1、模板模板（TemplateTemplate）：基因组、质粒：基因组、质粒DNADNA、cDNAcDNA，也可以使细菌、组织样品等。，也可以使细菌、组织样品等。引物引物（PrimerPrimer）：确定扩增目的序列的：确定扩增目的序列的特异性；确定扩增产物长度。特异性；确定扩增产物长度。DNADNA聚合酶聚合酶（DNA PolymeraseDNA Polymerase）：推动）：推动PCRPCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。反应进行的机器。扩增效率和保真性。缓冲液缓冲液（BufferBuffer）：控制体系的：控制体系的pHpH和离和离子强度，为子强度，为DNADNA聚合酶提供最佳工作环境。
2、聚合酶提供最佳工作环境。脱氧核苷酸脱氧核苷酸（dNTPdNTP）：DNADNA的基本组成的基本组成元件，包括元件，包括dATPdATP、 dGTP dGTP、 dCTP dCTP、 dTTP dTTP。MgMg2+2+、K K+ +、增强剂、增强剂1.1.变性变性：高温使双链：高温使双链DNADNA解离形成单链解离形成单链（9595，30s30s）。）。2.2.退火退火：低温下，引物与模板：低温下，引物与模板DNADNA互补互补区结合区结合（4545 6565，30s30s） 。3.3.延伸延伸：中温延伸。：中温延伸。DNADNA聚合酶催化以聚合酶催化以引物为起始点的引物为起始点的DNADNA
3、链延伸反应（链延伸反应（ 7272，3030 60s 60s ）。）。 理论理论：2 2n n递增（递增（n n为循环次数），为循环次数），如果扩增如果扩增3030循环，目标循环，目标DNADNA可增加可增加2 23030也就是也就是10109 9倍。倍。 实际实际：由于引物和底物的消耗，：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行性形式，所以实际上进行3030个循个循环后，扩增倍数一般可达环后，扩增倍数一般可达10106 6 10107 7。1.1.早期早期（E E期）期）: :
4、引物在单链引物在单链DNADNA模板上搜索互补序列模板上搜索互补序列 ，并与特定位点杂交。并与特定位点杂交。2.2.中期中期（M M期）：扩增反应期）：扩增反应顺利进行，产物呈指数型增顺利进行，产物呈指数型增长。长。3.3.晚期晚期（L L期）：平台期，期）：平台期，DNADNA聚合酶过度损耗或者产聚合酶过度损耗或者产物的抑制。物的抑制。循环循环PCRPCR反应条件反应条件9494 5min5min9494 30s30s56.256.2 30s30s7272 30s30s7272 7min7min4 4 PC1-P20PC1-P20：模板：基因组模板：基因组DNADNA；产物：；产物：506b
5、p506bp举个例子举个例子PCRPCR体系（体系（10 L10 L）模板：模板：1 L1 L上游引物：上游引物：0.2 L0.2 L下游引物：下游引物：0.2 L0.2 LEasy Taq Easy Taq 酶：酶：0.1 L0.1 LEasy Taq BufferEasy Taq Buffer：1 L1 LdNTPdNTP：0.8 L0.8 LddHddH2 2O O：6.7 L6.7 L3030个循环个循环1.1.避免避免PCRPCR试剂的污染试剂的污染2.2.最适合的反应条件最适合的反应条件3.3.设置对照组：设置对照组：PCRPCR空白对照：空白对照：在反应体系中剔除反应模板。在反应
6、体系中剔除反应模板。PCRPCR阴性对照：阴性对照：即反应体系中用无关的基因片即反应体系中用无关的基因片段代替目的模板。段代替目的模板。PCRPCR阳性对照：阳性对照：即反应体系中以已知能够成功即反应体系中以已知能够成功进行特异性扩增的模板。进行特异性扩增的模板。1.1.为什么完全没有为什么完全没有PCRPCR扩增产物？扩增产物？试剂质量问题或者加样时出错，导致反应试剂质量问题或者加样时出错，导致反应体系不完整。体系不完整。聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。PCRPCR仪温度控制不精确。仪温度控制不精确。模板模板DNADNA发生降解。发生降解。引物或反
