1、目目 录录 DNADNA是生物遗传的主要物质基础是生物遗传的主要物质基础, ,生物机体的遗传信息生物机体的遗传信息以密码的形式编码在以密码的形式编码在DNADNA分子上分子上, ,表现为特定的核苷酸排列表现为特定的核苷酸排列顺序顺序, ,并通过并通过DNADNA的复制由亲代传递给子代的复制由亲代传递给子代. .在后代的生长在后代的生长发育过程中发育过程中, ,遗传信息自遗传信息自DNADNA转录给转录给RNA,RNA,然后翻译成特异的然后翻译成特异的蛋白质蛋白质, ,以执行各种生命功能以执行各种生命功能, ,使后代表现出与亲代相似的使后代表现出与亲代相似的遗传性状。遗传性状。目目 录录复制：复
2、制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。转录：转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。翻译：翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。逆转录：逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。Reverse transcription目目 录录基因tRNArRNAmRNAOH搬运工具原料装配场所模板产物目目 录录DNA的生物合成的生物合成( (复制复制) )DNA Biosynthesis，Replication 第第 十十 章章目目
3、录录复制复制( (replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板为模板合成子链合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA目目 录录母链母链全保留式全保留式半保留式半保留式混合式混合式子链子链 子链继承母链的遗传信息子链继承母链的遗传信息 三种可能的方式三种可能的方式1958 M.Messelson1958 M.Messelson F.W.Stahl F.W.Stahl目目 录录全保留复制，即子链是全新链，母链不作为子链的成全保留复制，即子链是全新链，母链不作为子链的成分。那么，通过密度梯度离心，在子一代时，将形成分。那么，通过密
4、度梯度离心，在子一代时，将形成一轻一重的两条带。一轻一重的两条带。混合式复制，即形成的子，一部分区域全新，混合式复制，即形成的子，一部分区域全新，一部分区域全旧，相间排列。那么，在子一代离心时，一部分区域全旧，相间排列。那么，在子一代离心时，将只形成一个密度范围较大的带。且在子二代中，亦将只形成一个密度范围较大的带。且在子二代中，亦将如此。将如此。半保留复制，通过离心，在子一代是看到一条活于轻半保留复制，通过离心，在子一代是看到一条活于轻和重之间的带。在子二代时，将形成一和重之间的带。在子二代时，将形成一条与子一代相同的居间条，和一条轻带。条与子一代相同的居间条，和一条轻带。n试验结果，完全说
5、明了的半保留复制方式。试验结果，完全说明了的半保留复制方式。根据双螺旋模型根据双螺旋模型, ,可能存在的复制方式可能存在的复制方式目目 录录重重DNA普通普通DNA中等密度中等密度DNA全保留式全保留式混合式混合式第一代第一代第二代第二代5/62第一代第一代第二代第二代目目 录录(深蓝深蓝: 15N)(粉红粉红: 14N)DNA半保留复制的证据半保留复制的证据培养于普培养于普通培养液通培养液继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液含含15N-DNA的细菌的细菌普通普通DNA重重DNA第一代第一代中等密度中等密度DNA第二代第二代普通普通DNA中等密度中等密度DNA4/62目目 录录DNADNA
6、的半保留复制的半保留复制居中居中重重轻轻01234目目 录录复制的基本规律复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication 第一节第一节目目 录录l复制的方式复制的方式半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)l复制的高保真性复制的高保真性(high fidelity) l双向复制双向复制(bidirectional replication)l半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) 目目 录录一、半保留复制的实验依据和意义一、半保留复制的实验依据和意义 DNA DNA生物合成时生
7、物合成时, ,母链母链DNADNA解开为两股单链解开为两股单链, ,各自作为模板各自作为模板(template),(template),按按碱基配对原则碱基配对原则, ,合成与模板互补的子链合成与模板互补的子链. .子代细胞的子代细胞的DNA,DNA,一股一股单链从亲代完整地接受过来单链从亲代完整地接受过来, ,另一股单链则完另一股单链则完全从新合成全从新合成. .两个子细胞的两个子细胞的DNADNA都和亲代都和亲代DNADNA碱碱基序列一致基序列一致. .这种复制方式称为这种复制方式称为半保留复制半保留复制。半保留复制的概念半保留复制的概念目目 录录Old strandNew strandT
8、he hypothesis ofsemiconservativereplication proposed by Watson and Crickin 1953.AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉1 1子代子代DNA 目目 录录目目 录录按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代D
9、NA A的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。目目 录录最早研究DNA复制起点和方向的是J.Cairns（1963年）。型型目目 录录目目 录录A electron micrograph of the replicationintermediate of a plasmid DNA: -shaped structures were observed; no singl
