1、海洋药学教研室了解不同分子标记原理和方法，掌握RAPD技术原理和整体流程；了解基因组DNA提取原理，掌握植物基因组DNA提取原理和方法；熟悉PCR技术原理，了解PCR技术的改进应用；掌握核酸电泳技术和原理；熟悉相关生物软件和仪器的使用；锻炼整体实验设计的思路，了解研究过程中的结果分析手段。不同种类、不同的生态环境下生长的植物体内的化不同种类、不同的生态环境下生长的植物体内的化学成分不同的现象：学成分不同的现象：如如 药材的道地性药材的道地性 贝母：川贝和浙贝贝母：川贝和浙贝 桔生淮南为桔，移于淮北为枳桔生淮南为桔，移于淮北为枳 生物种群中存在的与等位基因相关的若干种表现型。 ABO血型 肤色等
2、在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦称遗传多态性或基因多态性。基因多态性一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔定律世代相传。DNA位点多态性 site polymorphism 长度多态性 length polymorphism宏观角度 种属差异 环境因素基因结构与功能角度 复等位基因（multiple allele） 同一基因座出现的多个基因，形成系列称为复等位基因 为数众多的复等位基因，是某些复合体（HLA）高度多态性的最主要原因 共显
3、性（condominance） 一对等位基因同为显性，称为共显性 共显性大大增加了种群中某些基因表型的多样化形态学标记 Morphological marker 外部形态特征，如植物的矮秆、紫鞘、卷叶等细胞标记 Cytological marker 染色体的核型(染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等) 带型(C 带、N 带、G带等)分子标记 molecular marker 蛋白分子标记 利用蛋白质的多态性来反映不同品种的差异，如同工酶、等位酶等 DNA分子标记 通过对品种DNA的多态性即DNA碱基序列的差异进行分析，从而鉴别不同品种。极大的丰富性；多态性高，变异类型丰富；大多数DNA标记
4、是共显性的，很容易区分杂合体和纯合体；DNA标记对性状的表达没有影响；DNA标记具有高度稳定性，不受环境条件和个体发育影响，无组织或器官特异性，准确性、稳定性和重复性较高；限制性片段长度多态性 Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP）随机扩增多态DNA Random Amplified Polymorphic DNA（RAPD）扩增片段长度多态性 Amplication Fragment Length Polymorphism Analysis（AFLP） 微卫星技术 Microsatellite DNA单核苷酸多态性 Single nucl
5、eotide polymorphism （SNP）由于DNA 的多态性，导致DNA 分子中限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度不同，即限制性片段长度多态性。这种多态性可通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种或个体间DNA水平的差异（即多态性），通过多个探针的比较则可以确立生物的进化和分类关系。广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位及生物进化和分类的研究。以一系列不同的随机排列的寡聚核酸单链为引物，对所研究的基因组DNA 进行扩增，扩增产物通过电泳分析，检测扩增产物的多态性；扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD 技术现已广泛用于品种鉴定
6、、系谱分析及进化关系研究。利用PCR检测酶切产生的特异片段，结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。 微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列；每个重复单元的长度在110bp之间，不同数目的核心序列呈串联重复排列（SSR，Simple Sequence Repeats ），而呈现出长度多态性。每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。各SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物， 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当其中
7、的一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，而空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受到排阻力大小不同。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以特异性将构象上有差异的分子分离开。 基因组中存在众多反向重复序列，每一随机引物进行PCR的过程中，单一引物可与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。而引物结合位点DNA序列的改变以及扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，可通过电泳检测而显示出DNA片段的多态性。 RAPD技术继承了PCR技术的优点，可在所研究的物种没有任何分子生物学基础下，对其进行DNA多态性的分析。所
