1、健康大讲堂健康大讲堂-检验专题第五讲检验专题第五讲检验科检验科 生化检测技术生化检测技术制备离心制备离心差速密度梯度分析离心分析离心沉降速度沉降平衡等密度区带吸收光谱吸收光谱发射光谱发射光谱火焰光度、荧光散射光谱散射光谱比浊气相气相高效液相高效液相离心电化学光谱电泳层析醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦等电聚焦双向电泳双向电泳电位分析法电位分析法离子选择电极（直接、间接） 玻璃膜 Na+、K+、气敏电极 NH3、CO2酶电极 尿酶电极电导法电导法电容量法电容量法主要内容主要内容光谱分析技术光谱分析技术电化学分析技术电化学分析技术影响因素影响因素 交
2、叉污染交叉污染结果审核报告结果审核报告据仪器的结构原理不同 连续流动式（管道式如SMA系列） 分立式（BECKMAN CX；Hitachi-7系列） 离心式（Encore、Cobas） 干片式四类 据仪器的复杂程度及功能 小型、中型、大型据仪器的自动化程度 全自动和半自动自动生化分析仪类型自动生化分析仪类型连续流动式离心式分立式固定比色杯，用清洗减少互染率，速度慢。不同的比色杯, 适合相同波长项目的批量检测。不同的反应比色杯，可以样本为单位检测优点结构简单，价格便宜，无比色杯的吸光性差异。1.避免了互染，提高了比色 的准确性。 2.提高了分析速度。1.使用灵活。2.样本试剂比范围宽。3.应用范
3、围宽。缺点1.互染率高，标本间、试剂间相互影响不可避免。2.每次使用后需要长时间冲洗才能进行下一次测定，速度极慢。3.随着离心式的产生而被淘汰。1.加样比色分离，自动化程度低；2.按项目检测，使用不灵活；3.使用不同比色杯存在吸光度差；4.样本试剂比范围狭窄；5.因要离心，对比浊分析有影响；6.温控与反应分别，温控不能反映反应温度。三种生化仪的比较三种生化仪的比较 贝克曼贝克曼DxC 拜尔拜尔全自动生化分析仪基本结构全自动生化分析仪基本结构v 条形码适读系统条形码适读系统v 反应系统反应系统自动生化自动生化分析仪分析仪样品样品试剂试剂系统软件系统软件数据传输数据传输反应反应比色比色数据处理数据
4、处理水、洗液水、洗液清洗针清洗针生化分析仪基本结构生化分析仪基本结构加样系统加样系统反应比色池反应比色池光电检测器光电检测器数据处理系统数据处理系统控制器单元控制器单元前提前提核心核心功能的扩展功能的扩展保证保证全自动生化分析仪基本结构示意图全自动生化分析仪基本结构示意图附件：附件：供排水供排水电源供应电源供应样本杯样本杯/ /管、样本架、进样轨道管、样本架、进样轨道) )v 分配加样装置分配加样装置( (注射器、步进马达、加样臂、样注射器、步进马达、加样臂、样品探针品探针) )样本进行预稀释样本进行预稀释) )v 样品探针样品探针样品（样品（Sample）系统）系统样品样品(Sample)系
5、统系统）v 分配加液装置（注射器、步进马达、加样臂、分配加液装置（注射器、步进马达、加样臂、试剂探针）试剂探针）v 试剂探针试剂探针试剂（试剂（Sample）系统）系统试剂试剂(Reagent)系统系统试剂试剂(Reagent)系统系统条形码（条形码（Barcode）识读系统）识读系统反应（反应（Reaction）系统）系统清洗（清洗（Wash）系统）系统清洗清洗(Wash)系统系统 光源光源 比色杯比色杯 单色器单色器 检测器检测器 数据处理及显示数据处理及显示比色系统比色系统光光 源源比色杯比色杯v干涉滤光片干涉滤光片 光学干涉滤光片是建立在光学干涉滤光片是建立在光学薄膜干涉光学薄膜干涉原
6、理上的精密光学滤原理上的精密光学滤光器件。通过设计和改变膜系的结构和膜层的光学参数，可以获光器件。通过设计和改变膜系的结构和膜层的光学参数，可以获得各种光谱特性，用于控制、调整和改变得各种光谱特性，用于控制、调整和改变光波的透射、反射、吸光波的透射、反射、吸收、偏振或相位状态。收、偏振或相位状态。 v光栅光栅 光栅是根据光的光栅是根据光的衍射原理衍射原理进行分光的，具有可用进行分光的，具有可用波长范围宽波长范围宽，色散近于线性，谱线均匀并且光能损失少。平面反射光栅是生化色散近于线性，谱线均匀并且光能损失少。平面反射光栅是生化分析仪最常用的分光元件。但光栅单色器有次级光谱干扰，同时分析仪最常用的
