1、乳与乳制品微生物检验方法乳与乳制品微生物检验方法刘晓燕刘晓燕菌落总数的测定菌落总数的测定一.术语术语 菌落是指在因体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别菌落是指在因体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计的相同的细茵集合而成。的生长物，它是由数以万计的相同的细茵集合而成。 菌落总数是指食品检样经处理后，在一定条件下培养后菌落总数是指食品检样经处理后，在一定条件下培养后（如营养成分、培养温度和时间、（如营养成分、培养温度和时间、pHpH、需氧性质等）所得、需氧性质等）所得1ml1ml（g g）检样中所生长的细菌菌落的总数。本方法规定的）检样中所生长的细菌菌落的总数。本方法规
2、定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。所以厌氧或微需氧茵、有特的嗜中温性需氧的菌落总数。所以厌氧或微需氧茵、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有的生长条件殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有的生长条件不能满足其生理要求，故难以生长。因此菌落总数并不能不能满足其生理要求，故难以生长。因此菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被区分其中细菌的种类，所以有时被 称为杂菌数，需氧菌称为杂菌数，需氧菌数。数。 菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标
3、志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便对被检样品用这一方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。进行卫生学评价时提供依据。二二. .设备和材料设备和材料培养箱：培养箱：363611冰箱：冰箱：0 044恒温水浴：恒温水浴：461461天平天平电炉电炉吸管吸管广口瓶或三角瓶：容量为广口瓶或三角瓶：容量为500ml500ml玻璃珠：直径玻璃珠：直径50mm50mm平皿：直径约平皿：直径约90 mm90 mm试管试管放大镜放大镜菌落计数器菌落计数器酒精灯酒精灯均质器或乳钵均质器或乳钵试管架试管架灭菌刀或剪子灭菌刀或剪子灭菌镊子灭菌镊子培养基和试剂培养基和试剂
4、营养琼脂培养基：按营养琼脂培养基：按GB4789.28GB4789.28中中4.74.7规定或按购买的商用培养基配方配制。规定或按购买的商用培养基配方配制。生理盐水生理盐水 75%75%乙酵溶液乙酵溶液三三. .检验程序检验程序菌落总数的检验程序如下： 检 样做成风个适当倍数的稀释液选择23个适宜稀释度各以1ml分别加入灭菌平皿中 361、48h2h每个皿内加入适量营养琼脂菌落计数报 告 四四. . 操作步骤操作步骤 . .检样稀释及培养检样稀释及培养 1 1）以无菌操作将检样）以无菌操作将检样25g25g（或（或mlml）剪碎放于装有）剪碎放于装有225ml225ml灭菌生理盐水或其他稀释液
5、的灭玻璃瓶内，（瓶灭菌生理盐水或其他稀释液的灭玻璃瓶内，（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成或研磨做成1 1：1010的均匀稀释液。的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000800010000r/min10000r/min的速度处理的速度处理1min1min，做成，做成1 1：1010的均匀稀释液。的均匀稀释液。 2 2）用）用1ml1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1 1：1010稀释液稀释液1ml1ml，沿管壁徐徐，沿管壁徐徐注入含有注入含有9ml9ml灭菌生
6、理盐水或其他稀释液的试管内（注灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）振摇试管，混合均匀，意吸管尖端不要触及管内稀释液）振摇试管，混合均匀，做成做成1 1：100100的稀释液。的稀释液。 3 3）另取）另取1ml1ml灭菌吸管，按上述操作顺序，做灭菌吸管，按上述操作顺序，做1010倍递增倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支1ml1ml灭菌吸灭菌吸管。管。 4 4）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择选择2323个适宜稀释度，分别在做个适宜稀释度，分别在做1010倍
7、递增稀释的同时，倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移即以吸取该稀释度的吸管移1ml1ml稀释淮于灭菌平皿内。稀释淮于灭菌平皿内。 5 5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至）稀释液移入平皿后，应及时将凉至4646的营养琼脂的营养琼脂培养基（可放置于培养基（可放置于464611水浴中保温）注入平皿约水浴中保温）注入平皿约15ml15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有倾入加有1ml1ml稀释液的灭菌平皿内做空白对照。稀释液的灭菌平皿内做空白对照。 6 6）待琼脂凝固后，翻转平板，置）待琼脂凝固后，翻转平板，置363611培养箱内培
8、培养箱内培养养48482h 2h 五五. .菌落计数方法菌落计数方法 .作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必须时用放大镜，作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必须时用放大镜，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数各平板平均菌落总数 . . .菌落计数的报告菌落计数的报告 1 1）平板菌落数的选择）平板菌落数的选择 . .选取菌落数在选取菌落数在3030300300之间的平板作为菌落总数的之间的平板作为菌落总数的测定标准，一个稀释度选用两个平板，应采用两个平板测定标准，一个稀释度选用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板
