得以实现，为制备微型化的中药剂型提供了条件。当药物的颗粒缩小时，药物与消化道液体的接触面积增大，提高了药物的溶解度、吸收度，提高了药物的利
7、用率。如紫杉醇是从紫杉树中提取的一种抗肿瘤生物碱，采用聚乙烯吡咯烷酮至北斗紫杉醇纳米粒对小鼠淋巴瘤的治疗作用明显高于单纯紫杉醇。 分子生物学： 中药研究与基因组学：人类基因组学研究方法于中医学的整体观整体观、辩证观有很多相似之处。如基因组学的研究由过去对单个基因研究的基础上认识到基因之间相互联系基因之间相互联系的复杂性。中药新药的开发，将迎来一个以分子层次为主导，全层次（包括群体和整体）发展得新时期。 DNA分子标记技术在中药新药开发中的应用： DNA分子标记技术大体分两类，一类是分子标记技术，如RFLP技术，一类是分子诊断技术，如RAPD技术。用于开发新药源或进行中药材的鉴定。 基因芯片技术
8、在中药新药开发中的应用：基因芯片技术目前已用于相关基因的确定和药物筛选的重要工具，进行药物分离和有效成分的鉴定。具有高通量、多因素、微型化和自动化检测的特点，给中药分析带来极大地便利条件。如可设计制备分离生物碱、分离黄酮的芯片，也可设计同时分离筛选集中或多种成分的综合分析芯片。即可用于单味药进行成分筛选性分析，也可对复方进行尝试性归类分析。还可以用来分析疾病发生大过程和药物对机体的作用过程，一次分析中药在体内的药物代谢动力学过程。 谱效关系学： 谱效关系是指将指示物质群特征峰的中药指纹图谱与功效结果的对应关系。因此控制中药药效，不能只针对一、二个化学成分，须对方剂物质群整体予以控制。 研究的进
9、展和应用 已从分子水平上对药材的种质进行鉴定。对中药材化学成分的指纹图谱包括光谱、波谱和色谱几个方面。 光谱指纹图谱：包括紫外光谱、红外光谱和拉曼光谱。用于不同药材真伪的鉴别。 波谱指纹图谱：包括核磁共振和质谱。用于研究有机化合物的分子结构。 色谱指纹图谱：包括薄层色谱指纹图谱、气相色谱指纹图谱、高效液相指纹图谱、高效毛细管电泳指纹图谱等。用于中药成分的分离分析、产品质量的控制等。 中药指纹图谱分析评价： 1.1 WTO与中药现代化 1.2.1 进入WTO带给中药现代化发展的严峻挑战 形势：加入WTO后,西药的仿制难以为继，自主创新近期内难以达到。国际上药物行业强强联合的强劲风潮，及技术壁垒的
10、强化，使得我们必须走独具我国优势、具有自主知识产权的中药产业。 中药发展现状：建国以来，中药有了长足的发展，至02年产值724亿元，占总药值28.7%，销售超亿元的43个，超6亿元的2个，超2亿元的16个，发展快速。但规模小、设备旧、技术落后，制约着产业发展，面临形势严峻。 出路中药现代化：为增加国际竞争能力，须从源头中药材，中间环节中药饮片，终产品中成药诸环节提升生产水平。 1.3 生物制药与中药国际化 一、植物细胞大规模培养的意义及现状 1、意义：植物是天然化合物宝库。植物细胞中含有大量有用的次级代谢产物，种类多，活性显著，可为人类提供药品、杀虫剂、兴奋剂和多种工业原料。目前，全球3/4的
11、人依靠植物药物来防病治病，使药物的重要来源。人们为获得这些产物而盲目采挖，导致了野生资源的日益减少和环境的破坏，使一些珍贵物种濒临绝灭。通过植物细胞的人工培养，不仅使一些濒危物种得到可持续开发利用，而且能向人们提供大量无污染的高产、高活性代谢产物，以满足人们的健康和生活需要。 2、现状： 50年代末首次运用植物细胞培养技术； 60年代首次分离出药用成分呋喃色酮； 80年代末用20000升的发酵罐进行紫草和人参的培养； 90年代初首次申请红豆杉组培的专利，引发细胞培养的热潮； 目前，进行细胞培养的植物见（P108）。 在植物细胞培养中还产生原植物不存在高生物活性的新物质，如生物碱、多糖等。具有诱
