1、授授 课课 内内 容容第四章第四章 微生物的生长和生长发育的控制微生物的生长和生长发育的控制第三节第三节 微生物的纯培养技术和菌种保藏技术微生物的纯培养技术和菌种保藏技术第五章第五章 微生物的生长和生长发育的控制微生物的生长和生长发育的控制第一节第一节 微生物的生长微生物的生长第二节第二节 影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的主要因素第三节第三节 微生物的纯培养技术和菌种保藏技术微生物的纯培养技术和菌种保藏技术第三节第三节 微生物的纯培养技术和菌种保藏技术微生物的纯培养技术和菌种保藏技术 一、无菌室和超净工作台一、无菌室和超净工作台 二、消毒与灭菌二、消毒与灭菌 三、实验室用培养基的制备三
2、、实验室用培养基的制备 四、微生物的接种四、微生物的接种 五、微生物的培养五、微生物的培养 六、微生物菌种的分离纯化六、微生物菌种的分离纯化 补充：微生物的稀释平板混匀分离补充：微生物的稀释平板混匀分离 七、微生物的菌种保藏七、微生物的菌种保藏七、微生物菌种保藏七、微生物菌种保藏 微生物的生长需要一定的水分，适宜微生物的生长需要一定的水分，适宜的温度和合适的营养，菌种保藏就是根据的温度和合适的营养，菌种保藏就是根据菌种菌种特性特性及及保藏目的保藏目的的不同，给微生物菌的不同，给微生物菌株以株以特定的条件特定的条件，使其，使其存活存活而得以而得以延续延续。七、微生物菌种保藏七、微生物菌种保藏（一
3、）菌种保藏的目的和意义（一）菌种保藏的目的和意义（二）菌种保藏原理（二）菌种保藏原理（三）菌种保藏的方法（三）菌种保藏的方法（四）菌种的衰退与复壮（四）菌种的衰退与复壮（一）菌种保藏的目的和意义（一）菌种保藏的目的和意义 菌种保藏的目的：菌种保藏的目的： 防止优良性状菌种的退化或变异。防止优良性状菌种的退化或变异。 注意：在实际工作中菌种的退化或变异是注意：在实际工作中菌种的退化或变异是难以避免的。微生物的遗传与变异是正常难以避免的。微生物的遗传与变异是正常的生物进化规律，变异是绝对的，稳定性的生物进化规律，变异是绝对的，稳定性是相对的。是相对的。（一）菌种保藏的目的和意义（一）菌种保藏的目的
4、和意义 菌种保藏的意义：菌种保藏的意义： 微生物菌种是珍贵的自然资源，通过微生物菌种是珍贵的自然资源，通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在通过各种保藏技术使其在一定时间内一定时间内不死不死亡亡，不会被其他微生物污染不会被其他微生物污染，不会因发生不会因发生变异而丢失重要的生物学性状变异而丢失重要的生物学性状，否则就无，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。因此，菌种或培养物保藏是一项最进行。因此，菌种或培养物保藏是一项最重要的微生物学基础工作，具有重要意义。重要的微生物学基础工作，具有
5、重要意义。（二）菌种保藏原理（二）菌种保藏原理菌种保藏的方法很多，但原理大同小异：菌种保藏的方法很多，但原理大同小异： 首先要挑选优良纯种，利用微生物的孢子、首先要挑选优良纯种，利用微生物的孢子、芽孢及营养体；其次，根据其生理、生化性，人芽孢及营养体；其次，根据其生理、生化性，人为创造为创造低温、干燥、缺氧、避光、缺乏营养等条低温、干燥、缺氧、避光、缺乏营养等条件件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。命以及使菌种保持原有的性状，防
6、止变异。 即在菌种保存过程中要求即在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不死亡、不污染杂菌和不退化。不退化。（三）菌种保藏的方法（三）菌种保藏的方法基本方法生活态培养基传代培养寄主传代培养斜面、平板液氮低温冰箱沙土管冷冻干燥休眠态冷冻真空干燥（三）菌种保藏的方法（三）菌种保藏的方法l主要介绍：主要介绍：1、斜面低温保藏法、斜面低温保藏法2、冷冻干燥保藏法、冷冻干燥保藏法（三）菌种保藏的方法（三）菌种保藏的方法1、斜面低温保藏法、斜面低温保藏法 将生长旺盛无污染的斜面试管放入冰箱将生长旺盛无污染的斜面试管放入冰箱内，在内，在46的低温下保藏，以后每隔的低温下保藏，以后每隔23个月移接于新鲜的斜
7、面培养基上，培个月移接于新鲜的斜面培养基上，培养后再继续保藏（以补充菌株的养分和水养后再继续保藏（以补充菌株的养分和水分，防止菌株老化）。分，防止菌株老化）。（三）菌种保藏的方法（三）菌种保藏的方法1、斜面低温保藏法、斜面低温保藏法优点：最基本、最简单的保藏方法，适用范围广，优点：最基本、最简单的保藏方法，适用范围广，细菌和真菌都可适用。细菌和真菌都可适用。缺点：传代次数多了容易发生缺点：传代次数多了容易发生变异变异，如产生孢子，如产生孢子能力下降、发酵能力减弱、毒性降低甚至基因能力下降、发酵能力减弱、毒性降低甚至基因失落等，传代次数多也容易使失落等，传代次数多也容易使污染机会增加污染机会增加