9、有较大片状菌落生长时，则不宜平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为稀释度的菌落采用，而应以无片状菌落生长的平板作为稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又数，若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很多均匀，可计算半个平板后乘很多均匀，可计算半个平板后乘2 2代表全皿菌落数。平代表全皿菌落数。平板内有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限），若仅板内有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限），若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。则应将每条
10、链作为一个菌落计。 2 2）稀释度的选择稀释度的选择 .应选择平均菌落数在应选择平均菌落数在3030300300之间的稀释度，乘以稀之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表中例释倍数报告之（见表中例1 1）。）。 . .若有两个稀释度，其生长的菌落数均在若有两个稀释度，其生长的菌落数均在3030300300之之间，则视两者的比值来确定。若其比值小于或等于间，则视两者的比值来确定。若其比值小于或等于2 2，应报告平均数；若大于应报告平均数；若大于2 2则报告其中较小的数字，（见则报告其中较小的数字，（见表中例表中例2 2及及3 3）。）。 . .若所有稀释度的平均菌落数均大于若所有稀释度的平均菌落
11、数均大于300300，则应按稀，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表中例释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表中例4 4）。）。 . .若所有稀释度的平均菌落数均小于若所有稀释度的平均菌落数均小于3030，则应按稀释，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表中例度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表中例5 5）。）。 . .若所有稀释度均无菌落生长，则以小于若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1 1乘以最低乘以最低稀释倍数报告（见表中例稀释倍数报告（见表中例6 6）。）。 . .若所有稀释度的平均菌落数均不在若所有稀释度的平均菌落数均不在3030300300之间，之
12、间，其中一部分大于其中一部分大于300300或小于或小于3030时，则以最接近时，则以最接近3030或或300300的的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表中例平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表中例7 7）。）。 .菌落数的报告菌落数的报告菌落数在菌落数在100100以内时，按其实有数报告，大于以内时，按其实有数报告，大于100100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面得数值，时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面得数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用1010的指数来表示（见表中的指数来表示（见表中“报告方式报告方式”栏）栏
13、）。 稀释度选择及菌落数报告方式稀释度选择及菌落数报告方式 例例次次稀释液及菌落数稀释液及菌落数两稀释液两稀释液之之 比比菌落总数菌落总数个个/g或或ml报告方式报告方式个个/g或或ml10-410-210-31多不可计多不可计164201640016000或或1.6 610104 42多不可计多不可计295461.63775038000或或3.8 810104 43多不可计多不可计271602.22710027000或或2.7 710104 44多不可计多不可计多不可计多不可计313313000310000或或3.1 110105 5527115270270或或2.7 710102 2600
14、01 11010107多不可计多不可计305123050031000或或3.1 110104 4 六六. . 操作注意事项操作注意事项 培养基温度应在培养基温度应在464611，温度守高会影响细菌生长，温度守高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混合，琼脂应放在过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混合，琼脂应放在水浴锅内，温度为水浴锅内，温度为464611。 尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。则将会导致重大的技术误差。 检样稀释后，应尽快接中，倾到培养基。一般从检样稀检样稀释后，应尽快接中，倾到培养
15、基。一般从检样稀释开始到倾到培养基，应在释开始到倾到培养基，应在15min15min内操作完毕。内操作完毕。 注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少而高稀释度使菌落反而结果受影响，如低稀释时菌落少而高稀释度使菌落反而增大。增大。 对照试验。为了避免微小颗粒与细菌菌落发生混淆，可对照试验。为了避免微小颗粒与细菌菌落发生混淆，可作一个检样稀释液与琼脂混合的平板，不经培养放到作一个检样稀释液与琼脂混合的平板，不经培养放到44环境中，以便计数菌落时用作对照。环境中，以便计数菌落时用作对照。 培养湿度。培养箱应保持一定
