1、中心法则中心法则（the central dogma)the central dogma)DNARNAProtein转录转录翻译翻译复制复制复制复制反转录反转录1958 F.Crick 1970 H.Temin (逆转录逆转录)Chapter 5Chapter 5 DNA replicationDNA replication复复 制制 概概 念念 遗传信息从亲代遗传信息从亲代DNADNA传递到子代传递到子代DNADNA分分子上，称为子上，称为复制复制，这是生物体内高分，这是生物体内高分 子的聚合过程，即子的聚合过程，即DNADNA的生物合成。的生物合成。第一节第一节 DNADNA复制的基本方式
2、复制的基本方式一、半保留复制一、半保留复制（semiconservativesemiconservative replication) replication) 复制时母链的双链复制时母链的双链DNA解开成各自作解开成各自作为模板指导子代合成互补链；为模板指导子代合成互补链；子代的两条链：亲代链新合成链；子代的两条链：亲代链新合成链；由于碱基互补，子代由于碱基互补，子代DNA双链和亲代双链和亲代DNA碱基序列一致。碱基序列一致。AGAACTTAGTCTTGAATCTCTTGAATC通过半保留复制，子代通过半保留复制，子代DNA和亲代的和亲代的DNA是一致的是一致的AGAACTTAG重新合成的子
3、代链重新合成的子代链TCTTGAATCAGAACTTAG母链母链意意 义义 子代保留了亲代子代保留了亲代DNA的全部信息；的全部信息； DNA通过复制和基因表达决定生物特性；通过复制和基因表达决定生物特性； 体现了遗传过程的相对保守性；体现了遗传过程的相对保守性； 保守性是相对的，不能忽视其变异性。保守性是相对的，不能忽视其变异性。复制叉移动方向复制叉移动方向前导链前导链冈崎片段冈崎片段后随链后随链二、半不连续性二、半不连续性（semidiscontimitysemidiscontimity）不连续复制不连续复制 连续复制连续复制概念概念复制叉、前导链、后随链、冈崎片段复制叉、前导链、后随链、
4、冈崎片段第二节第二节 DNA复制的酶学复制的酶学 复制是在酶催化下的复制是在酶催化下的核苷酸核苷酸聚合聚合过程，需要多种高分子物质过程，需要多种高分子物质共同参与。共同参与。dNTPDNA-pol单链的单链的DNA母链母链RNA引物引物其它辅助因子其它辅助因子5 TCA3 5 3 OH3 A GTCAAGTGA5GPP-PHOdTTPdATPdCTP复制过程中的脱氧核苷酸聚合复制过程中的脱氧核苷酸聚合 代表引物代表引物C5 TCTOHP PP3 v DNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase）v DNA螺旋酶螺旋酶 v 拓扑酶拓扑酶v 引物酶引物酶v 连接酶连接酶v 其它相关酶和蛋白质其
5、它相关酶和蛋白质一、一、DNA聚合酶（聚合酶（DNApolymeraseDNApolymerase）原核生物：原核生物：DNA-pol I II III 真核生物：真核生物：DNA-pol 原核生物原核生物DNA聚合酶聚合酶NC小片段小片段35kDa大片段（大片段（Klenow片段）片段）68kDa5 3 5 3 核酸核酸外切酶活性外切酶活性DNADNA聚合酶聚合酶活性活性3 5 3 5 核酸核酸外切酶活性外切酶活性蛋白酶蛋白酶DNA-pol I（ 103kDa）结构特点结构特点1、由、由18个个 -螺旋区组成；螺旋区组成；2、蛋白酶水解产生、蛋白酶水解产生2个片段：个片段：小片段：有小片段：