7、应温度设计不合理引物或反应温度设计不合理靶片段靶片段GCGC含量过高或扩增对象长多含量过高或扩增对象长多常见问题常见问题2.2.为什么出现多条非特异性条带？为什么出现多条非特异性条带？反应体系被污染。反应体系被污染。引物特异性差。引物特异性差。退火温度不合适。退火温度不合适。常见问题常见问题3.3.为什么为什么PCRPCR产物很少？产物很少？聚合酶活性过低。聚合酶活性过低。循环次数偏低。循环次数偏低。模板模板DNADNA浓度过低。浓度过低。常见问题常见问题4.4.为什么为什么PCRPCR产物出现片状拖尾？产物出现片状拖尾？DNADNA聚合酶过多或酶活性差。聚合酶过多或酶活性差。dNTPdNTP
8、和和MgMg2+2+浓度过高。浓度过高。退火温度过低，退火温度过低，PCRPCR循环数偏多。循环数偏多。模板模板DNADNA用量过大或模板用量过大或模板DNADNA不纯。不纯。引物特异性差、引物间形成二聚体导致非引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特意扩增。特意扩增。常见问题常见问题普通普通PCRPCR仪仪温度梯度温度梯度PCRPCR仪仪实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR仪仪 为了找到一对合适的核苷酸片段，为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板使其能有效地扩增模板DNADNA序列。序列。 引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键，同特异性反应的关键，同时也与时也与PCRPCR扩增
9、的效率密切相关。扩增的效率密切相关。引物设计的最重要的原则：引物设计的最重要的原则：最大限度最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。能减少非特异性扩增。引物设计的目的引物设计的目的1 1、引物应具有足够的特异性。、引物应具有足够的特异性。 如果需要从如果需要从基因组基因组等较复杂的模板中扩等较复杂的模板中扩增特定的增特定的DNADNA序列，则需要考虑目的序列，则需要考虑目的DNADNA序列序列的的保守性保守性，尽量避免所选引物设计区域序列，尽量避免所选引物设计区域序列的的非特异性非特异性。 引物与非特异序列的同源性不超过引物与非特异序列的同源
10、性不超过70%70%或有连续或有连续8 8个互补碱基个互补碱基。 NCBI Primer BLASTNCBI Primer BLAST 引物设计的基本原则引物设计的基本原则2 2、避开易形成二级结构的模板序列区、避开易形成二级结构的模板序列区域。域。 分子内互补、发夹结构、分子间互补分子内互补、发夹结构、分子间互补。 二级结构会这家引物与模板杂交以及二级结构会这家引物与模板杂交以及PCRPCR的困难，因此要尽可能避开这种序列区的困难，因此要尽可能避开这种序列区域。域。 用有关软件预测用有关软件预测mRNAmRNA的稳定二级结构。的稳定二级结构。 引物设计的基本原则引物设计的基本原则3 3、引物
11、长度一般为、引物长度一般为18-3018-30个碱基之间。个碱基之间。 引物长度与反应的特异性和解链温度成引物长度与反应的特异性和解链温度成正相关正相关。过短：过短：扩增特异性下降扩增特异性下降过长：过长：引物自身形成二级结构，以及引物二引物自身形成二级结构，以及引物二聚体。聚体。引物设计的基本原则引物设计的基本原则4 4、G+CG+C含量一般为含量一般为40%-60%40%-60% 引物的碱基组成也会对引物的解链温度引物的碱基组成也会对引物的解链温度产生影响。产生影响。G+CG+C含量过低：含量过低：引物解链温度低，引物易于引物解链温度低，引物易于从模板上解离。从模板上解离。G+CG+C含量