16、的湿度，琼脂平板培养培养湿度。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h48h后，培养基失重不应超过后，培养基失重不应超过15%15%。 七七. .菌落计数及报告注意事项菌落计数及报告注意事项 如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释小的平板上菌落如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释小的平板上菌落数高数高, ,有两种可能性：一是检验有两种可能性：一是检验 工作中发生差工作中发生差错；二是受防腐剂影响。这二种情况不可用作检样计数错；二是受防腐剂影响。这二种情况不可用作检样计数报告的依据。报告的依据。 如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼
17、脂与检样混合时，一个细胞块被分散所造成。这是在琼脂与检样混合时，一个细胞块被分散所造成。一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链应作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开链应作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。此外，如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受来数。此外，如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不应分开来数。应分开来数。 如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可计报告，而如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可计报告，而应在稀
18、释最大的平板上，任意数其中两个平方厘米中的应在稀释最大的平板上，任意数其中两个平方厘米中的菌落数，除以菌落数，除以2 2求出求出1cm21cm2内平均菌落数，乘以皿底面积内平均菌落数，乘以皿底面积63.663.6, ,再乘以其稀释倍数，以此结果作报告，例如：再乘以其稀释倍数，以此结果作报告，例如：10-110-110-310-3稀释度的所有平板上均菌落密布，而在稀释度的所有平板上均菌落密布，而在10-310-3稀释度的平板上任意数两个平方厘米内的菌落数是稀释度的平板上任意数两个平方厘米内的菌落数是6060个，个，皿底直径为皿底直径为9 9，则该检样每克（或，则该检样每克（或mlml）中）中“估
19、计估计”菌菌落数为：落数为： 60602 263.663.61000=1.91000=1.9106106 63.6 63.6是按皿底直径为是按皿底直径为9 9时计算而得的面积时计算而得的面积, ,如所用平如所用平皿底直径不是皿底直径不是9 9, ,应另求面积应另求面积. . 签于检样中的细菌是以单个、成双、链状或成堆的形式签于检样中的细菌是以单个、成双、链状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可来源于单个细胞，故平板上所得需氧和兼性厌氧的菌可来源于单个细胞，故平板上所得需氧和兼性厌氧的菌落数应以单位重量（落数应以单位重量（
20、g g）或容量（）或容量（mlml）的菌落形成单位）的菌落形成单位（Colony formingunits CFUColony formingunits CFU）报告更恰当。）报告更恰当。 乳与乳制品中大肠菌群的测定乳与乳制品中大肠菌群的测定方法方法刘晓燕刘晓燕菌落总数的测定菌落总数的测定一一.术语术语 群：两个不同种的微生物之间经常会出现一些介于这两种之间的群：两个不同种的微生物之间经常会出现一些介于这两种之间的中间类型的菌种。中间类型的菌种。 例如：大肠杆菌与产气肠细菌两种之间的区分是十分明显的，但例如：大肠杆菌与产气肠细菌两种之间的区分是十分明显的，但另外还有一些菌种介于这两种之间的中间
21、类型，就是说，他们在另外还有一些菌种介于这两种之间的中间类型，就是说，他们在亲缘关系是比较接近一些菌种。在分类上，就是大肠杆菌，产气亲缘关系是比较接近一些菌种。在分类上，就是大肠杆菌，产气肠细菌和一些中间型的菌种合归为一群，就是大肠菌群。肠细菌和一些中间型的菌种合归为一群，就是大肠菌群。 大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致便污染指标来评价食品的卫生质量
22、，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以食品中大肠菌群数系以100ml100ml（g g）检样内大肠菌群最可能数）检样内大肠菌群最可能数（MPNMPN）表示。）表示。二二. .设备和材料设备和材料温箱：温箱：363611冰箱：冰箱：0404恒温水浴：恒温水浴：464611天平天平显微镜显微镜均质器或乳钵均质器或乳钵平皿：直径平皿：直径90mm90mm试管：试管：1818180180和和2020200200吸管吸管1ml1ml和和10ml10ml广口瓶或三角烧瓶：容量为广口瓶或三角烧瓶：容量为500ml500ml玻璃珠：直径约玻璃珠：直径约5mm5mm载玻片载玻片
23、酒精灯酒精灯试管架试管架培养基和试剂培养基和试剂乳糖胆盐发酵管：按乳糖胆盐发酵管：按GB4789.28GB4789.28中中4.94.9规定或按购买的商用培养规定或按购买的商用培养基配方配制。基配方配制。伊红美兰琼脂平板：按伊红美兰琼脂平板：按GB4789.28GB4789.28中中4.254.25规定或按购买的商用培规定或按购买的商用培养基配方配制。养基配方配制。乳糖发酵管：按乳糖发酵管：按GB4789.28GB4789.28中中4.104.10规定或按购买的商用培养基配规定或按购买的商用培养基配方配制。方配制。生理盐水生理盐水革兰氏染色液：按革兰氏染色液：按GB4789.28GB4789.
