1、第十七章第十七章 第一节第一节 概述概述一、体内药物分析的性质一、体内药物分析的性质 体内药物分析（生物药物分析）是药物体内药物分析（生物药物分析）是药物分析的重要分枝，是随着临床药学、临分析的重要分枝，是随着临床药学、临床药理学的发展和需要而建立起来的综床药理学的发展和需要而建立起来的综合性的应用学科。合性的应用学科。 体内药物分析体内药物分析研究药物在体内的研究药物在体内的“命运命运” 通过分析手段了解药物在体内数量与质量的变通过分析手段了解药物在体内数量与质量的变化，获得药物动力学参数和代谢的方式、排泄化，获得药物动力学参数和代谢的方式、排泄的途径等信息，为临床药学研究提供必要的数的途径
2、等信息，为临床药学研究提供必要的数据和相关信息据和相关信息, 有助于药物生产、研究、临床有助于药物生产、研究、临床应用等方面对药物作出估计与评价。应用等方面对药物作出估计与评价。 如果没有体内药物分析提供的数据和相关信息，如果没有体内药物分析提供的数据和相关信息，进行临床药学研究是不可想象的。进行临床药学研究是不可想象的。 体内药物分析是一门研究生物机体中药物及其体内药物分析是一门研究生物机体中药物及其代谢物代谢物和内源性物质的在体内质内源性物质的在体内质与量变化规律量变化规律的分析方法学的分析方法学 意义：意义： （一）新药评价和开发中的意义新药评价和开发中的意义 （二）临床合理用药中的意义
3、（二）临床合理用药中的意义 （三）药物作用机制探讨（三）药物作用机制探讨 药物质量评价的安药物质量评价的安全性、有效性全性、有效性 （四）代谢分型研究中应用（四）代谢分型研究中应用 分析物分析物：主要主要生物样品生物样品中的药物、体内中的药物、体内代谢物、活性的代谢物、内源性物质代谢物、活性的代谢物、内源性物质1. 分析方法学的研究和完善分析方法学的研究和完善 提供灵敏、专提供灵敏、专属、准确的分析方法与最佳分析条件属、准确的分析方法与最佳分析条件2. 为药物体内研究提供数据为药物体内研究提供数据 提供药物在动物和人体内的药物动力学提供药物在动物和人体内的药物动力学 参数、参数、生物利用度及血
4、浆蛋白结合率等基生物利用度及血浆蛋白结合率等基 本数据本数据3. 为临床治疗药物监测提供准确的血药浓度测为临床治疗药物监测提供准确的血药浓度测定值定值 提供药学情报和信息提供药学情报和信息,参与临床科学用药参与临床科学用药, 确确定最佳剂量定最佳剂量,制定治疗方案制定治疗方案.4. 体内内源性物质的测定和研究体内内源性物质的测定和研究 氨基酸、氨基酸、激素、肌酐、草酸、尿酸等在体内一定激素、肌酐、草酸、尿酸等在体内一定浓度范围内含量变化指示机体病变浓度范围内含量变化指示机体病变 为为某些疾病的诊断及治疗提供重要信息某些疾病的诊断及治疗提供重要信息5. 滥用药物的检测滥用药物的检测 为吸毒者体内
5、毒品和运动员体内禁药的为吸毒者体内毒品和运动员体内禁药的测定提供分析方法和可靠数据测定提供分析方法和可靠数据. 1干扰物质多干扰物质多 2样品量少、不能重复取样样品量少、不能重复取样 3被测成分浓度低被测成分浓度低,对分析方法的灵敏度和专对分析方法的灵敏度和专 属性要求较高属性要求较高. 4有时需要测定缀合物和代谢产物有时需要测定缀合物和代谢产物.5. 供药物浓度监测的分析方法要求简便、快速供药物浓度监测的分析方法要求简便、快速 .工作量大，要有一定的仪器设备工作量大，要有一定的仪器设备1. 检测方法的高灵敏度检测方法的高灵敏度（最低检测量10-910-7g甚至10-1510-12g）2. 分
6、离方法的高选择性、高专属性分离方法的高选择性、高专属性 3. 分析方法应达到要求的精密度、准确度分析方法应达到要求的精密度、准确度,具具 有有稳定且较高的回收率稳定且较高的回收率4. 求解出实验与临床上有意义的参数求解出实验与临床上有意义的参数体内药物分析的发展概况体内药物分析的发展概况及热点问题及热点问题 20世纪世纪60年代年代临床药理学与生物药剂学的建立临床药理学与生物药剂学的建立70年代初年代初体内药物分析在国外开始建体内药物分析在国外开始建70年代末年代末血药浓度监测广泛用于临床血药浓度监测广泛用于临床80年代年代体内药物分析学科日趋成熟体内药物分析学科日趋成熟 90年代年代微量、超
7、微量分离、分析技术应用微量、超微量分离、分析技术应用第二节第二节 生物样品的种类、采集和制备生物样品的种类、采集和制备 生物样品种类生物样品种类 脏器组织：脏器组织： 体液体液 ： 血液、尿液、唾液、血液、尿液、唾液、 毛发、乳汁、毛发、乳汁、 精液、脑脊液、泪液、胆精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等 最常用的生物样本最常用的生物样本 尿液尿液用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定的研究测定唾液唾液用于某些用于某些S/P