7、分光元件。但光栅单色器有次级光谱干扰，同时杂散光影响也较棱镜大。光栅光谱的谱线随刻线的距离减少而增杂散光影响也较棱镜大。光栅光谱的谱线随刻线的距离减少而增大，因此单位长度内的刻线数是光栅单色器的重要指标。光栅分大，因此单位长度内的刻线数是光栅单色器的重要指标。光栅分光可分为光可分为全息反射式光栅全息反射式光栅和和蚀刻式凹面光栅蚀刻式凹面光栅两种。两种。单色器单色器前分光特点前分光特点；光源经一系列透镜反射后成为单色光通过样本，因此只能进行相同波长项目的检测。后分光特点后分光特点：可连续不断检测不同波长的反应，适用于多项目检测，目前全自动生化仪多用此法分光。v 微处理器和主机电脑微处理器和主机电
8、脑v 显示器显示器v 系统及配套软件系统及配套软件 采用采用Windows-NTWindows-NT或或WindowsWindows界面界面 人机对话人机对话v 数据传输数据传输 通过通过RS 232CRS 232C等数据接口与其它计算等数据接口与其它计算 机、打印机等设备传输数据机、打印机等设备传输数据方法学检测原理方法学检测原理 光谱分析技术光谱分析技术 生化检验反应原理生化检验反应原理 分析监测方法分析监测方法二、临床生化检验反应原理二、临床生化检验反应原理v酶偶联法 -脱氢酶法 ALT AST LDH-L MB HBDH CK BUN 340nm -氧化酶法 GLU TC TG UA
9、Cr 550nmv色原底物法 -AMY ALP GGT 405nmv化学法 TBIL DBIL Ca Mg TP ALB Cr 630nmv免疫比浊法 IgG A M C3 C4 CRP ASO RF APOA APOB NADH和NADPH在340nm有最大吸收峰，而NAD+和NADP+在340nm无吸收峰，利用其偶联的脱氢酶(工具酶)反应，根据340nm吸光度的变化，可以测定物质的浓度或活性。 目前利用此指示系统进行测定的临床项目有：ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、-HBDH 、Glu（己糖激酶法）、UREA、NH4+ 、CO2等。：R1： NADH 、乳酸脱氢酶（LDH）R2：
10、 L-丙氨酸 、-酮戊二酸 ALTL-丙氨酸 +-酮戊二酸 丙酮酸 + L-谷氨酸 LDH丙酮酸 + NADH + H+ L-乳酸 + NAD+ + H2O p-NP和p-NA在405nm有特征性吸收峰，根据405nm吸光度的变化，可以测定物质的浓度或活性。 目前利用此指示系统进行测定的临床项目有ALP、r-GT、AMY等。ALP为例：为例：R1：AMP缓冲液 、MgCl2 R2：对硝基苯磷酸盐 ALP对硝基苯磷酸盐+H2O 磷酸盐+对硝基苯酚 H2O2在过氧化物酶的作用下，可使单一个或成对的无色的色素原氧化成有色的色素，导致某一波长吸光度的增加，因此可用来测定物质的浓度或活性。 目前利用此指
11、示系统进行测定的临床项目有TC、TG、HDL-C、LDL-C、Glu（氧化酶法 ）、Cr、UA等。GLU为例：为例：R1：4-氨基安替吡啉 、抗坏血酸氧化酶R2：葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、酚 。 GOD葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 POD2H2O2 + 4-氨基安替吡啉+酚 醌亚胺 + 4H2OTP为例：为例： 蛋白质中的肽键在碱性溶液中与铜离子作用产生紫红色络合物，导致540nm吸光度的增加，增加程度与蛋白质的含量成正比。 碱性条件碱性条件 肽键肽键 + Cu2+ 紫红色络合物紫红色络合物 特异性抗体与抗原(待测物质)在相应的缓冲环境下反应生成抗原抗体复合物，形成一定