6、有53外切酶活性外切酶活性大片段：有大片段：有DNA聚合酶活性及聚合酶活性及3 5外切酶活性。外切酶活性。Kornberg酶,1956 主要作用：主要作用：填补填补复制修复复制修复空隙空隙(53(53外切酶活外切酶活性性) )校正校正复制中复制中错误错误( (一条分子量一条分子量120kDa的多肽链的多肽链活性很低活性很低能促进能促进DNA合成合成有有35的外切核酸酶活性的外切核酸酶活性，无，无53外外切酶活性切酶活性 在在DNA的修复中起一定作用的修复中起一定作用 DNA-pol IIKornberg,GefterKornberg,Gefter, 19701971, 19701971真正负责
7、大肠杆菌细胞内合成真正负责大肠杆菌细胞内合成DNA的复的复制酶（制酶（Replicase）；）；10种亚基组成的种亚基组成的不对称二聚体；不对称二聚体；核心酶核心酶(core enzyme)：具有核苷酸聚合：具有核苷酸聚合的作用；的作用； 35外切酶活性。外切酶活性。DNA-pol IIIKornberg,GefterKornberg,Gefter, 19701971, 19701971 E.coli DNA 聚合酶聚合酶不对称二聚体不对称二聚体 核心酶核心酶( , , )原核生物原核生物DNA聚合酶的比较聚合酶的比较 酶活性酶活性 5 3 聚合酶活性聚合酶活性 3 5 外切酶活性外切酶活性
8、分子大小（分子大小（kd） 250 36-38 163-300 170 256细胞内定位细胞内定位 核核 核核 线粒体线粒体 核核 核核功能功能 引物酶活性引物酶活性 修复修复 复制复制 主要主要 校读、修校读、修 复制复制 （无其它（无其它 聚合酶聚合酶 复、填补复、填补 DNA-pol时）时）真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA解旋酶解旋酶/DNA解旋蛋白解旋蛋白（DNA DNA unwinding proteinunwinding protein）：催化双螺旋催化双螺旋DNA的的解旋和解链，该过程需水解解旋和解链，该过程需水解ATP提供能提供能量。量。二、二、DNA解旋酶解旋酶（
9、DNA helicaseDNA helicase）解旋酶解旋酶和和rep蛋白蛋白；解旋酶解旋酶：沿着后随链的模板，从：沿着后随链的模板，从53方向移动，促使复制叉向前延伸；方向移动，促使复制叉向前延伸；rep蛋白蛋白：沿着前导链的模板，以：沿着前导链的模板，以35方向向前移动，从而促进双链不断解开。方向向前移动，从而促进双链不断解开。三、三、DNA拓扑异构酶拓扑异构酶（DNA TopisomeraseDNA Topisomerase ） 原核和真核生物中都发现二类拓扑异构酶：原核和真核生物中都发现二类拓扑异构酶： Topo和和Topo 原核生物：原核生物：Topo与复制有关与复制有关 Topo
10、与转录有关与转录有关真核生物：真核生物：Topo和和均与复制有关均与复制有关。作用：通过切断、旋转和再连接作用，理作用：通过切断、旋转和再连接作用，理顺顺DNA链。链。 DNA结合蛋白对单链结合蛋白对单链DNA有高亲和力，能特异地结合到有高亲和力，能特异地结合到分开的单链分开的单链DNA上。对上。对DNA复制区形成的单链复制区形成的单链DNA有稳定有稳定作用。作用。 在真核生物中，一种单链在真核生物中，一种单链DNA结合蛋白称之复制蛋白结合蛋白称之复制蛋白A（replication protein A,replication protein A, RPA）结结合到暴露的单链上。合到暴露的单链上