8、较为恒定的药物较为恒定的药物 的测定的测定 毛发毛发可用于药物滥用监测及微量元素测定可用于药物滥用监测及微量元素测定肝、胃、肾、肺、脑等脏器组织肝、胃、肾、肺、脑等脏器组织 动物试验研究动物试验研究药物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡药物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡 1. 血样的采集血样的采集 一般用注射器直接采集静脉血，每次一般用注射器直接采集静脉血，每次15ml；动物实验时，采血量不宜超过动；动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一物总血量的十分之一 注：测定血中药物的浓度，通常是指测定注：测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，血浆或血清中的药物浓度
9、，尤其是血浆，并非指全血并非指全血 采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以混合后，以25003000r/min离心离心510min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆（血浆（ plasma ） 采集的静脉血液置试管中，于采集的静脉血液置试管中，于37或室或室温放置温放置30min1h。血液凝固后，用细竹。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在再在25003000 r/min离心离心510min，上，上层淡黄色液体即为血清（层淡黄色液体即为血清（serum） 血清比
10、血浆只是少一种纤维蛋白原血清比血浆只是少一种纤维蛋白原 C血浆= C血清 血浆比血清的分离快，而且制取量约为血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的全血的50%60%（血清为全血的（血清为全血的20%40%），多数用血浆进行分析。），多数用血浆进行分析。 若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品有影响时，则应使用血清样品 成成 分：分： 将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞均相状态，经离心操作，保持血浆和血细胞均相状态，即为即为“全血全血” （whole blood） 血样
11、主要应用于：血样主要应用于： 药物动力学药物动力学 生物利用度生物利用度 临床治疗药物浓度监测临床治疗药物浓度监测 尿液用于：尿液用于：药物剂量回收、药物尿清除率、生物药物剂量回收、药物尿清除率、生物利用度的研究，预测药物代谢过程、类型利用度的研究，预测药物代谢过程、类型 体体内药物清除主要是通过尿液排出，药物以原型、内药物清除主要是通过尿液排出，药物以原型、相及相及相代谢物等多种形式排出相代谢物等多种形式排出 性状性状淡黄色或黄褐色，淡黄色或黄褐色， 相对密度相对密度1.1051.020，pH4.88.0 成分成分水、含氮化合物、盐类等水、含氮化合物、盐类等 微生物微生物防腐剂防腐剂样本来源
12、样本来源自然排尿，成人一日排尿量自然排尿，成人一日排尿量为为15L（随时尿、晨尿、白天尿、（随时尿、晨尿、白天尿、 夜间尿及时间尿）夜间尿及时间尿） 样本采集样本采集一般采集时间尿（规定时间一般采集时间尿（规定时间内采集尿液体积和排内采集尿液体积和排 入尿中的药物总量入尿中的药物总量 唾液唾液无损伤取样，易收集；一些药物的无损伤取样，易收集；一些药物的唾液药浓唾液药浓(S)与血浆游离药浓与血浆游离药浓(P)密切相关，密切相关，因此：因此： TDM中利用对中利用对S的测定代替对的测定代替对P的监测的监测 药代动力学的研究药代动力学的研究 在潄口后在潄口后15min，安静状态下采集口腔，安静状态下
13、采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样采样(需注意干扰需注意干扰) 唾液样品采集后，应立即测量其除去泡唾液样品采集后，应立即测量其除去泡沫部分的体积，以沫部分的体积，以3000rpm离心离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存取上清液直接测定或冷冻保存 冷藏冷藏冰箱冰箱(4)中短期保存中短期保存(12d) 冷冻冷冻冷柜冷柜(-20)或低温冷柜或低温冷柜(-80) 中长期保存中长期保存 注：冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定注：冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定 血样血样 ： 采集后及时分离血浆和血清（采集后及时分离血浆和血清（2h），分离后再），分离后再