8、需样品量少，灵敏度高，效率较高。 模板制备（DNA提取）PCR扩增琼脂糖电泳检测PCR产物数据分析进化树构建基本仪器设备：台式高速离心机、移液器、水浴锅、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、紫外分光光度计、微波炉等生物材料： 不同属植物试剂和酶：石英砂、缓冲液A、消化液（含1.5% SDS）、KAc、酚/氯仿/异戊醇、异丙醇、RNase A、随机引物、Taq DNA聚合酶、琼脂糖、TAE缓冲液、DNA上样缓冲液等保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染SDSSDS是一种阴离子去垢剂，在高
9、温条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀；上清液中的DNADNA用酚/ /氯仿抽提，反复抽提后乙醇沉淀水相中的DNADNA。称取植物树叶0.5g，加入石英砂和1.5ml缓冲液A（临用前加入50l -巯基乙醇）中快速研磨；叶片磨碎后加入3 ml缓冲液A，12000rpm离心5min。去除上清，将沉淀悬浮于0.7ml的1.5%SDS消化液（65预热，临用前加入50l -巯基乙醇）中， 65水浴40min消化，间或混匀；加入1/3体积5M KAc（pH7.0），混匀，冰浴30min，12000rpm离心5min；取上清，加入等体积酚
10、-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提，12000rpm 离心5min；上清转管，加入等体积氯仿抽提，12000rpm离心5min；上清转管，加入等体积异丙醇轻轻混匀，12000rpm 离心5min，沉淀溶解于300l无菌双蒸水中，加入2l RNase（10mg/ml）37保温30min，消化RNA；在总体系中加入300l无菌双蒸水，然后加入等体积酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提，12000rpm 离心5min；上清转管，加入等体积氯仿抽提，12000 rpm 离心5min，上清转移至一洁净1.5ml eppendorf管中；加入等体积异丙醇，混匀后，12000 rpm离心10min，沉淀
11、用无水乙醇洗涤2次，80乙醇洗涤一次，沉淀晾干后，加入50l无菌水溶解，获得DNA溶液。1.0琼脂糖电泳检测DNA质量。红树植物多糖含量较高，可能严重影响后续试验。通过用缓冲液A对植物组织进行预处理，预先去除大量的多糖，以达到提取高纯度DNA的目的。巯基乙醇的作用：由于植物中含有大量多酚类物质，容易与DNA形成不溶性沉淀，造成DNA的损失；此外多酚类物质是氧化性物质，在溶液中形成氧化环境，易引起DNase对DNA的降解，在溶液中加入巯基乙醇以形成还原性环境，避免DNase的作用。酚-氯仿抽提：酚是有效的蛋白质变性剂，可以去除蛋白，但核酸提取过程中常采用酚和氯仿的混合液，这是因为：两种不同有机溶
12、剂较之单一使用一种效果更佳，而且可以避免酚造成的核酸损失。接下来，在使用酚-氯仿后需用氯仿再次抽提主要是为了防止溶液中痕量酚对于后续操作中酶的影响。 离心柱结构：特殊硅基质吸附材料，可特异性吸附某种成分，透过杂质；关键技术： 正常情况：核酸表面覆盖水化层，以维持其水溶性； 高盐浓度下：高盐离子破坏核酸表面亲水薄膜的有序排列，形成疏水环境，核酸可吸附于硅膜表面； 低盐浓度下：核酸表面水化层恢复，可被从硅质膜上洗脱下来关键原理：关键原理：植物组织（细胞）磨碎后经裂解液裂解；蛋白质、多糖、细胞残片被沉淀去除；然后基因组DNA在高盐状态下选择性吸附于硅膜，再通过一系列漂洗离心步骤, 进一步将多糖、多酚
13、和细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅膜上洗脱下来。 简化了繁琐的有机试剂抽提步骤，减少了环境污染和操作损失，操作要求低，重复性好；彻底去除可能抑制后续操作的抑制物（如乙醇、有机溶剂），提高产物稳定性；高效快速，易于自动化；nRB1 (Resuspension Buffer 1) 重悬缓冲液 重悬并裂解细胞，变性核蛋白体，释放核酸nRNase A RNA酶A 降解RNA，去除RNA干扰nPB1 (Precipitation Buffer 1) 沉淀缓冲液 沉淀细胞碎片、蛋白、多糖等杂质nBB1 (Binding Buffer 1) 结合缓冲液（已加入乙醇） 作
14、用于核酸表面水化层，通过电荷作用力促进核酸结合于硅膜nCB1（Clean Buffer 1）清洁缓冲液 去除未能结合于硅膜表面的杂质、盐分等nWB1（Wash Buffer 1）漂洗缓冲液（已加入乙醇） 去除以弱离子力结合的杂质、盐分等，消除高盐环境，纯化产物nddH2O(无菌双蒸水) 洗脱核酸 制备管（含硅质膜） 收集洗脱废液取新鲜植物组织100mg 在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉；转移细粉至一个1.5ml 离心管，加入250l 缓冲液 RB1和15l Rnase A ，旋涡振荡，充分混匀以助裂解；55水浴15分钟，在水浴过程中颠倒离心管 2 -3 次，混合样品；12000 rpm离心5mi
15、n，轻轻吸取上清至另一洁净1.5ml离心管；加入100 l 缓冲液 PB1，充分混匀，冰浴 5 分钟， 12000 rpm 离心5 min，小心吸取上清至一新的1.5ml 离心管，避免扰动和吸取界面物质；加入375 l缓冲液BB1，充分混匀充分混匀；（加入BB1可能出现絮状沉淀，但不影响 DNA提取）取全部混合液（包括可能的沉淀）加入吸附柱中，（吸附柱放入收集管），1 2 000 rpm 离心30 sec，弃去收集管中废液； 吸附柱容量有限，先加 650l 溶液离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心在吸附柱中加入500l 清洁液CB1，12,000 rpm 离心30sec，弃废液； 在吸附柱