12、人的应用前景。 二、植物培养细胞的特点 1、植物细胞的特点及生长曲线： 植物细胞特点：形态比微生物大20100倍；不以单个细胞形式存在，大多形成细胞团，不适合高密度生长；细胞壁较脆，易被搅拌式生物反应器搅伤；细胞生长速度慢周期长易被污染；一般需要光照且好氧；细胞代谢产物多，且易分泌到胞外，造成培养液粘度增大。因此生物反应器的设计要与微生物培养有区别。 植物细胞培养生长曲线与微生物基本相同：延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期。其中稳定后期为收获期。 2、大规模植物细胞培养过程 (1) 高产细胞株系的筛选和驯化： 适于大规模培养的细胞株系具有的条件：生长速度快，代谢产物高，适合悬浮培养。 (2)
13、扩大培养：种子繁育。 (3) 生物反应器培养： 应用传统发酵技术，优化传统发酵工艺，大量生产目的产物。 三、影响植物大规模培养的因素 1、高产细胞株系的筛选 筛选标准：生长速度快，次生代谢产物高。 筛选方法： (1)根据植物基因型筛选，根据植物细胞基因型，利用生化、遗传学和 植物化学等检测技术进行。如对红豆杉细胞系的筛选。 (2)根据细胞的表型筛选，简单有效，主要适于合成色素、蒽醌类化合物细胞系的筛选。如对新疆紫草采用的二步筛选法。 (3)根据单细胞克隆中次级代谢产物含量筛选，利用微室培养单细胞克隆产生愈伤组织，检测每一克隆代谢产物的含量，筛选出高产细胞株系。如地高辛高产株系。 2、悬浮细胞培
14、养的同步化 不同种类化合物的产生和积累在细胞生长周期的不同阶段。为保持细胞生长的同步性和目的代谢产物的高含量，采用以下方法： (1)物理方法 体积选择法：培养一段时间后，用不同网孔的筛网过滤出相同大小的细胞，分别培养。 冷处理法：细胞在4度下数天后添加新培养液进行培养。 (2)化学方法： 饥饿法：控制培养液浓度，使细胞饥饿数天，再添加营养物质培养。 抑制法：培养液中添加化学抑制剂，抑制细胞分裂，使其处于同一细胞周期后再解除抑制。 有丝分裂抑制法：指数生长期，加入一定浓度的秋水仙素，处理46小时。 3、培养基组分对植物细胞大规模培养的影响 培养环境（营养成分）植物生理状态次生代谢产物的合成和积累
15、。 （1 ）碳源：蔗糖是植物细胞培养特别是次生代谢产物生产的最佳碳源和能源；不仅是合成次生代谢产物碳骨架的前提化合物，并能影响到培养基的渗透压，增强戊糖磷酸化途径中有关酶的活性等。 （2 ）氮源：氮源浓度影响代谢产物的产生；不同氮源在次生产物产生过程中所起作用不同。有人研究，降低培养基中总氮浓度能促进黄酮类化合物的形成。不同植物在培养的不同时期，对氮的需求浓度不同，没有一个统一的浓度模式。 （3 ）K离子：合成蛋白质过程中的必要离子，某些特异性酶的激动剂，对植物细胞生长起重要作用。 （4 ）Ca离子：作为细胞内的第二信使，对细胞的生长、增殖具有重要作用。在植物细胞培养中，培养基中增加钙离子浓度
16、会促进某些代谢产物的产生。 （5 ）植物生长调节剂：植物激素能维持脱分化细胞的增殖与生长，还能促进或抑制次生代谢产物的产生和积累。但由于不同植物的生理状态和次生代谢产物不同，植物激素对细胞的影响也无规律可循。 （6）各因素的协同作用：利用各种刺激次级代谢产物产生因素的协同作用，比单因素提高数倍的效果，适于植物细胞的大规模培养。如在红豆杉细胞培养中，分别添加诱导子茉莉酮酸甲酯，蔗糖饲喂时，产量和产率分别为278mg/L和13.0mg/L/D.添加茉莉酮酸甲酯，蔗糖饲喂和18ppm的乙烯,使其产量和产率为336mg/L和20.2/L/D. 4、外在条件对植物大规模培养的影响 （1）氧气、二氧化化碳
17、 微生物培养中，二氧化碳对其生长和发酵有刺激或抑制作用，植物细胞培养对二氧化碳的需求与微生物相同。氧气和二氧化碳需达到某一平衡状态细胞才能正常生长。同期组成的改变，可控制细胞次生代谢物的形成。如地浓度的氧气可促进紫杉醇的合成，较高浓度的二氧化碳浓度可抑制合成。最适气体比为10%V/V氧气和0.5%v/v二氧化碳和5ppm乙烯。但不同植物，对氧和二氧化碳需求不同。 （2）光照 植物细胞培养中，通过脱分化作用，已失去了光合作用能力，故光照强度大可抑制植物细胞的生长，甚至引起细胞自溶死亡。但类胡萝卜素、倍半萜类化合物、吗啡类生物碱须在光诱导下才能合成。 （3）温度 植物细胞生长最佳温度为2028度，