12、的浊度，导致特定波长透光率的改变。在抗体过剩的前提下，改变程度与抗原浓度成正比。 目前利用此指示系统进行测定的临床项目有apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CRP等。载脂蛋白为例：载脂蛋白为例：R1：磷酸盐缓冲液pH7.5,表面活性剂，防腐剂， 稳定剂；R2：羊抗人apo Al（apo B）抗血清，防腐剂， 稳定剂 。抗原(血清中apo Al,apo B)+抗体(R2) 缓冲环境 抗原抗体免疫复合物。光谱分析技术光谱分析技术 吸收散射可见400-750nm紫外200-400nm散射比浊透射比浊概念不同分子结构物质对光选择吸收通过混悬颗粒后的光吸收或散射不同分类
13、 可见光度 紫外光度 散射光 透射光吸收特性 A=b.c.三次方程曲线特点灵敏度高、选择性好快速、定量应用Glu、Bun、ALT、CKIg、C3、Apoa、IinIoutT= Iout / IinA= - lg TTA100%0.0050%0.3010%1.001%2.000.1% 吸收光谱法：比色分析基于溶液对光的选吸收光谱法：比色分析基于溶液对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法。择性吸收而建立起来的一种分析方法。 比浊法：通过监测物质对光的散射透射强比浊法：通过监测物质对光的散射透射强度来测定的方法，比浊法是一种浊度测定，而度来测定的方法，比浊法是一种浊度测定，而不是比色测定。不是比色
14、测定。 检 测 方 法分光光度法分光光度法 分光光度法依据的原理为某样品，如：病人样品、质控品或定标液，和一个或多个化学试剂混和后，产生某物质，该物质具有对特定波长吸收光的能力。该物质称为发色团（CHROMOPHORE）。 郎伯郎伯-比尔定律比尔定律 发色团吸收的光量和欲测定的成分之浓度呈比例。 A = d c 式中 A = 发色团的吸光度 = 在特定测定波长下吸收物质的吸收率 d = 比色杯光径（cm） c = 成分浓度（mmol/L）l摩尔吸光系数摩尔吸光系数 在一定下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度 TV*A/min SV = - SVFSVF=-（样本体积分数） SV*C*d
15、TVl全自动生化仪摩尔吸光系数和因数值因数值（值或F值） 的检查和校正 TV*103 F F = - SV*C*d 若为毫摩尔吸光系数，值乘以1000 为摩尔吸光系数，值不需乘1000 TV-总反应体积SV-标本体积-毫摩尔吸光系数 d-比色杯内光径SVTVdALU/1/10min/6）酶活力（CSVTVdA/1/1）摩尔吸光度（SVTVdK/1/106令KALUmin/ ）酶活力（注：公式中A/min为1min吸光度的变化值，TV为反应液的总体积，SV为样品体积，d为比色杯光径（cm），C为标准液浓度（mol/l）CdA朗伯比尔定律： 终点法终点法 一点终点法一点终点法 二点终点法二点终点法
16、 动力学法（零级动力学法）动力学法（零级动力学法） 固定时间法（固定时间法（一级动力学法）一级动力学法） 一点终点法计算公式：一点终点法计算公式： C C样本样本(A(A样本样本A A试剂空白试剂空白/A/A标准标准A A试剂空白试剂空白) )C C标准标准 C C标准标准/ /（A A标准标准A A试剂空白试剂空白） C C样本样本（A A样本样本A A试剂空白试剂空白）二点终点法（样本空白法）公式：二点终点法（样本空白法）公式： C C样本样本(A(A样本样本A A样本空白样本空白/A/A标准标准A A标准空白标准空白) )C C标准标准 C C标准标准/ /（A A标准标准A A标准空白