8、。方法的改进：（方法的改进：（1）采用密封性能较好的螺旋口试）采用密封性能较好的螺旋口试管替代传统的棉塞或目前使用的硅胶塞；管替代传统的棉塞或目前使用的硅胶塞； （2）减少培养基中碳水化合物的）减少培养基中碳水化合物的含量的方法。含量的方法。（三）菌种保藏的方法（三）菌种保藏的方法2、冷冻干燥保藏法、冷冻干燥保藏法 将微生物或孢子冷冻，然后在减压情将微生物或孢子冷冻，然后在减压情况下利用升华现象除去水分，使细胞的代况下利用升华现象除去水分，使细胞的代谢、生理等生命活动处在停止状态下进行谢、生理等生命活动处在停止状态下进行长期保藏。长期保藏。（三）菌种保藏的方法（三）菌种保藏的方法2 2、冷冻干
9、燥保藏法、冷冻干燥保藏法优点：这种方法保藏菌种已有几十年的历史，由于它具有优点：这种方法保藏菌种已有几十年的历史，由于它具有保藏期长、变异小、便于大量保藏及适用范围较广等优保藏期长、变异小、便于大量保藏及适用范围较广等优点，是各保藏机构使用的主要方法（仅有一些不产孢子点，是各保藏机构使用的主要方法（仅有一些不产孢子的丝状真菌不宜用此法），一般可保存数年至十余年。的丝状真菌不宜用此法），一般可保存数年至十余年。缺点：采用小箱式或多孔道的冷冻干燥机，设备和操作都缺点：采用小箱式或多孔道的冷冻干燥机，设备和操作都比较复杂。比较复杂。注意事项：冷冻干燥时的介质对细胞的损伤有显著的影响，注意事项：冷冻干
10、燥时的介质对细胞的损伤有显著的影响，例如，大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶可通过例如，大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此，在与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此，在采用冷冻干燥法保藏菌种时，一般应加入采用冷冻干燥法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂各种保护剂以以提高培养物的存活率。提高培养物的存活率。冷冻干燥保藏法的操作流程冷冻干燥保藏法的操作流程配制保护剂配制保护剂灭菌灭菌菌种菌种培养培养制备菌悬液制备菌悬液分装安培瓶分装安培瓶洗净烘干洗净烘干装标签装标签加棉塞加棉塞预冻预冻真空干燥真空干燥测定水分测定水分熔封管口熔封管口检查真空
11、度检查真空度包藏包藏培养物的冻干过程培养物的冻干过程冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生l保藏保藏冷冻干燥后的培养物在低于冷冻干燥后的培养物在低于55下保下保藏。较低的保藏温度藏。较低的保藏温度(-20(-20-70)-70)对于培对于培养物的长期稳定更好。养物的长期稳定更好。冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生l复苏复苏(1)(1)在超净工作台中用在超净工作台中用7575酒精棉球擦洗安酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿。用手掰开安瓿。(3)(3)在安
12、瓿中加入在安瓿中加入0.50.51ml1ml营养液体培养基，营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。或直接接种琼脂斜面或涂布平板。（四）（四） 菌种的衰退与复壮菌种的衰退与复壮 在生物进化的历史长河中，遗传性的变异是在生物进化的历史长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性反而是相对的；退化性的绝对的，而它的稳定性反而是相对的；退化性的变异是大量的，而进化性的变异却是个别的。变异是大量的，而进化性的变异却是个别的。注意：在自然情况下，个别的适
13、应性变异通过自然注意：在自然情况下，个别的适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向；在选择就可保存和发展，最后成为进化的方向；在人为条件下，人们也可以通过人工选择法去有意人为条件下，人们也可以通过人工选择法去有意识地筛选出个别的正变体用于生产实践中。识地筛选出个别的正变体用于生产实践中。 相反，如不自觉、认真地去进行人工选择，大量相反，如不自觉、认真地去进行人工选择，大量的自发突变菌株就会趁机泛滥，最后导致菌种的的自发突变菌株就会趁机泛滥，最后导致菌种的衰退。衰退。（四）（四） 菌种的衰退与复壮菌种的衰退与复壮1 1、菌种衰退的表现、菌种衰退的表现2 2、菌种衰退的实质、菌种衰
