1、第六章第六章 荧光光谱法荧光光谱法123分析方法分析方法荧光分光光度计荧光分光光度计基本原理基本原理4应用与示例应用与示例 要求要求掌握基本原理掌握基本原理熟悉仪器基本构造熟悉仪器基本构造了解定量方法了解定量方法FL 物质物质分子分子/原子吸收原子吸收光子能量被激发，然后从激光子能量被激发，然后从激发态发态最低最低振动能级返回到基态振动能级返回到基态时所发射出的光时所发射出的光Fluorescence根据物质的荧光谱线位置（波长）及强度进行根据物质的荧光谱线位置（波长）及强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法物质鉴定和物质含量测定的方法Fluorometry有些物质的分子在用紫外有些物质的分子在
2、用紫外-可见光激发时，能发可见光激发时，能发射荧光，由此建立的分析方法射荧光，由此建立的分析方法Molecular Fluorometry61. 灵敏度非常高：检出限可达灵敏度非常高：检出限可达10-1010-12g/ml2. 选择性好选择性好优点优点 基本原理基本原理分子荧光的产生分子荧光的产生荧光光谱的特征荧光光谱的特征影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素8 1. 分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程2. 荧光的产生荧光的产生分子荧光的产生分子荧光的产生基本原理基本原理基态基态单重态单重态单重态单重态三重态三重态（triplet state）（singlet state）激发态
3、激发态M=2S+1=1（S=0）M=2S+1=3（S=1）禁阻跃迁禁阻跃迁1. 分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程基本原理基本原理10光致发光的分子能级示意图光致发光的分子能级示意图各个不同各个不同振振-转能级转能级基本原理基本原理11 辐射跃迁和无辐射跃迁（热能形式）辐射跃迁和无辐射跃迁（热能形式）电子：激发态电子：激发态 基态基态2. 荧光的产生荧光的产生振动弛豫振动弛豫内部能量交换内部能量交换荧光的发射（荧光的发射（辐射辐射）外部能量交换外部能量交换体系间交叉跃迁体系间交叉跃迁磷光的发射（磷光的发射（辐射辐射）基本原理基本原理1. 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱2.
4、荧光光谱特征荧光光谱特征荧光的光谱特征荧光的光谱特征基本原理基本原理 荧光：荧光：先激发先激发后发射后发射发射发射光谱光谱激发激发光谱光谱不同激发不同激发波长引起波长引起某一波长某一波长荧光发射荧光发射相对效率相对效率固定发射波长固定发射波长扫描激发波长扫描激发波长固定激发波长固定激发波长扫描发射波长扫描发射波长发射荧发射荧光中各光中各波长相波长相对强度对强度1. 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱（excitation spectrum and emission spectrum）基本原理基本原理14激发激发、荧光荧光图形图形激发光谱激发光谱变变不变不变Fex图图发射光谱发射光谱不变不变变
5、变Fem图图作用：作用：1. 鉴别荧光物质鉴别荧光物质2. 选择适当测定波长选择适当测定波长基本原理基本原理15激发光谱及荧光光谱激发光谱及荧光光谱A-激发光谱；激发光谱；F-荧光光谱荧光光谱基本原理基本原理16斯托克斯位移斯托克斯位移荧光光谱形状与荧光光谱形状与ex无关无关荧光光谱与激发光谱互为镜像荧光光谱与激发光谱互为镜像2. 荧光光谱特征荧光光谱特征基本原理基本原理17 溶液荧光光谱中，荧光（发射）光谱波长总大于溶液荧光光谱中，荧光（发射）光谱波长总大于激发光谱波长的现象激发光谱波长的现象 说明在激发与发射之间存在能量损失说明在激发与发射之间存在能量损失 1）斯托克斯位移（）斯托克斯位移