17、标准空白） C C样本样本（A A样本样本A A样本空白样本空白） 因数法：因数法：A A样本样本A A样本样本A A试剂空白试剂空白 C样本样本（A样本样本/min）F A样本样本/min：每分钟样本吸光度变化率：每分钟样本吸光度变化率 反应度计算：反应度计算：检 测 方 法 摩尔消光系数法摩尔消光系数法 ： C C样本样本 A A样本样本/min/minV Vt t10001000 V VS Sd d F F VtVt10001000 VsVsd d 10001000 d d (1+ ) )：摩尔消光系数：摩尔消光系数 d:d:比色杯光径（比色杯光径（cmcm） Vt：总反应量：总反应量
18、V VS S：样品量：样品量 V VR R：试剂量：试剂量 检 测 方 法 固定时间法公式：固定时间法公式：A AA At4t4A At3 t3 C C样本样本( ( A A样本样本/ / A A标准标准) )C C标准标准 C C标准标准/ / A A标准标准 C C样本样本 A A样本样本 反应度计算：反应度计算： R R（A At4t4A At3t3）/ /（t4t4t3t3） 检 测 方 法检 测 方 法免疫比浊法：免疫比浊法： 免疫透射比浊法：是在光源的光路方向测量免疫透射比浊法：是在光源的光路方向测量透射强度，用终点法测量。用于血清特种蛋白透射强度，用终点法测量。用于血清特种蛋白的
19、检测。的检测。 免疫散射比浊法：常用于血凝仪中。免疫散射比浊法：常用于血凝仪中。化学比浊法化学比浊法校 准 品 K KC C标准标准/ /（A A标准标准A A试剂空白试剂空白） 决定因素：决定因素： 1、标准液浓度，最好是血清基质，否则、标准液浓度，最好是血清基质，否则可能会因为基质效应而影响定标效果。可能会因为基质效应而影响定标效果。 2、标准液吸光度与试剂空白吸光度要准、标准液吸光度与试剂空白吸光度要准确。吸光度受仪器状况、试剂状况的影响，确。吸光度受仪器状况、试剂状况的影响，如果您的仪器相当稳定，试剂如果您的仪器相当稳定，试剂是影响是影响K值的一个主要因素。值的一个主要因素。 更换试剂
20、厂家；更换试剂厂家； 同一试剂厂家但更换批号；同一试剂厂家但更换批号； 试剂过长时间使用。试剂过长时间使用。 校 准 品校 准 品 线性定标线性定标 单点线性单点线性 两点线性两点线性 多点线性多点线性 非线性定标非线性定标 SPline Logistic-Log 4PLogistic-Log 5P校 准 品 校 准 品 RCC1C2C3C4校 准 品 校 准 品 RCC1C2C3C4C 校 准 品F F VtVt10001000 VsVsd d 10001000 d d (1+ ) ) 在临床测试中，外界环境因素、试剂本在临床测试中，外界环境因素、试剂本身底物浓度和身底物浓度和PHPH值，都
21、无法提供和保证理论值，都无法提供和保证理论测量状态，所以应用理论测量状态，所以应用理论F F在测量时可能会在测量时可能会存在误差。因此推荐用校准存在误差。因此推荐用校准F F，它能消除仪，它能消除仪器偏差，将试剂系统误差降器偏差，将试剂系统误差降到最低。到最低。校 准 品 必须使用配套的试剂；必须使用配套的试剂； 必须使用配套的高质量的校准品。必须使用配套的高质量的校准品。 将干粉校准品打开，按要求将干粉校准品打开，按要求准确准确加入定量加入定量的复溶液体（蒸馏水），在手心中划的复溶液体（蒸馏水），在手心中划“8”8”字字复溶，复溶，30min30min后上机测量和分装。后上机测量和分装。 开
22、盖时缓慢旋转启开瓶盖，不要开盖时缓慢旋转启开瓶盖，不要溅出溅出里面里面的粉末；复溶时不要剧烈振荡，避免产生大量的粉末；复溶时不要剧烈振荡，避免产生大量气泡气泡；一定复溶完全，；一定复溶完全，30min30min后测量；分装后后测量；分装后冷冻避光冷冻避光保存，用前复溶，冻保存，用前复溶，冻溶溶一次一次后弃掉。后弃掉。 校 准 品操 作 人 员 操作人员的操作习惯是由我们装机工程师操作人员的操作习惯是由我们装机工程师规定规定和和指导指导养成的。操作人员的操作习惯直接养成的。操作人员的操作习惯直接反映装机人员的能力。反映装机人员的能力。 作 用 1、用化学方法来阐述疾病的发生发展过程；、用化学方法
