1、第二章第二章 生生 物物 催催 化化 剂剂酶催化剂（酶反应过程）酶催化剂（酶反应过程）活细胞催化剂（发酵过程）活细胞催化剂（发酵过程）用途用途单酶系统时，用于单一反应；单酶系统时，用于单一反应；多酶系统时，可用于若干串多酶系统时，可用于若干串联反应联反应系列的串联反应，产物可以是简单以系列的串联反应，产物可以是简单以及复杂的代谢产物及复杂的代谢产物来源和价格来源和价格从细胞中提取，技术较为困难，从细胞中提取，技术较为困难，除若干商品酶制剂外，价格除若干商品酶制剂外，价格昂贵昂贵发酵开始时，接入少量种子液，价格发酵开始时，接入少量种子液，价格低廉低廉稳定性稳定性较差，只有高稳定性的或经稳较差，只
2、有高稳定性的或经稳定性修饰的，才能工业应用定性修饰的，才能工业应用略高，但须不断保持其稳定性略高，但须不断保持其稳定性辅酶再生辅酶再生在需要进行辅酶再生的反应中，在需要进行辅酶再生的反应中，技术和经济问题难以解决技术和经济问题难以解决在新陈代谢过程中自行解决在新陈代谢过程中自行解决原料要求原料要求简单，但要求较高纯度的化合简单，但要求较高纯度的化合物作底物物作底物可用粗原料，但要考虑菌体生长和产可用粗原料，但要考虑菌体生长和产物形成的必要成分作培养基物形成的必要成分作培养基反应时间反应时间短，数分钟至数小时短，数分钟至数小时长，一天左右至一周以上长，一天左右至一周以上反应器反应器体积较小，但较
3、复杂，体积较小，但较复杂，体积较大，但较简单体积较大，但较简单过程控制过程控制简单简单复杂，过程常分菌体生长和产物形成复杂，过程常分菌体生长和产物形成两个阶段；物料成分性质复杂，两个阶段；物料成分性质复杂，反应途径易于失控。反应途径易于失控。产品分离产品分离简单简单复杂，反应终了时产物含量低，副产复杂，反应终了时产物含量低，副产物较多，且含有菌体物较多，且含有菌体工业应用工业应用较少，目前用于工业生产的不较少，目前用于工业生产的不超过超过10种种较多，常见的有数十种较多，常见的有数十种酰胺烷基化酰胺烷基化D-脱酰胺酶脱酰胺酶D-海因酶海因酶自发消旋化自发消旋化 5-单取代海因单取代海因 产生多
4、种副产物产生多种副产物Rhodococcus rhodochrous2、国际市场酶制剂销售额比例、国际市场酶制剂销售额比例国内酶制剂销售额比例国内酶制剂销售额比例一一. .常用的产酶微生物常用的产酶微生物二、产酶微生物优良菌种选育二、产酶微生物优良菌种选育1.1.自然育种：自然育种：未经人工处理，利用微生物的自然未经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。突变进行菌种选育的过程称为自然选育。 2.2.诱变育种：诱变育种：利用诱变剂处理微生物细胞，提高利用诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优
5、质菌种的育种方法。高产优质菌种的育种方法。 (1) 使诱导型变为组成型使诱导型变为组成型选育组成型突变株选育组成型突变株 培养基中添加诱导酶抑制剂，使组成型菌株被富集。培养基中添加诱导酶抑制剂，使组成型菌株被富集。 - -半乳糖苷酶的抑制剂半乳糖苷酶的抑制剂邻硝基邻硝基- -D-D-岩藻糖苷岩藻糖苷 交替培养法：乳糖培养基交替培养法：乳糖培养基 葡萄糖培养基葡萄糖培养基 乳糖培养基乳糖培养基 显色反应：不含诱导物的培养基培养菌种后，显色反应：不含诱导物的培养基培养菌种后，- -半乳半乳 糖苷酶酶解糖苷酶酶解邻硝基苯半乳糖苷邻硝基苯半乳糖苷 (2)使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型 A.选
6、育营养缺陷型突变株：选育营养缺陷型突变株：解除反馈阻遏解除反馈阻遏 (降低末端产物浓度降低末端产物浓度） B.选育结构类似物抗性突变选育结构类似物抗性突变 (代谢失调，代谢失调，抗反馈阻遏突变株抗反馈阻遏突变株)A.选育营养缺陷型突变株：选育营养缺陷型突变株：L-谷氨酸谷氨酸脱氢酶脱氢酶 谷氨酰胺谷氨酰胺合成酶合成酶 选育营养缺陷型突变株：选育营养缺陷型突变株：紫外和化学试剂诱变后，在筛选培养基（添加脯氨酸）中紫外和化学试剂诱变后，在筛选培养基（添加脯氨酸）中生长，基础培养基中不长的为缺陷型。生长，基础培养基中不长的为缺陷型。选育结构类似物抗性突变：选育结构类似物抗性突变：筛选抗反馈阻遏筛选抗