24、28中中2.22.2规定规定 . .检 样稀 释乳糖胆盐发醇管361，1824h不产气产 气大肠菌群阴性伊红美兰琼脂平板361，1824h报 告革兰氏染色乳糖发醇管361，1824h革兰氏阳性革兰氏阴性无芽孢杆菌大肠菌群阴性报 告产 气不产气大肠菌群阴性报 告大肠菌群阴性报 告 三三 、检验程序、检验程序 大肠菌群检验程序如下：四四. . 操作步骤操作步骤 检样稀释检样稀释 以无菌操作检样以无菌操作检样25ml(25ml(或或g)g)放于装有放于装有225ml225ml灭菌生理盐水灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃内或其他稀释液的灭菌玻璃内( (瓶内预置适当数量的玻璃瓶内预置适当数量的玻璃珠珠
25、) )或灭菌乳钵内或灭菌乳钵内, ,经充分振摇或研磨做成经充分振摇或研磨做成1 1：1010的均匀的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，稀释液。固体检样最好用均质器，8000800010000r/min10000r/min的的速度处理速度处理1min1min，做成，做成1 1：1010的均匀稀释液。的均匀稀释液。 用用1ml1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1 1：1010稀释液稀释液1ml1ml，注入含有，注入含有9ml9ml灭菌灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1 1：1010的稀释液。的稀释液。 另取另取1ml1ml灭菌吸管，按
26、上条操作依次做灭菌吸管，按上条操作依次做1010倍递增稀释液，倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支每递增稀释一次，换用一支1ml1ml灭吸管。灭吸管。 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种选择三个稀释度，每个稀释度接种3 3管。管。 乳糖发酵实验乳糖发酵实验 将待检样品接种于糖胆盐发酵管内，接种量在将待检样品接种于糖胆盐发酵管内，接种量在1ml1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml1ml及及1ml1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一
27、稀释度接种种3 3管，置管，置363611培养箱内，培养培养箱内，培养24242h2h，如所，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 分离培养分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置363611培养箱内，培养培养箱内，培养181824h24h，然后取出，观察菌落，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染形态，并做革兰氏染 色和证实实验。色和证实实验。 证实实验（复发酵实验）证实实验（复发酵实验） 在上述平板上，挑
28、取可疑大肠菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1 12 2个进革兰氏个进革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置染色，同时接种乳糖发酵管，置363611培养箱内，培培养箱内，培养养24242h2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阴性。为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阴性。 报告报告 根据证实为肠菌群阴性的管数查根据证实为肠菌群阴性的管数查MPNMPN检索表，报告每检索表，报告每100ml100ml（g g）大肠菌群的最可能数。）大肠菌群的最可能数。 五、注意事项：五、注意事项：1 1）初发酵和证实试验）
29、初发酵和证实试验乳糖发酵试验系样品的发酵，不是纯菌的发酵试验，所以乳糖发酵试验系样品的发酵，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵初发酵阳性并不代表在大肠菌群阳性，因此，必须作进一步证实阳性并不代表在大肠菌群阳性，因此，必须作进一步证实试验。试验。在食品检验上（个别除外）一般来说，来反上有典型的较在食品检验上（个别除外）一般来说，来反上有典型的较多的大肠菌群菌落，革兰氏阳性杆菌，即可做出判断。如多的大肠菌群菌落，革兰氏阳性杆菌，即可做出判断。如果典型菌落甚少，则应多挑选几个菌落做证实试验，只做果典型菌落甚少，则应多挑选几个菌落做证实试验，只做初发酵即判断，对某些食品来说误差是很大的。有数据表初发酵即判