12、过高：含量过高：引物解链温度高，易与非特引物解链温度高，易与非特异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。引物设计的基本原则引物设计的基本原则5 5、T Tm m值之差应小于值之差应小于1 1，最适退火温度，最适退火温度在在55-6055-60。 一对引物的一对引物的TmTm值差过大可直接导致值差过大可直接导致PCRPCR扩增效率下降或失败。扩增效率下降或失败。 对于对于20bp20bp左右的引物：左右的引物： T Tm m（）=2=2（A+TA+T）+4+4（G+CG+C） 一般情况下，一般情况下，PCRPCR的最佳退火温度比引的最佳退火温度比引物物T Tm m
13、值低值低5 5左右。左右。引物设计的基本原则引物设计的基本原则6 6、引物中四种碱基最好是随机分布的、引物中四种碱基最好是随机分布的 避免避免4 4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。特别是引物的特别是引物的33端端不应有连续不应有连续3 3个个G G或或C C，否，否则会使引物在则会使引物在G+CG+C富集序列区域产生错配，富集序列区域产生错配，降低扩增的特异性。降低扩增的特异性。引物设计的基本原则引物设计的基本原则7 7、引物自身及引物之间不应存在互补、引物自身及引物之间不应存在互补序列。序列。 引物自身互补引物自身互补发夹结构发夹结构 引物之间互补引物之间互补二聚
14、体二聚体 引物引物自身自身连续互补碱基不应超过连续互补碱基不应超过3 3个个，引物引物之间之间连续互补碱基不应超过连续互补碱基不应超过4 4个个，尤其，尤其避免避免33端的互补重叠。端的互补重叠。引物设计的基本原则引物设计的基本原则8 8、引物的、引物的55端可以修饰，端可以修饰，33端不可端不可以修饰。以修饰。 引物的引物的55端决定着端决定着PCRPCR产物的长度，它产物的长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生物素、引入点突变等。物素、引入点突变等。 由于延伸是从由于延
15、伸是从33端开始的，所以不能端开始的，所以不能进行任何修饰。进行任何修饰。引物设计的基本原则引物设计的基本原则9 9、引物的、引物的33端不可以端不可以A A结尾。结尾。 引物引物33端错配时，不同碱基引发效率端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，存在着很大的差异，当末位的碱基为当末位的碱基为A A时，时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为而当末位链为T T时，错配的引发效率大大降时，错配的引发效率大大降低，低，G G、C C错配的引发效率介于错配的引发效率介于A A、T T之间，所之间，所以以33端最好选择端最好选择T T。引物设
16、计的基本原则引物设计的基本原则1010、引物、引物33端要避开密码子的第端要避开密码子的第3 3位。位。 如扩增序列位于基因编码区域，引物如扩增序列位于基因编码区域，引物33端不要终止于密码子的第端不要终止于密码子的第3 3位，因密码子的位，因密码子的第第3 3位易发生简并，会影响扩增的特异性与位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。效率。引物设计的基本原则引物设计的基本原则1 1、避免重复碱基，尤其是、避免重复碱基，尤其是G G。2 2、引物退火温度在、引物退火温度在58-6058-60之间。之间。3 3、G+CG+C为为30-80%30-80%。 4 4、33端最后端最后5 5个碱基内不能
17、有多于个碱基内不能有多于2 2个的个的G G或或C C。5 5、引物的产物大小一般在、引物的产物大小一般在80-250bp80-250bp之之间；间；80-150 bp80-150 bp最为合适（可以延长至最为合适（可以延长至300 bp300 bp）。）。Real-Time PCRReal-Time PCR引物设计原则引物设计原则6 6、要特别注意避免引物二聚体和非特、要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。异性扩增的存在。7 7、Real-Time PCRReal-Time PCR引物的扩增产物应引物的扩增产物应跨外显子，最好是引物能跨外显子的跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，