10、e strandedDNA is visible.No complete unwinding of the two parental strands occurred before the daughter strands are synthesized目目 录录目目 录录二、复制方向二、复制方向复制叉：复制叉：在复制开始时，复制起始点后呈现一叉形结构，称为复制叉（在复制开始时，复制起始点后呈现一叉形结构，称为复制叉（replication fork ）也叫“生长点（growing point）目目 录录单 向 复 制 形 成 一 个 复 制 叉单 向 复 制 形 成 一 个 复 制 叉复 制
11、 双 向 形 成 两 个 复 制 叉复 制 双 向 形 成 两 个 复 制 叉目目 录录目目 录录原核生物复制时，原核生物复制时，DNA从从起始点起始点(origin)向向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为称为双向复制双向复制。 二、双向复制二、双向复制复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象目目 录录A. A. 环状双链环状双链DNADNA及复制起始点及复制起始点B. B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter(termination, ter) )orit
12、erA B C目目 录录53oriorioriori535533553复制子复制子3目目 录录习惯上把两个相邻起习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个始点之间的距离定为一个复复制子制子(replicon) 。复制子是。复制子是独立完成复制的功能单位。独立完成复制的功能单位。真核生物每个染色体真核生物每个染色体有多个起始点，是有多个起始点，是多复制子多复制子的复制。的复制。原核生物是单复制子原核生物是单复制子完成的复制，称为完成的复制，称为复制体复制体（replisome）。）。目目 录录目目 录录目目 录录三、复制的半不连续性三、复制的半不连续性19683 5 3 5 解链方向解链方向3 5
13、 3 3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)目目 录录5目目 录录顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为这股链称为领头链（领头链（leading strand）。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为为随从链（随从链（lagging strand）。复制中的。复制中的1000-2000bp不连续片段称为不连续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki f
14、ragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的的半不连续性半不连续性。 目目 录录l 冈崎片段与半不连续复制（冈崎片段与半不连续复制（okazakiokazaki 1968 1968年）年）目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录 DNA复制的酶学复制的酶学The Enzymology of DNA Replication第二节第二节目目 录录聚合反应的特点聚合反应的特点 以4种dNTP为底物； 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合； 反应需有引物，引物可以提供3 -羟基；新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 5 3 3
15、 方向方向进行；进行； 产物DNA的性质与模板相同；6 合成需要有多种酶和蛋白因子的参与。目目 录录参与参与DNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，简写聚合酶，简写 为为 DNA-pol模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 一小段一小段RNA(或或DNA）为引物，在大肠杆菌中，）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合的合成需要一段成需要一段
16、RNA链作为引物。链作为引物。其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子 解链酶，解旋酶，单链结合解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶蛋白，连接酶一、复制的化学反应一、复制的化学反应 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 目目 录录目目 录录N3 5 5 OOH OH PPP-O-CH2OH目目 录录Mg2+目目 录录二、二、DNA聚合酶聚合酶全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol酶催化反应的特点：酶催化反应的特点：（1）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物；）以四种脱氧核苷酸三磷酸
17、为底物；（2）反应需要有模板的指导；）反应需要有模板的指导；（3）反应需要有）反应需要有3 -OH存在；存在；（4）DNA链的合成方向为链的合成方向为5 3 （5）DNA聚合酶的反应可以利用聚合酶的反应可以利用DNA双链作为模板和引物，亦可以单链双链作为模板和引物，亦可以单链DNA作为模板和引物作为模板和引物（6）DNA的体外聚合必须加入少量的的体外聚合必须加入少量的DNA才能进行。才能进行。DNA在提取过程中在提取过程中易形成切口（易形成切口（nick）或缺口（）或缺口（gap）.则加入的则加入的DNA一条链作为模板而另一一条链作为模板而另一条链可作为引物。条链可作为引物。活性：活性：1.