7、反馈阻遏和反馈抑制突变株。和反馈抑制突变株。这种突变属于代谢失调，即这种突变属于代谢失调，即在细胞中已有大量的末端产物，仍不断合成这一在细胞中已有大量的末端产物，仍不断合成这一代谢产物。代谢产物。 三、产酶动力学三、产酶动力学 （一）（一） 酶生物合成的模式酶生物合成的模式 根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为四种模式，即：的生物合成分为四种模式，即： 同步合成型同步合成型 生长偶联型生长偶联型 中期合成型中期合成型 部分生长偶联型部分生长偶联型延续合成型延续合成型 非生长偶联型非生长偶联型 滞后合成型滞后合成型1. 1. 生长偶联型（
8、又称同步合成型）生长偶联型（又称同步合成型） 酶的生物合成与细胞生长同步。酶的生物合成与细胞生长同步。特点：特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。和反应产物阻遏。如利用米根霉生产脂肪酶。如利用米根霉生产脂肪酶。 当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的立即停止，表明这类酶所对应的mRNAmRNA很不稳定。很不稳定。a 酶细 胞细胞 或酶浓 度时间2 2、生长偶联型中的特殊形式、生长偶联型中的特殊形式中期合成型中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细酶的合
9、成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的所对应的mRNAmRNA是不稳定的。是不稳定的。02468100.00.10.20.30.40.5 细 胞浓度 酶 浓度细胞 浓 度 (OD500)酶浓 度(U/mL)时间 (h) 枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 3.3.部分生长偶联型（又称延续合成型）部分生长偶联型（又称延续合成型） 酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长酶的合成在细胞的生长阶段开
10、始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。 所对应的所对应的mRNAmRNA相当稳定。相当稳定。040801200204060 细 胞浓度 酶浓度酶浓度 (单位/ml)时 间 (h)0.012.525.037.550.0细 胞浓度 (g/L) 黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线4. 4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）非生长偶联型（又称滞后合成型） 只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成只有当细胞生长进入平衡期以后，酶
11、才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点特点：受分解代谢物的阻遏作用。：受分解代谢物的阻遏作用。 所对应的所对应的mRNAmRNA稳定性高。稳定性高。c酶细胞细胞 或酶浓 度时 间02040608001020304050 酶浓 度 细胞 浓 度细胞 浓 度 (g/L)时 间 (h)01020304050酶浓 度 (U) 黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 总结：影响酶生物合成模式的主要因素 高：可在细胞停止生长后继 1）mRNA的稳定性 续合成酶 差：随着细胞停止生长而终 止酶的合成 2）培养基中阻遏物的存在 不
12、受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。 受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始 合成。 酶生产中最理想的合成模式：酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。 对于：对于：同步合成型：同步合成型：提高对应的提高对应的mRNAmRNA的稳定性，如降低发酵的稳定性，如降低发酵 温度温度 。滞后合成型：滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。酶的合成提早开始。中期合成型：中期合成型：要在提高要在提高mRNAmRNA稳定性以及解除阻遏两方稳定性以及解除阻遏两方 面努力面努力。