18、但温度的变化，可增加目的产物和中间产物的积累。不同的植物细胞次生代谢产物形成的最佳温度不同，不同温度下，产物的产量也不同。如紫杉醇的产率。 5、培养技术对植物细胞大规模培养影响 （1）前体饲喂: 前体:处于目的次生代谢产物途径上游的物质。 方法:培养液中添加。 (2)诱导子: 原理:植物受外界环境胁迫时产生防御性应答反应，建起防御体系，此体系一般是特定次级代谢产物。 种类:真菌诱导子，真菌细胞壁中的多糖、糖蛋白等，具热稳定性，应用广泛。 内生诱导子，植物组织中受伤或死细胞释放出，刺激周围细胞次级代谢产物的积累。 （3）产物释放技术： 化学方法：添加化学试剂如DMSO、EDTA等 物理方法：温度
19、、电刺激、渗透压冲击等 （4）两步培养法： 生长培养：通过培养基的调配，增进细胞生物量。 生产培养：改进培养基，促进次生代谢产物的生产。 （5）两相培养法： 四、生物反应器及其培养条件对药用植物细胞培养的影响 植物细胞与微生物的差异：由于细胞大小、细胞壁的特点、细胞生长周期、细胞的生理特性等方面，生物反应器与普通的发酵罐也有所不同。 1、培养方式： （1）分批培养：一次加入培养液，一次放出培养产品。简单、污染率低。 2、半连续培养：隔一定时间放出部分培养产物，再补充相同培养液，提高设备利用率。和产物产量。 （3）连续培养：以一定流量连续添加培养基，同时放出相同体积的培养产物。显著提高设备利用率
20、。 2、物反应器类型 根据通气和搅拌类型，将生物反应器分为 1、机械搅拌式：用微生物培养经验，溶氧系数高，反应条件易控制。但剪切力大，对细胞易造成伤害，改进后也可用于生产 2、气升式：利用通入反应器的无菌气流的上升带动培养液进行循环。剪切力小，对细胞的损伤小，利于提高细胞浓度和次生代谢产物的产量。是最好的反应器。 3、鼓泡式 通过反应器底部的喷嘴及多孔板实现气体分散。结构简单，剪切力小，但流体流动形式不确定，混合不均匀。 4、固定化细胞反应器 细胞进行固定化培养 方法：吸附法（细胞吸附在陶瓷等大空隙或裂缝中，易脱落）；包埋法（细胞包埋在琼胶或半透膜中）。 优点（1）细胞固定化后受载体的保护，促
21、进细胞到生长和分化，促进代谢产物的产生；（2）固定化细胞可长时间使用，提高产率；（3）实现细胞的高密度培养，和连续化操作；（4）易于在培养的不同阶段更换培养基，以利生产各种代谢产物。但反应器的混合性差，要求刺激代谢产物需分泌到胞外，限制了其应用。 3、培养条件对细胞培养的影响 （1）溶氧对细胞生长和次生代谢产物的影响：氧气为细胞的生长代谢提供能量，培养液中氧必须保持在临界值以上。细胞生长和供氧量存在线性关系。一般通气量要求为106g.g1/秒（氧气/培养细胞重量）。 调节溶氧的方法有：调节通气量；调节氧分压；调节气液接触时间；调节气液接触面积；改变培养液性质等。 （2）剪切力对植物培养的影响：
22、植物细胞大，液泡占细胞体积的95%以上，细胞壁主要由纤维素组成，剪切力对细胞的生长和代谢产物合成影响很大。如红豆杉细胞培养时，50转/分生物量达5.7/L。100转/分以上时，细胞则不能生长。 （3）细胞的凝集：由于细胞分裂后不能及时彼此分开，结合在一起可形成直径达数毫米的团块。导致团块内部细胞营养物质的匮乏，应及时打碎成小块，但也会由于破坏了细胞间的胞间连丝，影响细胞间信息的联系，造成团块中细胞的代谢产物的产生。因此，要保持细胞团块有一定的大小。 4、诱导子在植物细胞工程中的应用 对人类所需的药物资源，除从植物体内提取和进行化学合成外，还可通过在细胞培育中改变培养基的成分和浓度，加入生长调节