18、53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性目目 录录（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目目 录录（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶1000-1000-2400-600002400-60000可可能能不不可可能能可可能能基基因因突突变变后后的的致致死死性性无无无无有有5 3 核核酸酸外外切切酶酶活活性性20？400分分子子数数/细细胞胞多多亚亚基基不不对对称称二二聚聚体体？单单肽肽链链组组成成250120109分分子子量量(kD)DNA-polIIIDNA-polIIDNA-polI可可能能不不可可
19、能能可可能能基基因因突突变变后后的的致致死死性性无无无无有有5 3 核核酸酸外外切切酶酶活活性性20？400分分子子数数/细细胞胞多多亚亚基基不不对对称称二二聚聚体体？单单肽肽链链组组成成250120109分分子子量量(kD)DNA-polIIIDNA-polIIDNA-polI目目 录录目目 录录功能功能：对复制中的错误进对复制中的错误进行校读，对复制和行校读，对复制和修复中出现的空隙修复中出现的空隙进行填补。进行填补。DNA-pol （109kD）目目 录录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外核酸外切酶活性切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚
20、合酶聚合酶活性活性 N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行分子，进行分子生物学研究中常用的工具酶。生物学研究中常用的工具酶。 5 核酸外核酸外切酶活性切酶活性目目 录录目目 录录The 3 to 5 exonucleasedomainThe polymerasedomainStructure of the Klenow fragmentof DNA polymease I目目 录录DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与它参与DNA损伤的应急状态
21、修复。损伤的应急状态修复。 多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3 3 5 5外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的修复紫外光引起的DNADNA损伤中起作用。损伤中起作用。目目 录录功能功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 DNA-pol (250kD)目目 录录 DNA DNA聚合酶聚合酶：该酶由该酶由1010种种亚亚基组成，其中基组成，其中 、 、 形成全酶形成全酶的核心酶的核心酶。具有。具有553DNA3DNA聚聚合酶活性（合酶活性（ 亚基
22、，亚基，速率高）；速率高）； 具有具有3 3 5 5外切酶（外切酶（ 亚基）亚基）的校对功能，提高的校对功能，提高DNADNA复制的保复制的保真性；还具有真性；还具有55 33外切酶外切酶活性（单链有效，其意义未知）。活性（单链有效，其意义未知）。目目 录录目目 录录催化催化DNA聚合聚合参与参与DNA损损伤的应急状伤的应急状态修复态修复修复合成、修复合成、切除引物、切除引物、填补空隙填补空隙功能功能2040400分子数分子数/细胞细胞1011亚基数亚基数+-+5 外切酶活性外切酶活性+ 5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE. Coli中的中
23、的DNA聚合酶聚合酶目目 录录目目 录录（4） DNA聚合酶聚合酶IV和和V：1999年发现，年发现，当当DNA严重损伤时，诱导产生。严重损伤时，诱导产生。目目 录录（二）真核生物的（二）真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol
24、目目 录录（二）真核生物的（二）真核生物的DNA聚合酶聚合酶填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体DNA复复制制低保低保真度真度的复的复制制起始引起始引发，引发，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体DNA复复制制低保低保真度真度的复的复
25、制制起始引起始引发，引发，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol目目 录录三、复制保真性的酶学依据三、复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制：（一）（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读 （二）复制的保真性和碱基选择（二）复制的保真性和碱基选择目目 录录（一）（一）DNA-pol的
26、核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol 1不表现活性。不表现活性。目目 录录5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5 3 外切酶活性外切酶活性 能切除突变的能切除突变的 D
27、NA片段。片段。? 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录（二）复制的保真性和碱基选择（二）复制的保真性和碱基选择 DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型反式构型。 目目 录录1. 遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择
28、功能；3. 复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制 目目 录录四、复制中的分子解链及四、复制中的分子解链及DNA 分子分子拓扑学变化拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。目目 录录（一）解螺旋酶、引物酶和单链（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白结合蛋白理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引
29、物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质目目 录录E. Coli 基因图基因图目目 录录目目 录录Only one RNA primer is needed for synthesizing the leading strand.(DnaB)目目 录录n解螺旋酶解螺旋酶(helicase) 利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能，作用
30、于氢键，使DNA双链解双链解开成为两条单链开成为两条单链 E.coli中的中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解。每解开一对碱基需要水解2个个ATP分子。分子。 rep蛋白沿模板链蛋白沿模板链3 5移动，而解螺旋酶移动，而解螺旋酶I、II、III沿沿5 3移动。移动。目目 录录引物酶引物酶(primase) 复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶，引物的酶，RNA聚合酶聚合酶(Dna G)目目 录录目目 录录 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein
31、, SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。稳定已被解开的稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。核酸酶降解。作用：作用：目目 录录1010 8 8 局部解链后局部解链后（二）（二）DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成目目 录录目目 录录拓扑异构拓扑异构酶酶切断切断DNADNA双链中双链中一股一股链链, ,使使DNADNA解链旋转解链旋转不致打结不致打结; ;适当时候封闭切口适当时候封闭切口, ,DNADNA变
32、为变为松弛状态松弛状态。反应反应不需不需ATPATP。拓扑异构拓扑异构酶酶切断切断DNADNA分子分子两股两股链链, ,断端通过切口旋断端通过切口旋转使超螺旋松弛转使超螺旋松弛. .利用利用ATPATP供能供能, ,连接断连接断端端,DNA,DNA分子进入负超螺旋状态分子进入负超螺旋状态. .作用机制作用机制拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键分类分类 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录五、五、DNA连接酶连接酶连接连接DNADNA链链3 3 -OH-OH末端和相邻末端和相邻DNADNA链
33、链5 5 -P-P末端末端, ,使二者生成磷酸使二者生成磷酸二酯键二酯键, ,从而把两段相邻的从而把两段相邻的DNADNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。功能功能 DNADNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在在DNADNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。 DNA DNA连接酶连接酶(DNA ligase(DNA ligase) )作用方式作用方式POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP5353目目 录录目目
34、录录DNA连接酶连接酶ATP AMP+PPi或或 或或NAD NMN+AMP目目 录录3535OHOHP P目目 录录目目 录录DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Replication第三节第三节目目 录录目目 录录（一）复制的起始（一）复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 合成引物，提供合成引物，提供3 -OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成 目目 录录E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCT
35、CTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TGTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1. DNA解链解链 大肠杆菌中的复制起始位点是Ori C，全长245Bp，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。目目 录录目目 录录 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2. 引发体和引
36、物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。 目目 录录目目 录录3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。 引物引物3 HO5引物引物酶酶目目 录录（二）复制的延长（二）复制的延长复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 目目 录录 5 5 3 35 5dATPd
37、GTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目目 录录领头链的合成领头链的合成目目 录录随从链的合成随从链的合成目目 录录目目 录录目目 录录阶段一阶段一阶段二阶段二目目 录录阶段三阶段三阶段四阶段四复复制制过过程程简简图图目目 录录目目 录录RNA primers arerepeatedly formedby the primase on the lagging strand.目目 录录 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli823
38、2 ori terSV40500（三）复制的终止（三）复制的终止目目 录录5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接目目 录录目目 录录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成 细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两个关期这两个关键点。键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白激酶活的调节，与蛋白激酶活性有关。性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而蛋白激酶通过磷
39、酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。实施调控作用。 目目 录录l真核生物染色体真核生物染色体DNADNA是多复制子，有多个复制起点，是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，可以多点起始，复制有时序性复制有时序性，即复制子以分组方，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。每个复制子大多在式激活而不是同步起动。每个复制子大多在100-100-200bp200bp之间，比细菌染色体之间，比细菌染色体DNADNA（单复制子）小得多。（单复制子）小得多。l真核生物真核生物DNADNA复制叉复制叉移动的速度移动的速度此原核的慢，如哺乳此原核的慢，如哺乳动物复制叉移动的速度每分钟动物复制叉移动的速度每
40、分钟1-3Kb1-3Kb，细菌每分钟，细菌每分钟5Kb5Kb。l真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中，起点可以连始复制。而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。续发动复制。目目 录录l RPA 单链单链DNA结合蛋白，可以激活结合蛋白，可以激活DNA聚合酶。聚合酶。lRFC 复制因子复制因子(replication factor, RF)C，结合于引物，结合于引物-模模板链，激活板链，激活DNA聚合酶，促使聚合酶，促使PCNA结合引物结合引物-模板链。模板链。装配夹子的工具。装配夹子的工具。l 复制的复