14、退的实质3 3、菌种的复壮、菌种的复壮（四） 菌种的衰退与复壮菌种的衰退与复壮1 1、菌种衰退的表现、菌种衰退的表现（1 1）生长速度缓慢，产孢子越来越少。）生长速度缓慢，产孢子越来越少。（2 2）代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下）代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。降。（3 3）其他原有的典型性状变得不典型，如：最易）其他原有的典型性状变得不典型，如：最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。觉察到的是菌落和细胞形态的改变。（4 4）对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。）对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。（5 5）抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能）抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低
15、温等）能力的减弱等。力的减弱等。（四） 菌种的衰退与复壮菌种的衰退与复壮2 2、菌种衰退的实质、菌种衰退的实质 菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个由量菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变过程。变到质变的逐步演变过程。注意：开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生注意：开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而一味移种传代，则群体中这种负变个体的比例一味移种传代，则群体中这种负变个体的比例逐步增大，最后让它们占了优势，从而使整个逐步增大，最后让它们占了优势，从而使整个群体表现出严重的衰退。群体表现出严重的衰
16、退。所以，在开始时所谓所以，在开始时所谓“纯纯”的菌株，实际上其中的菌株，实际上其中已包含着已包含着一定程度的不纯因素一定程度的不纯因素；同样，到了后；同样，到了后来，整个菌种虽已来，整个菌种虽已“衰退衰退”了，但也是不纯的，了，但也是不纯的，即其中还有即其中还有少数尚未衰退少数尚未衰退的个体存在着。的个体存在着。（四） 菌种的衰退与复壮菌种的衰退与复壮3 3、菌种的复壮、菌种的复壮（1 1）消极的措施：在菌种已发生衰退的情况下，）消极的措施：在菌种已发生衰退的情况下，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施。达到恢复该
17、菌原有典型性状的一种措施。（2 2）积极的措施：在菌种的生产性能尚未衰退前）积极的措施：在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地利用微生物会发生自发突变的就经常有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，特性， 在日常的菌种维护工作中不断筛选在日常的菌种维护工作中不断筛选“正正变变”个体。所以，这实际上是一种利用自发突个体。所以，这实际上是一种利用自发突变（正变）不断从生产中进行选种的工作。变（正变）不断从生产中进行选种的工作。 （四） 菌种的衰退与复壮菌种的衰退与复壮3 3、菌种的复壮、菌种的复壮问题：问题： 利用所学的知识，如何进行菌种复壮？利用所学的知识，如何进行菌种复壮？答答：（：（1 1
18、）纯种分离的方法纯种分离的方法； （2 2）测定生产性能方法；）测定生产性能方法； 等等。等等。国际重要菌种保藏机构国际重要菌种保藏机构缩 写 名 称 A TCC 美 国 标 准 菌 种 保 藏 所 ， 美 国 马 里 兰 州 ， 罗 克 维 尔 市 CBS 真 菌 中 心 收 藏 所 ， 荷 兰 ， 巴 尔 恩 市 NCTC 国 立 标 准 菌 种 保 藏 所 ， 英 国 ， 伦 敦 国内重要菌种保藏机构国内重要菌种保藏机构缩写 名称 缩写 名称 ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所 SH 上海市农业科学院食用菌研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 IA 中国医学科学院抗菌素研究所 SIA 四川抗菌素工业研究所 CCGMC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS 中国科学院微生物研究所 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 NICPB 卫生部药品生物制品监察所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 CIVBP 中国兽医药品监察所 YM 云南省微生物研究所