14、贮存贮存 若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离分离 置硬质玻璃试管中完全密塞后保存置硬质玻璃试管中完全密塞后保存 尿样尿样 采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐剂后保存剂后保存 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐酸等酸等 甲苯在尿液表面形成薄膜 醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长 保存时间为2436h(4)或长期(-20) 唾液唾液 为阻止酶催化生成粘蛋白，应在为阻止酶催化生成粘蛋
15、白，应在 4以下保存以下保存 保存过程中放出二氧化碳而使保存过程中放出二氧化碳而使pH升高，测定升高，测定唾液唾液pH时应在取样的当时为好时应在取样的当时为好 冷冻保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液冷冻保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用，否则测定结果会产生误差充分搅匀后再用，否则测定结果会产生误差 使药物从缀合物及结合物中释放使药物从缀合物及结合物中释放 定药物的总浓度 使样品纯化使样品纯化消除生物基质中内源性 物质的干扰 提高检测灵敏度提高检测灵敏度适应和符合测定方 法要求的灵敏度 防止分析仪器的污染和劣化防止分析仪器的污染和劣化提高 分析仪器的耐受程度、改善分析结果二、方
16、法的选择 待测生物样品的类型决定样品预处理方法：待测生物样品的类型决定样品预处理方法： 血浆、血清血浆、血清常需去除蛋白质常需去除蛋白质 唾液唾液主要采用离心沉淀除去粘蛋白主要采用离心沉淀除去粘蛋白 尿液尿液常采用酸或酶法使缀合物水解常采用酸或酶法使缀合物水解 头发头发需要将头发进行有机破坏后需要将头发进行有机破坏后 测定微量元素测定微量元素酸碱性酸碱性 (pKa)、溶解性、溶解性提取性质提取性质 挥发性挥发性挥发损失及气相色谱法的应用挥发损失及气相色谱法的应用 光谱特性光谱特性分析仪器的选择分析仪器的选择 官能团性质官能团性质化学衍生化和检测器应用化学衍生化和检测器应用 化学稳定性化学稳定性
17、处理条件的选择处理条件的选择 存在形式及血浆蛋白结合率存在形式及血浆蛋白结合率预处理方法预处理方法 不同药物在体内中浓度相差极为悬殊不同药物在体内中浓度相差极为悬殊地高辛治疗血浓为地高辛治疗血浓为12ng/ml 水杨酸盐治疗血浓为水杨酸盐治疗血浓为20100 g/ml 浓度大浓度大预处理要求稍低预处理要求稍低 浓度低浓度低样品制备要求高样品制备要求高 药物测定目的不同药物测定目的不同样品预处理的要求不同：样品预处理的要求不同： 急性中毒病例急性中毒病例要求快速鉴定所怀疑的药物，要求快速鉴定所怀疑的药物，应在尽可能短的时间内获得其浓度的数据，对样应在尽可能短的时间内获得其浓度的数据，对样品预处理
18、的要求可以粗放些品预处理的要求可以粗放些 测定药物及代谢物测定药物及代谢物要求使代谢物从缀合物中要求使代谢物从缀合物中释放出来并在不同释放出来并在不同pH介质中分离获得酸性、中介质中分离获得酸性、中性或碱性代谢物，对样品预处理的要求全面、细性或碱性代谢物，对样品预处理的要求全面、细致致 1.分析方法特点分析方法特点(是否专属、是否具有分离能是否专属、是否具有分离能力力) 2.检测系统对杂质污染的耐受程度检测系统对杂质污染的耐受程度 决定样决定样品预处理和需要净化的程度品预处理和需要净化的程度三、生物样品的预处理与制备技术三、生物样品的预处理与制备技术 应用应用微量元素测定微量元素测定 方方法法
19、 1湿法破坏湿法破坏 2干法破坏干法破坏 3氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法 常用试剂常用试剂硝酸或硝酸硝酸或硝酸-高氯酸高氯酸 特点特点破坏能力强、反应激烈，无机破坏能力强、反应激烈，无机 金属离子为高价态金属离子为高价态 应用应用适用于血、尿、组织等生物样适用于血、尿、组织等生物样 品的破坏品的破坏 缺点缺点含氮杂环药物的破坏不够完全含氮杂环药物的破坏不够完全 注意注意切勿蒸干、以免爆炸切勿蒸干、以免爆炸 样品用量样品用量金属元素量金属元素量10100 g，血样，血样 1015ml、尿样、尿样50ml 2、干法破坏、干法破坏 高温炉高温破坏高温炉高温破坏 应用应用适合人发样品的破坏适合人发样品的破坏特
20、点特点操作简单、快速、设备简单操作简单、快速、设备简单 应应用用血浆、人发中卤素、硫、硒血浆、人发中卤素、硫、硒等 血浆：血浆血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上分次点于无灰滤纸上 60烘干烘干按规定折叠后固定按规定折叠后固定 人发：洗净、干燥（人发：洗净、干燥（60 80） 剪碎剪碎称取称取0.1 0.3g置无灰滤纸中心置无灰滤纸中心按规定折叠按规定折叠固定固定 非破坏性生物样品预处理的第一步非破坏性生物样品预处理的第一步 可使结合型药物释放可使结合型药物释放 1.去除蛋白后取上清液直接分析测定去除蛋白后取上清液直接分析测定 2.去除蛋白后取上清液经进一步分离去除蛋白后取上清液经进一步分离 纯