41、制的增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用，类似于可滑动的在复制起始和延长中起关键作用，类似于可滑动的夹子的作用。夹子的作用。l起始需要起始需要DNA-pol（引物酶活性）和（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活（解螺旋酶活性）参与，还需拓扑酶。性）参与，还需拓扑酶。（一）复制的起始（一）复制的起始目目 录录目目 录录目目 录录3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体（二）复制的延长（二）复制的延长目目 录录 染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停
42、止。呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）复制的终止（三）复制的终止目目 录录5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目目 录录切除引物的两种机制切除引物的两种机制目目 录录目目 录录Problem posed in the replicationof linear DNA:the end of onedaughter strandwill be shortenedafter each ro
43、und of replication.目目 录录 端粒端粒(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性结构特点结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 3端是由数百个串联重复的富含端是由数百个串联重复的富含G、T碱基碱基的短的短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGG目目 录录端粒酶端粒酶(telomerase)1985 端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白端粒酶协
44、同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 组成组成目目 录录目目 录录端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型目目 录录目目 录录DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工目目 录录目目 录录5.哺乳动物中端粒末端形成大的环状结构哺乳动物中端粒末端形成大的环状结构,环状环状DNA+蛋白质蛋白质 保护染色体保护染色体3端的稳定端的稳定图图12-17 12-17 端粒的环状结构端粒的环状结
45、构目目 录录The “inchworm”(尺蠖）尺蠖）model fortelomerase actionThe T loop observed atone end of a mammalianchromosome.目目 录录逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways第四节第四节目目 录录六、逆转录六、逆转录19831983年，发现人类免疫缺陷病毒（年，发现人类免疫缺陷病毒（human immune deficiencehuman immune deficience virus,HIVviru
46、s,HIV）, ,感染感染T T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（系统损伤，引起艾滋病（acquired immunodeficiency acquired immunodeficiency syndrome,AIDSsyndrome,AIDS）目目 录录逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录逆转录(reverse transcription) :以以RNA为模板，按照为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成中的核苷酸顺序合成DNA称为逆转录，由逆转录酶催化进行。称为逆转录，由逆转录酶催化进行。 逆转录
47、逆转录酶酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 v 逆转录酶是多功能酶，兼有逆转录酶是多功能酶，兼有3 3种酶的活性：种酶的活性： RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 核糖核酸酶核糖核酸酶H(H(RNaseH) )的活性，专一水解的活性，专一水解RNA-DNARNA-DNA杂交分子中杂交分子中的的RNARNA，可沿，可沿5533和和3 3 55两个方向起核酸外切酶的作两个方向起核酸外切酶的作用。用。目目 录录逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-
48、RNA 杂杂化双链化双链RNase H单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA 病毒基因组通过病毒基因组通过基因重组基因重组插入到宿主插入到宿主细胞基因组中，称为细胞基因组中，称为整合整合。目目 录录目目 录录核前病毒染色体整合逆转录病毒粒子细胞病毒蛋白质RNA芽生子代转录病毒粒子病毒的生活周期逆转录目目 录录逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDN
49、A法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA 目目 录录二、逆转录研究的意义二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象逆转录酶和逆转录现象, ,是分子生物学研究中是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。 逆转录现象说明逆转录现象说明: :至少在某些生物至少在某些生物,RNA,RNA同样兼同样兼有遗传信息传代与表达功能。有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究对逆转录病毒的研究, ,拓宽了拓宽了2020世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理
50、论。到的病毒致癌理论。目目 录录 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)三、滚环复制和三、滚环复制和D环复制环复制 是某些低等生物的复制形式，如是某些低等生物的复制形式，如 X174和和M13噬菌体等。噬菌体等。目目 录录3 -OH5 -P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 目目 录录目目 录录目目 录录dNTPDNA-pol D环复制环复制(D-loop replication) 是线粒体是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。的复制形式。 目目 录录DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修