30、断，对某些食品来说误差是很大的。有数据表明，食品中大肠检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相明，食品中大肠检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差很大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。差很大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。 2 2）产气量与倒管）产气量与倒管试验表明，在肠菌群的产气量与大肠菌群的检出北呈正相试验表明，在肠菌群的产气量与大肠菌群的检出北呈正相关系。但也随样品的种类而变。大肠菌群的产气量多者可关系。但也随样品的种类而变。大肠菌群的产气量多者可充满整个倒气管，少者可产生比小米粒还小的气泡。如果充满整个倒气管，少者可产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵
31、管如有疑问，可用手轻轻打动对产酸但未产气的乳糖发酵管如有疑问，可用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。另外，产气量与倒气管有一定的关系，而应作进一步试验。另外，产气量与倒气管有一定的关系，倒气管口不完整，有利于气体的进入；管口周围有沉淀等倒气管口不完整，有利于气体的进入；管口周围有沉淀等物质能影响气体的进入。物质能影响气体的进入。 3 3）挑选菌落）挑选菌落在平板呈现紫黑色，有或无金属光泽，检出率最高，粉红色、在平板呈现紫黑色，有或无金属光泽，检出率最高，粉红色、粉色检出率最低。另外，只挑选一个菌落影响
32、大肠菌群的检出粉色检出率最低。另外，只挑选一个菌落影响大肠菌群的检出率，当菌落不典型时，应挑取率，当菌落不典型时，应挑取2 23 3个菌落作证实试验，以免出个菌落作证实试验，以免出现假阴性。现假阴性。4 4）抑菌剂）抑菌剂大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。胆盐的主要钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。胆盐的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。有些抑菌剂量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作有些抑菌剂量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响
33、，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法添加。添加。 5 5）指示剂）指示剂 溴甲酚紫属于酸碱示剂，其溴甲酚紫属于酸碱示剂，其PHPH变色范围为：黄变色范围为：黄5.25.26.86.8紫紫, ,当料管中培养基当料管中培养基(PH=7.40.1)(PH=7.40.1)的颜色由紫的颜色由紫色变为黄色时色变为黄色时, ,证明培养基中有酸性物质产生证明培养基中有酸性物质产生, ,此时培此时培养基的养基的PH5.2,PH5.2,培养基呈酸性。培养基呈酸性。6)MPN6)MPN检索表检索表 MPNMPN为最大可能数的管称，表示样品中活菌的密度，为最大可能数的管称
34、，表示样品中活菌的密度，是用概率论表推算样品中菌数最近似的数值。是用概率论表推算样品中菌数最近似的数值。MPNMPN检索检索表只给出了三个稀释度，如果改用不同的稀释度，则表只给出了三个稀释度，如果改用不同的稀释度，则表内数值应相应降低或增加表内数值应相应降低或增加1010倍。倍。 刘晓燕刘晓燕乳与乳制品霉菌和酵母菌的检验乳与乳制品霉菌和酵母菌的检验 菌落总数的测定菌落总数的测定一一. .霉菌和酵母菌介绍：霉菌和酵母菌介绍： 霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形，卵圆形、腊肠形或杆状。霉菌也是是单细胞，呈圆形，卵圆形、腊
35、肠形或杆状。霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。 由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是菌生长的食品中出现，这些食品是PHPH低、湿度低、含盐低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和 菌落总数的测定菌落总数的测定 辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的辐照等贮藏及保