23、剂，基因克隆等方法爱实现。此外，利用诱导子进行有目的的次生代谢产物的调控及生物合成已成为大幅度提高培养物中代谢产物含量的重要方法。 （1）诱导子的作用原理：诱导子是植物抗病生理过程中诱发植物产生抗病毒和引起植物过敏反应的因子。包括外源的微生物和细胞内分子。能快速、高度专一地诱导特定基因的表达 （2）诱导子的种类：分为内源性诱导子内源性诱导子和外源性诱导子外源性诱导子。前者多为植物细胞壁在微生物作用下的降解产物及木质素等。后者称真诱导子，是指病源微生物侵入植物后自身被降解的产物及其代谢产物。应用最多的是真菌诱导子。按其结构分为以下四种：多糖类（几丁质类诱导植保苏、素产生）、糖蛋白类（诱导引发防御
24、反应）、蛋白质类（一些酶类，诱导植物的抗性反应）、来源于隐地霉菌的类蛋白质物质（诱导抗性反应和大量积累植保素）。 （3）诱导子在细胞培养和次生代谢产物合成中的应用。 发现：上世纪90年代，美国一公司进行红豆杉细胞培养发现细胞能合成紫杉醇并有少量分泌到胞外。培养基中加入灭活的真菌孢子诱导子后，促使紫杉醇从细胞中分泌出来，并能进行连续培养。我国科研工作者，也用拟青霉菌菌丝体的粗提物进作诱导子提高紫杉醇的产量，也取得了显著的成效。 应用：将诱导子用于植物细胞的培养，以提高目的产物的产量在国内外越来越热，并取得了骄人的成就。其中应用较多的是真菌。不同诱导子可诱导植物产生不同的次生代谢产物，这些产物对植
25、物有抗病作用，对人类，大多是有益于人类健康的活性成分。 方法：将液体培养的真菌菌丝球高速匀浆，匀浆液高压灭菌后去掉残渣，得菌丝体粗提物，在无菌条件下，将此加入到植物细胞培养液中，做出作用时间曲线。 存在问题：除内源性和酵母菌诱导子无毒外，而目前其它真菌诱导子大都有很强的毒性，对植物细胞有毒害作用。在诱导次生代谢产物形成的同时，也能使部分细胞死亡，细胞的生长率下降，影响次生代谢产物的产量。 降低诱导子浓度，可减少细胞生长的停止状态，但对次生代谢产物的诱导也是部分的。因此，添加的量和时间对不同的培养细胞和不同的诱导子不同，要不断探索，寻找最佳结合。 五、毛状根和冠瘿瘤培养 （一）毛状根培养： 1、
26、概述：发根农杆菌是一种革兰氏阴性菌,能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物,诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。发根农杆菌具有能诱导毛状根产生的质粒。质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250的大质粒,带有冠瘿合成酶基因。在质粒上,存在与转化有关的两个主要功能区,即-(转移区)和(致病区)。当发根农杆菌感染植物时质粒上的-可以转化并插入到植物细胞基因组中,其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。处理菌株后可提高区的表达并明显提高药用植物外植体的转化率。 经发根农杆菌侵染植物形成的毛状根适离体培养能够再生植株,而且许多植物的毛状根在离体培养条件下表现出次生代谢产物的合成能力,产物
27、产量较正常植物及悬浮培养细胞的要高。因此质粒可应用于有价值的次生代谢产物的生产。 近十几年来的研究发现,质粒转化系统比质粒转化系统具有一定的优越性而被广泛重视,而且由其转化获得的转基因植物和生物活性成分的报道愈来愈多,下面主要论述介绍影响遗传转化的因素以及运用毛状根培养技术获得药用植物次生代谢产物。 2、药用植物外植体的选择 选用不同的外植体,如根、下胚轴、芽、子叶、叶柄、叶片、茎切段、带叶幼茎、茎的节间薄片等,都成功实现发根农杆菌对药用植物的遗传转化。其中,茎和叶是使用最多的外植体,而且茎和叶的诱导成功率明显高于其它组织,这主要是因为,幼嫩、易于脱分化的植物组织更易于被农杆菌感染,在感染农杆