21、化、浓集后分析测定纯化、浓集后分析测定 1. 加入与水混溶的有机溶剂加入与水混溶的有机溶剂蛋白质脱水沉淀蛋白质脱水沉淀 2. 加入中性盐加入中性盐“盐析盐析”沉淀蛋白质沉淀蛋白质 3. 加入强酸加入强酸与蛋白质阳离子与蛋白质阳离子(铵基铵基) 形成不溶性盐形成不溶性盐沉淀沉淀4. 加入重金属盐加入重金属盐与蛋白质阴离子与蛋白质阴离子 (羧基羧基)形成不溶形成不溶性盐沉淀性盐沉淀 5. 超滤法超滤法半透膜滤除可溶性生物大分子物质半透膜滤除可溶性生物大分子物质(蛋蛋白质白质) 6. 酶水解法酶水解法蛋白分解酶分解蛋白质蛋白分解酶分解蛋白质 7. 加热法加热法蛋白质变性凝固蛋白质变性凝固 常用有机溶
22、剂常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃 血样与溶剂体积比血样与溶剂体积比1 (13)可除去可除去90%以上蛋白以上蛋白 乙腈乙腈块状絮凝物、易于分离；成分损失块状絮凝物、易于分离；成分损失 可能性大，可能性大，上清液上清液pH为为8.59.5 甲醇甲醇细小颗粒沉淀、不易分离；成分损失可能性小，细小颗粒沉淀、不易分离；成分损失可能性小，上清液上清液pH为为8.59.5 超速离心分离（超速离心分离（12000r/min)离心离心12min 常用中性盐常用中性盐饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等橼酸盐等 试剂用量试剂用量血清
23、与饱和硫酸铵比例为血清与饱和硫酸铵比例为1 2时除去时除去90%以上的蛋白质分离以上的蛋白质分离高速高速(12000r/min)离心上清液离心上清液pH7.07.7常用的强酸常用的强酸10%三氯醋酸、三氯醋酸、6%高氯酸、高氯酸、5%偏磷酸等偏磷酸等 试剂用量试剂用量血清与强酸比例为血清与强酸比例为1 0.6时，除去时，除去90%以上的蛋白质以上的蛋白质分离分离高速高速(12000r/min)离心离心12min ，上清液，上清液pH 04 过量三氯醋酸过量三氯醋酸煮沸分解为氯仿和二氧化碳煮沸分解为氯仿和二氧化碳 高氯酸高氯酸碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中和后加乙醇使产生高碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠
24、等中和后加乙醇使产生高 氯酸钾（钠）沉淀氯酸钾（钠）沉淀当溶液当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀 常用沉淀剂常用沉淀剂CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH 血清与沉淀剂比例血清与沉淀剂比例1 (13)， 分离分离高速高速(10000r/min)离心离心 ，上清液，上清液pH分别为分别为5.77.3和和6.57.5 性质性质以多孔性半透膜以多孔性半透膜(超滤膜超滤膜)作为分离介质的一种膜作为分离介质的一种膜分离技术；分离技术； 特点特点无需加热；无需添加化学试
25、剂；无相变化；无无需加热；无需添加化学试剂；无相变化；无破坏性破坏性 应用应用游离药物首选方法游离药物首选方法 操作操作分子量截留值在分子量截留值在5万左右的超滤膜过滤可将分子万左右的超滤膜过滤可将分子量大的血浆蛋白以及结合了的药物的血浆蛋白分离量大的血浆蛋白以及结合了的药物的血浆蛋白分离 加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用滤或离心，取上清液供萃取用 最常用的酶最常用的酶蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在较宽的蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在较宽的pH范围范围(pH7.011.0)内使蛋白的肽键降解，在内使蛋白的肽键降解
26、，在5060具有最大活力具有最大活力 测定对热稳定性好的组分时，可采用加热测定对热稳定性好的组分时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀的方法将一些热变性蛋白沉淀 加热温度视欲测组分的热稳定性而定，通加热温度视欲测组分的热稳定性而定，通常可加热到常可加热到90；蛋白沉淀后可用离心或；蛋白沉淀后可用离心或过滤除去过滤除去 优点优点方法最简单方法最简单 缺点缺点只能除去热变性蛋白只能除去热变性蛋白 溶剂选择溶剂选择 合适的溶剂是成功的主要条件合适的溶剂是成功的主要条件了解药物与溶剂的化学结构及其性质了解药物与溶剂的化学结构及其性质相似相溶的原则相似相溶的原则 对药物未电离分子可溶，电离形式对药物未