16、中加入500l 漂洗液WB1，12,000 rpm 离心30sec，弃废液；并重复本步骤一次； 将吸附柱放回空收集管中，12,000 rpm 离心2 分钟，彻底去除残留的WB1，以免其中残留乙醇影响后续操作；取出吸附柱，放入一洁净1.5ml离心管中，在吸附膜的中间部位加100l 双蒸水（事先在 60水浴中预热）， 室温放置1分钟，12000 rpm 离心1 分钟，获得基因组DNA溶液；取5l DNA溶液，以1.0%agarose 电泳检测，剩余DNA 保存于-20中，作为PCR扩增模板；基因组DNA质量可通过琼脂糖电泳初步检测： 基因组DNA片段应在20kb30kb之间； 高质量的基因组DNA
17、带型单一无拖尾现象。移液器的使用 选择合适量程 2个档位 保养与维护离心机的使用 配平 时间配合基于DNA的半保留复制原理，通过温度变化控制模板变性、引物退火和引物延长的多个循环来扩增特异DNA序列的过程，上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使得扩增呈指数增长，因而可作为核酸检测的一种非常灵敏的技术。 含有目的基因的DNADNA模板一对一对寡核苷酸链，可以与目的基因的上游和下游（5和3端）分别配对引物提供酶促反应缓冲体系反应缓冲液：taq酶的辅基，反应的辅因子Mg2 PCR反应的原料dNTP mix 耐热的DNA聚合酶，催化DNA复制Taq 酶PredenatuePredenatue 90
18、-95 90-95 3-5min DenatureDenature（90-9690-96）双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA30 sec-1min AnnealAnneal（25-6525-65）系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链30 sec-1min depends on the duplex ExtensionExtension（70-7570-75）在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链About 1min (+30 sec per 500bp) 25-30 cycles25-30 cyclesFinal ex
19、tension 72 10minFinal extension 72 10min模板稀释：将提取的各组基因组DNA稀释20倍，作为模板，并分发给各组： 稀释至 为各组分装10l随机引物： 全班选取16种随机引物，每组一种随机引物 (10mol/L)2.0ldNTP (2.5mmol/L each)2.5l10PCR缓冲液缓冲液2.5lTaq DNADNA聚合酶聚合酶 （5U/l） 0.5l镁离子（镁离子（25mM25mM）2.5L模板DNA5.0l灭菌双蒸水灭菌双蒸水 ddH2O10.0lPCR体系（25l）：Primers 模板ABCDEFS1123456S2789101112S313141
20、5161718S4192021222324S5252627282930S6313233343536S7373839404142S8434445464748S9495051525354S10555657585960S11616263646566S12676869707172S13737475767778S14798081828384S15858687888990S16919293949596预变性94 3min变温循环 30T 94 30sec 37 30sec 30T 72 1.5min再延伸72 10min加样需在PCR专用的薄壁管中体系内同样的成分（水、buffer、引物、dNTP、taq
21、酶）可预先配置成预混液，再分装至各管； 预混液的配制：按比例放大，并需考虑加样误差在各管中加入不同成分（模板DNA），加入反应预混液后，混匀；琼脂糖是一种线性多糖聚合物，来源于海藻；琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固将形成良好的电泳介质，糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶，其密度由琼脂糖的浓度决定。可用于核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化分析。将凝胶成形模具封好，水平放置，并放置梳齿。按所需凝胶浓度和体积称取琼脂糖，放入三角烧瓶中，加入1TAE缓冲液，放入微波炉加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。 注：所谓的凝胶浓度为质量体积比，如需要配置X%的琼脂糖100ml，即称取X
22、克琼脂糖溶于100ml的1TAE缓冲液中。将溶解的琼脂糖凝胶置室温下冷却至60左右（手握烧瓶可耐受），再按照5l /100ml凝胶的比例加入荧光染料，如Goldview，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。 本实验所用loading buffer中含有核酸荧光染料，无需在凝胶中加入荧光染料室温下待凝胶完全凝固，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。在电泳槽加入1TAE缓冲液，以略高出凝胶表面为宜。同一引物、不同模板的6个样品，作为一组；n取出PCR产物，按5：1的比例加入6loading buffer，混合均匀，取10l，依序分别加入点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。核酸与loading buffer的混合，可以借助离心机；接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记核酸样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。恒定电流或电压，约1h后取出凝胶，在紫外灯下观察结果，凝胶成像系统记录结果。根据凝胶电泳结果利用生物学软件NTSYSpc (Rohlf,1998)进行分析 呈现条带的（包括弱带）记录为1，缺失条带的记录为0 建立TXT文档 连续三次运算 获得进化树