11、。三、单链三、单链DNA结合蛋白结合蛋白 (single- strand DNA binding protein,(single- strand DNA binding protein,SSBSSB) )解螺旋酶解螺旋酶 helicasehelicaseDNA拓朴异构酶拓朴异构酶 DNA topoisomeraseDNA topoisomerase单链单链DNA结合蛋白结合蛋白 SSB解开解开、理顺理顺DNA链、维持链、维持DNA单链单链状态状态四、四、DNA引物酶引物酶( (PrimasePrimase) )引物酶引物酶：复制是在一段：复制是在一段RNA引物上加入引物上加入脱氧核苷酸，而催化
12、引物合成的脱氧核苷酸，而催化引物合成的RNA聚聚合酶。合酶。目的目的：尽量减少：尽量减少DNA复制起始处的突变。复制起始处的突变。五、五、DNA连接酶连接酶( (DNA ligaseDNA ligase ) )DNA连接酶连接酶：催化冈崎片段间：催化冈崎片段间磷酸二磷酸二酯键的形成酯键的形成； 注意注意：连接碱基互补基础上双链中的：连接碱基互补基础上双链中的单链缺口，单链缺口，不能连接单独存在的不能连接单独存在的DNA或或RNA单链单链。连接酶连接模板链上相邻两个片段的切口连接酶连接模板链上相邻两个片段的切口 v解螺旋酶：解螺旋酶：解开解开DNA双螺旋双螺旋vDNA拓朴异构酶：拓朴异构酶：理顺
13、理顺DNA链链v单链单链DNA结合蛋白：结合蛋白：稳定维持稳定维持DNA单链状态单链状态v前导链的合成前导链的合成：在：在聚合酶聚合酶III与与滑动夹子滑动夹子结合结合下连续合成。下连续合成。v尾随链的合成尾随链的合成：解旋酶解旋酶（DnaBDnaB）和和引物酶引物酶（DnaGDnaG）沿着模板移动。每沿着模板移动。每1000-2000bp合成合成一个引物。一个引物。聚合酶聚合酶III延伸引物，一直达到前一延伸引物，一直达到前一个冈崎片段为止。个冈崎片段为止。聚合酶聚合酶I去除去除RNA引物，并引物，并填补留下的空隙。填补留下的空隙。连接酶连接酶封闭最后缺口。封闭最后缺口。 各种酶与蛋白质的作
14、用小结各种酶与蛋白质的作用小结复制复制基本过程基本过程起始起始 延长延长 终止终止大肠杆菌大肠杆菌DNA复制的相关酶和蛋白质复制的相关酶和蛋白质蛋白质蛋白质作用作用DnaB蛋白开始解链引物酶(DnaG)合成RNA引物rep蛋白(解链酶)解开双链SSB(单链结合蛋白)稳定单股链区DNA旋转酶(拓扑异构酶)引入负超螺旋DNA pol全酶合成DNADNA pol去除引物，补充空隙DNA连接酶连接DNA片段DnaA蛋白连接DNA片段辨认起始点DnaC蛋白运送和协同DnaB（一）复制的起始（一）复制的起始(initiation)一、原核生物的一、原核生物的 DNA 生物合成生物合成引发体生成引发体生成引
15、物合成引物合成DNA 解链解链vDnaA蛋白、蛋白、rep蛋白、蛋白、SSB 和和 拓扑酶共同拓扑酶共同参与。参与。v起始点（起始点（ori C） 固定单一起始点固定单一起始点 跨度跨度 254 bp 结构：结构：3 组串联重复序列组串联重复序列（识别区）（识别区） 2 对反向重复序列对反向重复序列（富含（富含AT）1、DNA 解链解链Dna BDna CDna ASSBDNA大肠杆菌起始点大肠杆菌起始点: : DNA- DNA-蛋白质复合物的类核小体结构蛋白质复合物的类核小体结构Dna AaDNADnaA蛋白识别、结合于蛋白识别、结合于ori C的重复序列的重复序列vDNA 解链的基本过程解
16、链的基本过程bDnaA蛋白与蛋白与DNA形成形成复合物，促使解链复合物，促使解链c在在DnaC的协助下，的协助下，DnaB结合于初步打开的双链，结合于初步打开的双链，并用其解螺旋酶活性使双并用其解螺旋酶活性使双链解开一定长度链解开一定长度v在解链基础上，引物酶进入形成引发体。在解链基础上，引物酶进入形成引发体。v引发体引发体 为含解螺旋酶、引物酶和为含解螺旋酶、引物酶和DNA复制起始区的复合物。复制起始区的复合物。2、引发体形成：、引发体形成：3、引物的生成：、引物的生成：v引发体移动过程中，在适当位置引物酶引发体移动过程中，在适当位置引物酶催化引物生成。催化引物生成。复制的起始复制的起始(i