28、菌后,感受态细胞较其它部位增多,从而易于进行遗传转化。 3、质粒转化药用植物诱导发根 方法： 外植体共培养法、原生质体共培养转化法和活体接种法。在药用植物转化方面,可用活体接种法成功实现对甘草的转化,但应用最多的是外植体共培养接种法,此方法操作简便,易于转化。 毛状根的转化与鉴定 ： 转化应用发根农杆菌 质粒转化植物时既可以将-上所携带的基因直接转入植物基因组中,又可以先对质粒进行遗传操作,通过中间载体或二元载体将外源基因导入质粒中,再进行遗传转化。经发根农杆菌侵染后的外植体,经过一定的诱导培养和连续的抑菌培养,即可得到脱菌的毛状根。绝大多数转化根具有典型毛状根特征:具大量白色根毛,分支多,向
29、上、贴壁向上或沿培养基水平生长,失去向地性。 毛状根图片： 鉴定发根农杆菌 质粒的-部分整合到宿主植物细胞中后,在转化的细胞中就能合成特异的冠瘿碱。因此,冠瘿碱的有无可做为转化的指标之一。简单的方法是,利用高压纸电泳法检测药用植物毛状根中是否含有冠瘿碱,如果含有冠瘿碱,表明毛状根中确已转入农杆菌的-。更为准确的方法是借助分子手段,经扩增等分析方法证实转化是否成功。 影响转化的因素 ： 发根农杆菌感染植物诱导毛状根的产生与菌株的种类、外植体的材料来源、生理状态、感染时间、预培养和共培养时间、活化因子的使用与否以及所使用的抗生素种类和浓度等因子十分相关。 菌株的影响不同菌株对转化频率有一定的影响。
30、研究发现,在相同的转化条件下,4的转化频率高于1000。如在人参转化过程中,使用菌株1601、91-8、1000、4、15834分别侵染,然而只有15834菌株可转化人参毛状根,这说明不同的菌株具有不同的致根能力。 外植体材料来源及生理状态的影响 不同植物的同一外植体、同一植物的不同外植体以及同一外植体的不同发育阶段的转化效率都有明显的差异。有人用1601菌株感染3种葛属植物,结果表明,三裂叶葛叶片外植体产生毛状根的百分率为28%,而野葛和山葛叶片外植体分别为15%和17%。研究人员用发根农杆菌9402对何首乌叶、叶柄和茎切段感染诱导,发现无菌苗小植株叶的诱导率高达100%,而叶柄和茎的诱导率
31、分别为66.7%和46.7%。这些表明,幼嫩的生长旺盛的组织对农杆菌更敏感,它们被感染后,伤口附近的细胞较易脱分化形成较多的感受态细胞,从而有利于农杆菌诱导毛状根。在进行枸杞转化过程中表明,枸杞的毛状根诱导频率与外植体的发育年龄和生理状态密切相关。无论是叶片切段还是茎切段,较为幼嫩的组织更容易感染发根农杆菌,其中3周龄的叶片切段产生毛状根能力更强,更适合于用4菌株感染试验,以建立枸杞毛状根培养体系。 预培养和共培养时间的影响 预培养和共培养时间对转化效率也有较大的影响,农杆菌感染外植体后,伤口处的细胞因为过敏反应而导致褐化,严重影响根的形成及转化效率。通过一定时间的预培养,能够较好地解决褐化问
32、题,并且能够改变外植体的转化效率。共培养时间的长短与转化的高低密度相关,这是因为发根农杆菌的-转移与整合需要一定的时间,共培养时间不够,则不能完成-转移与整合,转化的毛状根不能实现,适当延长共培养时间能提高转化频率。在长春花毛状根的转化时,发现预培养07后转化的外植体有不同的转化频率,预培养2转化频率最高为44.44%。转化后的外植体共培养05具有不同的转化频率,共培养2转化频率最高为50.70%。 4、毛状根培养与次生代谢产物的产生 毛状根培养 由于每一条毛状根起源于一个细胞,所以将外植体上的每条毛状根逐一分开,作为单克隆进行培养,这样的培养物性能稳定,有利于提高稳定的次生代谢产物。相对于常