6、（Stokes shift, 1852年）年）振动弛豫振动弛豫内部转换内部转换基本原理基本原理18 内转换和振动弛豫使振动激发态电子快速降至内转换和振动弛豫使振动激发态电子快速降至S1*的最低振动能级的最低振动能级荧光发射光谱只有一个发射带荧光发射光谱只有一个发射带 荧光发射通常发生于荧光发射通常发生于S1*最低振动能级，与激发至最低振动能级，与激发至哪一个电子激发态无关哪一个电子激发态无关荧光光谱形态与荧光光谱形态与ex无关无关2）荧光光谱形状与）荧光光谱形状与ex无关无关基本原理基本原理19 电子基态振动能级分布与激发态相似电子基态振动能级分布与激发态相似 E相同相同 小峰间小峰间与振动与
7、振动E有关，强度与跃迁几率有关有关，强度与跃迁几率有关3）荧光光谱与激发光谱互为镜像）荧光光谱与激发光谱互为镜像基本原理基本原理20蒽的能级跃迁蒽的能级跃迁基本原理基本原理21蒽的激发光谱及荧光光谱蒽的激发光谱及荧光光谱S0S2*基本原理基本原理22 1. 荧光产生的条件荧光产生的条件2. 影响荧光强度的结构因素影响荧光强度的结构因素3. 影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素基本原理基本原理231）荧光寿命（）荧光寿命（fluorescence life time） 1. 荧光产生的条件荧光产生的条件 除去激发光源后，分子荧光强度降低到激发时最除去激
8、发光源后，分子荧光强度降低到激发时最大荧光强度的大荧光强度的1/e（37%）所需的时间）所需的时间 常用常用f表示表示 荧光物质重要的发光参数之一荧光物质重要的发光参数之一 f的计算的计算-作图法（作图法（p135）基本原理基本原理24 激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用激发光的光子数之比，常用f表示：表示： f ：01 f 大大有荧光发射有荧光发射2）荧光效率）荧光效率 （fluorescence efficiency） 基本原理基本原理吸收激发光的光子数发射荧光的光子数f25 例如例如:荧光素钠在水中荧光素钠在水中f =
9、0.92荧光素在水中荧光素在水中f =0.65蒽在乙醇中蒽在乙醇中f =0.30菲在乙醇中菲在乙醇中f =0.10基本原理基本原理26 3）产生荧光的条件）产生荧光的条件 分子必须有强分子必须有强UV-Vis吸收吸收有一定的荧光效率有一定的荧光效率能量以无辐射跃迁形式释放（内转换能量以无辐射跃迁形式释放（内转换与外转换的速度很快）与外转换的速度很快） 无无荧光发射荧光发射否否则则基本原理基本原理271）跃迁类型）跃迁类型2）共轭效应（长共轭结构）共轭效应（长共轭结构）3）刚性结构与共平面性效应）刚性结构与共平面性效应4）取代基效应）取代基效应2. 影响荧光强度的结构因素影响荧光强度的结构因素（
10、内部因素）（内部因素）基本原理基本原理28 分子结构中存在共轭的分子结构中存在共轭的*跃迁，也就是跃迁，也就是K带带强吸收时，才可能有荧光发生强吸收时，才可能有荧光发生 1）跃迁类型）跃迁类型基本原理基本原理29 电子共轭程度电子共轭程度 ：荧光强度（荧光效率）荧光强度（荧光效率） 、荧光波长、荧光波长 （长移）（长移）eg: 苯苯 萘萘 蒽蒽ex(nm) 205 268 356em(nm) 278 321 404 f 0.11 0.29 0.362）共轭效应（长共轭结构）共轭效应（长共轭结构） 基本原理基本原理30 同样的长共轭分子：同样的长共轭分子：分子刚性和共平面性分子刚性和共平面性 ，
11、荧光率，荧光率 ，荧光波长，荧光波长 3）刚性结构与共平面效应）刚性结构与共平面效应8-羟基喹啉羟基喹啉8-羟基喹啉镁芴羟基喹啉镁芴基本原理基本原理31 增加分子增加分子电子共轭程度电子共轭程度-含孤电子对的杂原子基团含孤电子对的杂原子基团荧光波长长移荧光波长长移 减弱分子的减弱分子的电子共轭性电子共轭性-吸电子基团吸电子基团荧光减弱甚至熄灭荧光减弱甚至熄灭对对电子共轭体系作用较小电子共轭体系作用较小对荧光的影响不明显对荧光的影响不明显4）取代基效应）取代基效应基本原理基本原理32 1）温度的影响）温度的影响2）溶剂的影响）溶剂的影响3）pH值的影响值的影响4）荧光熄灭剂的影响）荧光熄灭剂的影