17、nitiation)复制方向（复制方向（5 3）半不连续复制半不连续复制冈崎片段冈崎片段前导链前导链滞后链滞后链（二）复制的延长（二）复制的延长(elongation)5 5 3 3 3 5 不连续复制不连续复制随从链随从链复制叉复制叉冈崎片段冈崎片段 连续复制连续复制领头链领头链引物水解（引物水解（RNA酶）酶）补缺（补缺（DNA-pol I ）连接（连接酶）连接（连接酶）（三）复制的终止（三）复制的终止(termination)0/10050Ori C82ter32E.Coli 基因图基因图双向复制双向复制终止点（终止点（Ter）：）：基本过程基本过程二、真核生物的二、真核生物的DNA生物
18、合成生物合成（一）复制的起始（比较原核生物）（一）复制的起始（比较原核生物） 1、过程同原核生物：、过程同原核生物： 解链解链 引发体形成引发体形成 生成引物生成引物 2、特点：、特点： 起始点结构较起始点结构较 ori C 短短（ 酵母为酵母为11bp，富含，富含AT，称为自主复制序列称为自主复制序列 autonomouse replication sequence，ARS） 多起点（多复制子）多起点（多复制子） 时序性（分组激活，非同步进行）时序性（分组激活，非同步进行）3、参与酶和蛋白因子：、参与酶和蛋白因子： DNA-pol （引物酶活性）（引物酶活性） DNA-pol （解螺旋酶活性
19、）（解螺旋酶活性） 拓扑异构酶拓扑异构酶 复制因子复制因子（RF，如：，如：RFA、RFC） 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）4、通过细胞周期实现其调节：、通过细胞周期实现其调节： 细胞周期与细胞周期与DNA复制复制 细胞周期蛋白、周期蛋白依赖激酶与细胞周期细胞周期蛋白、周期蛋白依赖激酶与细胞周期 CDK抑制物抑制物 锚蛋白锚蛋白（ankynin）、P21蛋白蛋白1、 DNA-pol 催化合成引物。催化合成引物。2、 DNA-pol 在增殖细胞核抗原（在增殖细胞核抗原（PCNA）协同下，）协同下，催化领头链或随从链合
20、成催化领头链或随从链合成（ DNA-pol 与与 发生转发生转换）换）。3、引物除有、引物除有RNA外，还有外，还有DNA片段参与构成片段参与构成（去除（去除引物不仅需要引物不仅需要RNA酶，还需要核酸外切酶）酶，还需要核酸外切酶）。4、引物和冈崎片段都较原核短、引物和冈崎片段都较原核短（引物长度大致与核（引物长度大致与核小体所含小体所含DNA长度或其若干倍）长度或其若干倍） 。5、合成速度较慢，但总速度不慢。、合成速度较慢，但总速度不慢。（二）复制延长（二）复制延长353553核小体核小体引物引物真核生物复制叉的延长真核生物复制叉的延长注：当随从链延长了一个或若干个核小体的长度后，注：当随从
21、链延长了一个或若干个核小体的长度后， 要重新合成引物要重新合成引物（三）复制终止和端粒酶（三）复制终止和端粒酶 复制与核小体装配同步进行复制与核小体装配同步进行引物水解（引物水解（RNA酶）酶）补缺（补缺（DNA-pol ）连接（连接酶）连接（连接酶）1、基本过程、基本过程2、端粒酶：、端粒酶： 由蛋白质和由蛋白质和 RNA 两部分组成，是一种特殊的反转录酶。两部分组成，是一种特殊的反转录酶。 催化特点：催化特点：它以自身的它以自身的 RNA 为模板，在随从链的模为模板，在随从链的模板板DNA 的的 3 -OH 末端延长末端延长 DNA，再以这种延长的，再以这种延长的 DNA 为为模板，继续合