36、藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物一霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去代谢产物一霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在机关报鲜的和加工的食品中色、香、味。例如，酵母在机关报鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混虫，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的混虫，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫
37、生质量的指示菌，并以霉菌和酵母菌计数来制定食品被污染的程度。示菌，并以霉菌和酵母菌计数来制定食品被污染的程度。 二二. . 设备和材料设备和材料 温箱：温箱：25252828 振荡器振荡器 天平天平 显微镜显微镜 具塞三角瓶具塞三角瓶 试管：试管：15mm15mm150mm150mm 平皿：直径平皿：直径9 9 酒精灯酒精灯 吸管：吸管：1ml1ml及及10ml10ml 载物玻片载物玻片 盖玻片盖玻片 广口瓶广口瓶 牛皮纸袋：牛皮纸袋：121121灭菌灭菌20min20min 金属勺、刀等金属勺、刀等 试管架试管架 接种针接种针 橡皮乳头橡皮乳头 培养基和试剂培养基和试剂 在霉菌和酵母计数中，
38、主要使用下几种选择性培养基。在霉菌和酵母计数中，主要使用下几种选择性培养基。 马铃薯马铃薯- -葡萄葡萄- -琼脂培养基（琼脂培养基（PDAPDA）：霉菌和酵母菌在）：霉菌和酵母菌在PDAPDA培养基上生长良好。用培养基上生长良好。用PDAPDA作平板计数作平板计数 时，必项加入抗菌素以抑制细菌。按时，必项加入抗菌素以抑制细菌。按GB4789.28GB4789.28中中4.794.79规定。规定。孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素肯有抑制细菌的红色有助于霉菌和酵孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素肯有抑制细菌的红色有助于霉菌和酵 母菌落的计数。按母菌落的计数。
39、按GB4789.28GB4789.28中中0.810.81规定。规定。高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作和。按和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作和。按GB4789.28GB4789.28中中4.784.78规定。规定。灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水 75%75%乙醇溶液乙醇溶液. . 三三 、检验程序、检验程序 霉菌、酵母菌检验程序如下：5d2528检 样粉状食品块状食品液状食品糊状食品粮称取25g，加225ml无菌水吸取25ml，加225m
40、l无菌水做成几个适当倍数的稀释度选择23个适宜稀释度，各以1ml加入灭菌平皿内每皿加入适量培养基（可选用马铃薯葡萄糖琼脂附加抗菌素、高盐察氏培养基，或孟加拉红培养基）菌落计数四四. .操作步骤操作步骤 采样采样: :取样时须特别注意样品的代表性避免采样时的污取样时须特别注意样品的代表性避免采样时的污染。首先准备好灭容器和采样工具，乳灭菌牛皮纸袋或染。首先准备好灭容器和采样工具，乳灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属刀或勺等。在卫生学调果基础上，采取有广口瓶，金属刀或勺等。在卫生学调果基础上，采取有代表性的样品。样品采集后应尽快检验，否则应将样品代表性的样品。样品采集后应尽快检验，否则应将样品低温处干燥处
41、。低温处干燥处。 粮食（包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮）样品的粮食（包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮）样品的采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分一层五点，或分层随机采取不同点的样品，从一般可分一层五点，或分层随机采取不同点的样品，从粉混匀后，取粉混匀后，取500g500g左右送检。小量存粮可使用金属小匀左右送检。小量存粮可使用金属小匀采取上、下、下各部位的混合样品。采取上、下、下各部位的混合样品。 海运进口粮的采样：每一仓采取表层、上层、中层及下海运进口粮的采样：每一仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混