12、响5）散射光的影响）散射光的影响3. 影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素基本原理基本原理331）温度：）温度：温度升高温度升高荧光物质的荧光效率和荧光强度下降荧光物质的荧光效率和荧光强度下降原因原因-分子运动速率分子运动速率 碰撞概率碰撞概率 无辐射跃迁无辐射跃迁 2）溶剂：）溶剂：极性极性 ，荧光波长，荧光波长 ，荧光强度，荧光强度 原因原因-*的的E 跃迁几率跃迁几率 紫外和荧光波长紫外和荧光波长 粘度粘度 ，荧光强度，荧光强度 （和温度有关）（和温度有关） 原因原因-分子碰撞概率分子碰撞概率 无辐射跃迁无辐射跃迁 基本原理基本原理34 3）pH值的影响值的影响荧光物质本身是弱酸
13、或弱碱有较大影响荧光物质本身是弱酸或弱碱有较大影响4）荧光熄灭剂：）荧光熄灭剂：引起引起荧光熄灭荧光熄灭的物质的物质荧光熄灭（猝灭）指荧光物质分子与溶剂荧光熄灭（猝灭）指荧光物质分子与溶剂/溶溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象质分子相互作用引起荧光强度降低的现象荧光熄灭的形式：荧光熄灭的形式：a. 碰撞碰撞-荧光自熄灭（溶液浓度过高时）荧光自熄灭（溶液浓度过高时）b. 生成不发光配位化合物生成不发光配位化合物 c. 荧光物质氧化荧光物质氧化基本原理基本原理35 荧光物质中加入某种熄灭剂后，荧光强荧光物质中加入某种熄灭剂后，荧光强度减小与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系度减小与荧光熄灭剂的浓度呈线
14、性关系荧光熄灭法（荧光熄灭法（fluorescence quenching method）利用这一性质测定利用这一性质测定荧光熄灭剂荧光熄灭剂的含量的含量基本原理基本原理365）散射光的影响：）散射光的影响： 瑞利散射瑞利散射 拉曼散射：产生能量损失的拉曼散射影响最大拉曼散射：产生能量损失的拉曼散射影响最大-原因：波长与荧光波长相近原因：波长与荧光波长相近-措施：选择适当的激发波长措施：选择适当的激发波长ex（表（表6-1）硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱基本原理基本原理 主要部件主要部件仪器的矫正仪器的矫正荧光分光光度计荧光分光光度计38荧光分
15、光光度计荧光分光光度计39荧光分光光度计由激发光源、激发单色器和发荧光分光光度计由激发光源、激发单色器和发射单色器、样品池、检测器及读出系统组成射单色器、样品池、检测器及读出系统组成 荧光分光光度计荧光分光光度计主要部件主要部件40 荧光分光光度计结构示意图荧光分光光度计结构示意图荧光分光光度计荧光分光光度计411. 激发光源激发光源 高压氙灯高压氙灯 强谱线的强谱线的连续光谱连续光谱 连续分布在连续分布在250700nm波长范围内波长范围内300400nm波长之间的谱线强度几乎相等波长之间的谱线强度几乎相等 汞灯汞灯 线光谱线光谱高压：近紫外区（高压：近紫外区（365,398,405,436
16、,546,579nm）低压：紫外区（最强低压：紫外区（最强254nm）荧光分光光度计荧光分光光度计422. 单色器（单色器（两个两个） 激发单色器激发单色器置于光源和样品池之间置于光源和样品池之间除去不需要的光线除去不需要的光线获得单色激发光获得单色激发光 发射单色器发射单色器置于样品池和检测器之间置于样品池和检测器之间选择不同的荧光发射波长选择不同的荧光发射波长消除杂散光影响消除杂散光影响荧光分光光度计荧光分光光度计433. 样品池样品池 低荧光的玻璃或石英低荧光的玻璃或石英 方形方形散射光较少散射光较少 90o测量测量消除入射光的背景干扰消除入射光的背景干扰荧光分光光度计荧光分光光度计44