22、成随从链，直至一定长度。模板，继续合成随从链，直至一定长度。端粒的复制模型 1989年Greider和Blackburn提出了端粒的复制模型。反应为四步进行： （1）首先是端粒酶与端粒DNA结合，端粒酶 中的RNA与凸出的3模板配对； （2）以RNA为模板，在DNA3端上从头合成 DNA； （3）延伸六个nt； （4）合成一个重复单位后，端粒酶向DNA模板 新合成的3移动， RNA再和模板配对，就这样循环 往复，周而复始。最后延伸的3端再回折，以GG 配对的方式形成发夹结构，产生端粒。 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 AACCCC GGGGTTGGGG图 11-68
23、端粒3延伸，末端回折形成发夹结构癌症与端粒酶此前人们已经发现，癌细胞往往会产生格外多的端粒酶，使它们能不断分裂繁殖。认为80%的癌症与端粒酶过多密切相关。英国自然细胞生物学杂志最近在网上提前发表了美国加利福尼亚大学伯克利分校的科学家的报告。科学家用会发出荧光的蛋白质给端粒酶“染色”，观察它们在细胞里的活动。结果发现，正常细胞是将端粒酶限制在细胞核里的一个特定区域，只有在细胞分裂、DNA端粒需要修补时才把它释放出来。与之相反，在癌细胞里，端粒酶有很大的自由度。科学家认为，端粒酶在癌细胞里能够自由活动，可能与癌细胞的强大生命力有关。如果找到方法把这些端粒酶重新“关起来”，就有可能抑制癌细胞的繁殖。
24、RNA模板模板逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶RNase H碱水解碱水解杂化双链杂化双链单链单链DNA双链双链DNA逆转录酶逆转录酶DNA pol IS1核酸酶核酸酶整合整合基因组基因组DNAcDNA 逆转录酶催化细胞内逆转录酶催化细胞内DNA合成合成逆转录酶在试管内催化逆转录酶在试管内催化cDNA合成合成一、逆转录一、逆转录: RNA DNA二、滚动复制和二、滚动复制和 D环复制环复制滚动复制滚动复制 某些低等生物的复制方式；某些低等生物的复制方式；复制不需要引物。复制不需要引物。 D环复制环复制 线粒体线粒体 DNA 复制方式。复制方式。OH 3P 5 X174（单链（单链DNA）病毒）病
25、毒感染型感染型蛋白蛋白A（具核酸内切酶活性）（具核酸内切酶活性）5 35 3滚动复制示意图滚动复制示意图双链双链DNADNA-pol dNTPD D 环复制在进行中环复制在进行中第一个复制起始点第一个复制起始点引物以内环为模板引物以内环为模板A 延伸至第二个复延伸至第二个复制起始点时，合成制起始点时，合成反向引物，以外环反向引物，以外环为模板为模板A起始点起始点 多多 点点 单单 点点速度速度 慢（原核的慢（原核的1/10） 快快引物大小引物大小 短（约短（约10个核苷酸）个核苷酸） 长（约数十个核苷酸）长（约数十个核苷酸）冈奇片段冈奇片段 少（约少（约100200 多（约多（约1000200
26、0 个核苷酸个核苷酸 ） 个核苷酸个核苷酸 ）酶酶 DNA聚合酶聚合酶- DNA聚合酶聚合酶 III端粒酶端粒酶 有有 无无真核生物真核生物 原核生物原核生物真核与原核生物复制的主要区别真核与原核生物复制的主要区别DNA replication: semiconservative, semidiscontimity Enzymes and proteins of DNA replication: DNApolymerase, DNA helicase, DNA Topisomerase, SSB, Primase, DNA ligase, et al. Replication of prokaryote and eukaryote Please detail the replication process of eukaryote.