42、合，如船仓盛粮超过层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛粮超过1000l1000l，则应加采一个样品送检。，则应加采一个样品送检。 谷物加工制品（包括熟饭、糕点、面包等）、发酵食品、谷物加工制品（包括熟饭、糕点、面包等）、发酵食品、乳与乳制品以及其他液体食品，用灭菌工具采集可凝霉变乳与乳制品以及其他液体食品，用灭菌工具采集可凝霉变食品食品250g250g，装入灭菌容器内送检。，装入灭菌容器内送检。 以无菌操作称取检验以无菌操作称取检验25g(25ml),25g(25ml),放入含有放入含有225 ml225 ml灭菌水灭菌水的玻赛三角瓶中，振摇的玻赛三角瓶中，振摇3030分钟，即为分钟，即为
43、1 1：1010稀释液。稀释液。 用灭菌吸管吸取用灭菌吸管吸取1 1：1010稀释液稀释液10ml10ml，注入试管中，用带橡，注入试管中，用带橡皮乳头的皮乳头的1ml1ml吸管反复吹吸吸管反复吹吸5050次，使霉菌孢子充分散开。次，使霉菌孢子充分散开。 取取1 mll1 mll：1010稀释液注入含有稀释液注入含有9 ml9 ml灭菌水的试管中，另换灭菌水的试管中，另换一支一支1 ml1 ml吸管吹吸吸管吹吸5 5次，此液为次，此液为1 1：100100稀液。稀液。 按上述操作顺序做按上述操作顺序做1010倍递增稀释液，每稀释一次，换用一倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支支1 ml1 ml吸
44、管，根据对样品的污染程度，选择吸管，根据对样品的污染程度，选择2 23 3个合适的个合适的稀释度，分别做稀释度，分别做1010倍稀释的同时，吸取倍稀释的同时，吸取1 ml1 ml稀释液于灭菌稀释液于灭菌平皿内，待琼脂凝固后，翻转平板，将其置于平皿内，待琼脂凝固后，翻转平板，将其置于25252828的的培养箱中，培养箱中，3 3天后开始观察，共培养观察天后开始观察，共培养观察5 5天。天。 计数方法：通常选择菌落数在计数方法：通常选择菌落数在1010150150之间的平皿进行之间的平皿进行计数，同一稀释度的两个平皿的菌落数的平均埴乘以稀释计数，同一稀释度的两个平皿的菌落数的平均埴乘以稀释倍数，即
45、位每克或每毫升检验中所含霉菌和酵母数。关于倍数，即位每克或每毫升检验中所含霉菌和酵母数。关于稀释倍数的选择可参考细菌落总数测定。稀释倍数的选择可参考细菌落总数测定。 报告：每克或每毫升食品所含霉菌和酵母菌以个报告：每克或每毫升食品所含霉菌和酵母菌以个/ /克克（个（个/ /毫升）表示。毫升）表示。. . 五五 霉菌直接镜检计数法：对霉菌计数，可以采用直接镜检的方法霉菌直接镜检计数法：对霉菌计数，可以采用直接镜检的方法进行计数。进行计数。 在显微镜下，霉菌丝具有如下特征：在显微镜下，霉菌丝具有如下特征： 平行壁：霉菌菌丝呈管状，多数情况下，整个菌丝的直径是一致平行壁：霉菌菌丝呈管状，多数情况下，
46、整个菌丝的直径是一致的。因此在显微镜下菌丝壁看起来象两条平行的线。这是区别霉的。因此在显微镜下菌丝壁看起来象两条平行的线。这是区别霉菌菌丝和其他纤维时最有用的特征之一。菌菌丝和其他纤维时最有用的特征之一。 横隔：许多霉菌的菌丝具有横隔，毛霉、根霉等少数霉菌的菌丝横隔：许多霉菌的菌丝具有横隔，毛霉、根霉等少数霉菌的菌丝没有横隔。没有横隔。 菌丝内呈粒状：薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍显微镜菌丝内呈粒状：薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍显微镜下透过细胞壁可见其呈粒状或点状。下透过细胞壁可见其呈粒状或点状。 分枝：如菌丝不太短，则多分枝：如菌丝不太短，则多 呈分枝状，分枝与主干的直径几乎呈
47、分枝状，分枝与主干的直径几乎相同，有分枝是鉴定霉茵特征之一。相同，有分枝是鉴定霉茵特征之一。 菌丝的顶端：常呈钝圆形。菌丝的顶端：常呈钝圆形。 无折射现象。无折射现象。 凡有以上特征之一的均可判定为霉菌菌丝。凡有以上特征之一的均可判定为霉菌菌丝。 观察视野中有无菌丝，凡符合下列情况之一者为阳性视野。观察视野中有无菌丝，凡符合下列情况之一者为阳性视野。 一根菌丝长度超过视野直径一根菌丝长度超过视野直径1/61/6。 一根菌丝长度加上分枝的长度超过视野直径一根菌丝长度加上分枝的长度超过视野直径1/61/6。 两根菌丝总长度超过视野直径两根菌丝总长度超过视野直径1/61/6。 三根菌丝总长度超过视野直径三根菌丝总长度超过视野直径1/61/6。 一丛菌丝视为一个菌丝，所有菌丝（包括分枝）总长度超过视野一丛菌丝视为一个菌丝，所有菌丝（包括分枝）总长度超过视野直径直径1/61/6。 根据对所有视野的观察结果，计算阳性视野所占比例，并以阳性根据对所有视野的观察结果，计算阳性视野所占比例，并以阳性视野百分数（视野百分数（% %）报告结果。计算公式：）报告结果。计算公式： 每件样品阳性视野（每件样品阳性视野（% %）= =（阳性视野数（阳性视野数/ /观察视野数）观察视野数）100 100