23、来阐述疾病的发生发展过程； 2、协助临床诊断某些疾病，鉴别诊断疾病；、协助临床诊断某些疾病，鉴别诊断疾病； 3、协助分析病情、观察疗效、判断愈后；、协助分析病情、观察疗效、判断愈后； 4、指导安全用药，监护治疗；、指导安全用药，监护治疗； 5、术前准备；、术前准备； 6、有助于预防疾病和职业病的普查，为预防、有助于预防疾病和职业病的普查，为预防疾病提供资料；疾病提供资料； 7、有助于遗传病的预测。、有助于遗传病的预测。三、分析监测方法三、分析监测方法v终点法终点法TimeAA2A1CHOt1 t2两点终点法ATBILTime一点终点法A0Aet0te方法学原理方法学原理l终点法终点法（平衡法）
24、（平衡法）是指被测物质在反应过程中达到反应终点时被测物质与产物达到一个动态的化学平衡动态的化学平衡，据终点吸光度的大小求出被测物浓度。测量的值是设定的时间最后测定的吸光度值l不计算每分钟的变化吸光度l不计算和监测反应的非线性 两点法两点法指样品和单一试剂混合后分别读取延滞期后和反应一定时间后的吸光度，计算待测物浓度。或使用双试剂，加入样品后分别读取试剂1、2吸光度值，计算待测物浓度。可消除样品、试剂的颜色、浊度及干扰物对测定的影响。该方法用于解决某些反应的非特异性问题。方法学原理方法学原理三、分析监测方法三、分析监测方法v连续监测法（速率法）连续监测法（速率法）AA/minTimeALTALP
25、ATimeA/min方法学原理方法学原理在速率速率项目中，反应进行时的某特定时间间隙内，进行一系列测定记录。在某时间间隔内有效测定其吸光度变化速率吸光度变化速率是分析浓度的函数。特别是在测定时间间隙内，记录下表现出反应中最佳线性部分的吸光度最佳线性部分的吸光度读数。读数。方法学原理方法学原理三、分析监测方法三、分析监测方法v固定时间法（两点速率法）固定时间法（两点速率法）ABATimet1 t2A/min=（B-A）/（t2-t1）ABUNABTimet1 t2A/min=（B-A）/（t2-t1）Cr方法学原理方法学原理l校准物名称，批号，失效期l校准曲线类型l校准标本种类l校准次数l校准物
26、浓度l吸光度范围lF值l校准稳定时间方法学原理方法学原理方方 法法 学学五、校准曲线类型五、校准曲线类型方方 法法 学学l选择合适合适的校正物：比如说质量要好，要与自己的 测定系统配套等。 日立7170使用宝灵曼的试剂和校准品在贝克曼生化分析仪上使用贝克曼的试剂和校准品 l注意校正物的保存保存：包括复溶前和复溶后，使用说明书上一般会告知复溶后不同项目在不同环境下稳定的时间，注意在规定时间内使用。 l注意复溶复溶的方法：注意用水、手法，复溶后一般要稳定一段时间（大约30分钟）后再用。 l不能反复冻融不能反复冻融。 l注意选择对应的方法学的定值。方方 法法 学学选择合适的校准品选择合适的校准品：质
27、量好、与测定系统配套 日立7170使用宝灵曼的试剂和校准品贝克曼生化分析仪上使用贝克曼的试剂和校准品 注意校准品的保存注意校准品的保存：包括复溶前和复溶后，使用说明书上一般会告知复溶后不同项目在不同环境下稳定的时间，注意在规定时间内使用。 注意复溶的方法注意复溶的方法：注意用水、手法，复溶后一般要稳定一段时间（大约30分钟）后再用。 不能反复冻融不能反复冻融。 注意选择对应的方法学的定值注意选择对应的方法学的定值。校准品校准品l一点校准方方 法法 学学l两点校准方方 法法 学学l多点校准方方 法法 学学a) 理论理论K值值：根据理论摩尔消光系数（）来 计算，如NADH为6.22103b) 实测实测K值值：由于仪器波长的精密及半宽度不同，而应根据实测值来设定K值c) 厂家给的厂家给的K值值：厂家生产试剂盒说明书上提供的K值d) 校准校准K值值：通过校准物直接校准得到的K值方方 法法 学学生化分析仪临床应用生化分析仪临床应用 分析仪参数设置分析仪参数设置 试剂选择试剂选择 校准品选择校准品选择 仪器操作流程仪器操作流程 仪器主要性能指标及评价仪器主要性能指标及评价临床应用临床应用