17、4. 检测器检测器 主要：光电倍增管主要：光电倍增管 其他：二极管阵列（色谱）、电荷转移（电泳）其他：二极管阵列（色谱）、电荷转移（电泳） 冷却冷却改善信噪比改善信噪比S/N荧光分光光度计荧光分光光度计455. 读出系统读出系统 数字电压表数字电压表 记录仪记录仪 微机微机荧光分光光度计荧光分光光度计仪器的矫正仪器的矫正影响因素众多影响因素众多以被检出的最低信号表示以被检出的最低信号表示标液矫正标液矫正-硫酸奎宁的检出限硫酸奎宁的检出限/纯水拉曼峰的纯水拉曼峰的S/N灵敏度灵敏度激发激发/荧荧光光谱光光谱波长波长以汞灯的标准谱线对单色器刻度进行校正以汞灯的标准谱线对单色器刻度进行校正采用双光束
18、光路以参比光束抵消误差采用双光束光路以参比光束抵消误差荧光分光光度计荧光分光光度计47 定性分析定性分析 定量分析定量分析 分析方法分析方法48 依据：依据：定性分析定性分析特征光谱特征光谱激发光谱激发光谱 荧光光谱荧光光谱 方法：方法： 对照品对照对照品对照类似于紫外类似于紫外- -可见光谱法，但特征性更强可见光谱法，但特征性更强分析方法分析方法49 1. 荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系2. 定量分析方法定量分析方法 定量分析定量分析尤其适合于尤其适合于痕量物质痕量物质含量测定含量测定分析方法分析方法 荧光荧光物质物质受到受到激发激发发射发射荧光荧光吸收光能吸收光能释放能量释放能量
19、溶液荧光强度与溶液荧光强度与吸收光能程度吸收光能程度荧光效率荧光效率有关有关分析方法分析方法511. 荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系0()FK II010clII0002.3000()(10)()2.3clclFK IIK IIK II eKIllcckc0.05（，即即稀稀溶溶液液）荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度：荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度：L-B定律：定律：定量基础定量基础分析方法分析方法52荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度改进光电倍增管和放大系统改进光电倍增管和放大系统灵敏度极高灵敏度极高vs紫外紫外-可见分光光度法：可见
20、分光光度法：A(-log(I/I0)-c关系关系放大光强信号时放大光强信号时入射光和投射光同时放大入射光和投射光同时放大比值不变比值不变灵敏度不变灵敏度不变分析方法分析方法53 1. 标准曲线法标准曲线法2. 比例法（对比法、一点外标法）比例法（对比法、一点外标法）3. 多组分混合物的荧光分析多组分混合物的荧光分析4. 差示荧光法差示荧光法2. 定量分析方法定量分析方法类似于类似于UV-Vis分析方法分析方法54FL与与UV比较比较 区段：区段：UV-Vis区区 适用性：均可用于定性定量，多用于适用性：均可用于定性定量，多用于定量定量 定量方法：相似定量方法：相似样品性质样品性质: 以以液体液
21、体为主为主用量：少用量：少分析时间：快分析时间：快操作难易程度：易操作难易程度：易相同点相同点 分析方法分析方法55UV FL性性 质质 分子吸收光谱分子吸收光谱 分子荧光光谱分子荧光光谱 应用范围应用范围 广广 荧光的物质，较少荧光的物质，较少 选择性选择性 不高不高 高高灵敏度灵敏度 g/ml10-7 10-1010-12仪器观察角度仪器观察角度 透射光透射光 90 谱线数目谱线数目 12不同点不同点分析方法分析方法56直接荧光法直接荧光法制备荧光衍生物制备荧光衍生物化学引导荧光化学引导荧光荧光熄灭法荧光熄灭法胶束增敏荧光分析法胶束增敏荧光分析法应用与示例应用与示例荧光分析法在药物研究中的应用荧光分析法在药物研究中的应用57荧光新技术荧光新技术激发荧光分析激发荧光分析时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析同步荧光分析同步荧光分析应用与示例应用与示例