18、以避免基因组接头区，以避免基因组DNADNA污染影响。污染影响。 Real-Time PCRReal-Time PCR引物设计原则引物设计原则Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0Oligo 6Oligo 6Primer 3Primer 3（在线）（在线）Primer-BLASTPrimer-BLAST（在线）（在线）引物设计常用软件引物设计常用软件File New DNA sequenceFile New DNA sequence粘贴模板序列粘贴模板序列引物搜索引物搜索引物位置引物位置产物大小产物大小引物长度引物长度Primer BLASTPrimer BL
19、AST 由一条由一条RNARNA单链转录为互补单链转录为互补DNADNA（cDNAcDNA）称作逆转录）称作逆转录PCRPCR（Reverse Reverse Transcription PCRTranscription PCR，RT-PCRRT-PCR），由依），由依赖赖RNARNA的的DNADNA聚合酶（逆转录酶）来完聚合酶（逆转录酶）来完成。成。 逆转录逆转录PCRPCR的原理的原理逆转录逆转录PCRPCR的原理的原理逆转录逆转录PCRPCR的反应体系的反应体系1 1、模板、模板RNARNA2 2、逆转录酶、逆转录酶3 3、逆转录引物逆转录引物Thanks！ 93-9693-96，较高的
20、温度变性，较高的温度变性更快更彻底，尤其是对富含更快更彻底，尤其是对富含G+CG+C的靶序列而言。的靶序列而言。 退火温度与时间取决于引物的退火温度与时间取决于引物的碱基组成碱基组成、长度长度和和浓度浓度。退火温度。退火温度可以通过计算推断，通常采用可以通过计算推断，通常采用温度温度梯度梯度PCRPCR的方法进行摸索。的方法进行摸索。 45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 MPC1-P20 PC1-P20 退火温度摸索退火温度摸索 延伸的温度通常为所以延伸的温度通常为所以DNADNA聚合聚合酶的最适工作温度，一般
21、为酶的最适工作温度，一般为7272；延伸的时间主要取决于延伸的时间主要取决于目的片段的目的片段的大小大小，不同种类的聚合酶的合成效，不同种类的聚合酶的合成效率也不同，因此还与率也不同，因此还与DNADNA聚合酶的种聚合酶的种类类有关。有关。 Easy Taq Easy Taq：1-2kb/min1-2kb/min TransStart Taq:1-2kb/min TransStart Taq:1-2kb/min FastPfu: 2-4kb/min FastPfu: 2-4kb/min循环数：循环数： 在其他参数都已优化的条件下，在其他参数都已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓最适循
22、环数取决于靶序列的初始浓度。一般情况下度。一般情况下30-3530-35个循环即可。个循环即可。循环数太多：循环数太多：会增加非特异扩增产会增加非特异扩增产物的数量和复杂性。物的数量和复杂性。循环数太少：循环数太少：PCRPCR产量太低。产量太低。逆转录引物：逆转录引物： （1 1）随机六聚核苷酸引物）随机六聚核苷酸引物 仅长仅长6 6个核苷酸，每个核苷酸位点上随个核苷酸，每个核苷酸位点上随机加入机加入4 4中不同的脱氧核苷酸，因此是中不同的脱氧核苷酸，因此是4 46 6中中不同引物的集合体。不同引物的集合体。 所有所有RNARNA分子均可以充当模板，合成的分子均可以充当模板，合成的cDNAcDNA中有中有96%96%来自来自rRNArRNA。逆转录引物：逆转录引物： （2 2）OligoOligo（dTdT） 仅由仅由dTTPdTTP构成，长度一般为构成，长度一般为18-18-2424个核苷酸。个核苷酸。 识别识别mRNAmRNA的的33端端polypoly（A A）尾，）尾，因此仅因此仅mRNAmRNA可被逆转录。可被逆转录。逆转录引物：逆转录引物： （3 3）特异性引物）特异性引物 能与目标能与目标RNARNA碱基序列互补的寡碱基序列互补的寡核苷酸引物，仅产生待分析基因的核苷酸引物，仅产生待分析基因的cDNAcDNA。