33、规细胞培养,毛状根培养系统具有生长快速,不需外源植物激素,合成次生代谢物质能力强而且稳定,向培养液释放部分代谢产物等特点,其克服了植物细胞培养中对外源植物激素的依赖性,并且增殖速度快，有些植物的毛状根在一个生长周期中增殖千倍以上，是其它培养方法所不能比拟的。 次生代谢产物的产生及应用 近年来,利用毛状根转化技术获得次生代谢产物的研究,主要集中在提高一些价格高、产量低、需求量大的药物成分上。据不完全统计,国内外目前已对26科92种药用植物进行了毛状根诱导的研究,建立了长期的毛状根培养系统和获得了次生代谢产物。通过毛状根培养可以生产的次生代谢产物有生物碱类、甙类(如人参皂甙、甜菜甙等)、黄酮类、醌
34、类(如紫草宁等)、多糖类、蛋白质(如天花粉蛋白等)和一些重要的生物酶(如超氧化物歧化酶)。 应用实例： 特点：生长速度快,次生产物含量高 少花龙葵培养4后干重增加420倍,总糖苷生物碱和皂甙含量分别为原植株根的31和107倍。 利用4菌株成功诱导人参产生发根, 人参单体皂甙1含量超过栽培六年生人参根中1含量。 用发根农杆菌对商陆转化,从商陆发状根培养物中测定出,总皂甙含量约为自然根的1.54倍。 决明是含蒽醌类的成分的常用中药,蒽醌类成分具有多种生物活性,如1,8二羟基蒽醌衍生物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗牛皮癣等作用。用生物反应器培养决明发根合成游离蒽醌的研究, 发现在36培养期内收获决明发
35、根761,发根鲜重增殖42倍。 利用栝楼毛状根生产天花粉蛋白,其含量可达每克鲜重中含8.16。近年来,发现天花粉蛋白能够抑制绒毛膜上皮癌细胞的生长和调节免疫反应。还发现天花粉蛋白223能够选择性的抑制爱滋病病毒在感染的免疫系统细胞的复制,降低免疫细胞中受病毒感染的活细胞数。 紫杉醇是从红豆杉属植物中分离出的一种紫杉二萜化合物,是近年来国际公认的最好的抗肿瘤药物之一。由于红豆杉数量稀少,生长缓慢,资源非常有限,紫杉醇的含量有很低,所以仅仅依靠砍伐树木提取紫杉醇的方法远不能满足人们的需要,利用毛状根培养物生产紫杉醇是提供紫杉醇药物来源的最有希望的一种途径。上述实验表明,转化的毛状根大部分能检测到与
36、原植株含量相当或高于原植株含量的次生代谢产物,有些毛状根中的药物成分甚至大大高于原植株的含量,并用于工业化生产。 5、问题与展望 近年来,发根农杆菌介导的药用植物遗传转化的研究取得了一定的进展,尤其在生产次生代谢产物方面得到广泛应用。但从总体来看,转化效率仍然不高,结果也不太稳定,转化成功的药用植物主要集中在大多数双子叶植物上。今后研究的重点应是进一步完善转化技术,(例如,培养条件的优化,毛状根和冠瘿组织的共培养,抗生素除菌和温度法相结合等,建立高效的遗传转化体系,相信通过质粒转化技术,不仅将会生产出更多的次生代谢产物,还可以将有重要价值的目的基因导入药用植物,以达到改良品种的目的。 （二）转
37、基因药用植物的获得 发根农杆菌转化药用植物,可通过不定芽发生途径获得再生植株。刘伟华等用发根农杆菌的不同菌株通过叶盘法对药用植物桔梗进行转化,产生了毛状根,并进一步分化获得了转基因再生植株。利用质粒转化还获得了龙胆、丹参、菘蓝等转基因植株。转化的植株都呈现一定程度的“毛根综合症”,即具有叶片皱缩、节间缩短、植株矮化、须根发达等特征,在育种上有进一步利用与开发的价值。 （三）冠瘿组织培养 有些药用植物的活性成分仅仅在叶片和茎轴中，利用组织培养或毛状根培养不易获得活性成分，但利用冠瘿组织培养的方法，可达到此目的。 冠瘿组织是由根瘤农杆菌感染植物，TI质粒转化后获得冠瘿瘤，经过除菌后从冠瘿瘤培养获得的。 冠瘿组织培养与毛状根培养一样，也具有激素自养、增殖速度快等特点，也可进行液体培养。 冠瘿组织培养的应用实例: 用根瘤农杆菌感染留兰香获得冠瘿瘤，用冠瘿组织进行离体培养时，产生大芳香油主要成分占总含量的94%以上。 利用丹参冠瘿组织生产丹参酮经冠瘿瘤选择得到红色冠瘿组织，丹参酮含量达到原植株的水平。不产生红色素大组织在采取了调控措施后，也能产生丹参酮，并且可使红色素大量分泌到培养液中。