27、电离分子可溶，电离形式 分子不溶分子不溶 沸点低、易挥散，毒性小与水不相沸点低、易挥散，毒性小与水不相 混溶混溶 不影响紫外检测不影响紫外检测具有较高的化学稳定性和惰性具有较高的化学稳定性和惰性 有机溶剂萃取次数有机溶剂萃取次数 通常为通常为1次，必要时次，必要时23次次 有机溶剂每次用量有机溶剂每次用量与水相体积比通常为与水相体积比通常为1:1或或25:1 通过萃取回收率确定最佳萃取次数与每次的溶剂用量通过萃取回收率确定最佳萃取次数与每次的溶剂用量 水相水相pH值值: 由药物的由药物的pKa确定确定 碱性药物最佳碱性药物最佳pH值高于值高于pKa值值12个个pH单位单位 酸性药物最佳酸性药物
28、最佳pH值：低于值：低于pKa值值12个个 pH单位一般规则：碱性药物在碱性单位一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性值、酸性药物在酸性药物在酸性pH值介质中提取值介质中提取 生物样品宜在碱性或近中性提取，生物基质中内生物样品宜在碱性或近中性提取，生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取 。 空白血清在空白血清在pH2、pH7和和pH13缓冲液中乙醚提取，缓冲液中乙醚提取，提取液用提取液用RP-HPLC(UV)测定，碱性药物在测定，碱性药物在pH13下提取液杂质峰少下提取液杂质峰少 提取技术：提取技术： 提取次数：提取时通常不采用反复提取的方法，多半进行一
29、次（至多二次）提取，在改变pH后，从有机相回提至水相也只进行一次。 内标的加入：为避免进样时带来的误差，多采用提取前加入等量内标，以待测组分峰高（或峰面积）与内标峰高（或峰面积）之比对浓度作标准曲线。这样，即使在一系列操作过程中有微量损失，对比值影响也较小。 混合：可在密塞情况下将试管平置于振荡器内振荡，振荡时间与强度视情况而定。可采用以“药物转入溶剂中量”与“混合时间”作图法，选取理想和符合实际的提取方式和时间。 提取溶剂的蒸发：常用真空蒸发（注意暴沸）或吹氮气流使溶剂挥散。 原理原理 将不同填料作为固定相装入微型小柱，将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受
30、到吸当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。再用适当溶剂洗脱药物。 固相的选择原则：固相与被测组分应具有相似的固相的选择原则：固相与被测组分应具有相似的极性极性 亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合相硅胶）亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合相硅胶） 亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维） 离子交换型离子交换型实验步骤实验步骤 第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料
31、 第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱 除去除去残留的甲醇残留的甲醇 第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液 第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱， 去除内源性杂质去除内源性杂质 第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物， 收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直进行在线分析收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直进行在线分析第四节 样品的玷污与损失一、样品沾污：一、样品沾污：（一）增塑剂（一）增塑剂(Plasticizers)：测定发现某些塑料血样采集管含有3-(2-丁羟
32、乙基)磷酸酯等，可使溶剂提取步骤中药物分配系数变化、方法变异系数增大（从5%增至20%）。 （二）脂肪酸及酯类（二）脂肪酸及酯类：血样中浓度约为350g/ml（10-3mol/L），较待测药物高102103倍以上,易被提入。常出现在色谱图中。（三）溶剂中杂质（三）溶剂中杂质：由于溶剂体积其它试剂为大，即使原来杂质浓度较低，浓集时或通过色谱柱时，浓度显著增大而干扰测定。更严重的是干扰物在每批溶剂或试剂中有所不同，而影响不同实验室间、各分析人员间的实验结果。解决办法是采用高纯度溶剂（价贵）、有时在使用前重新应用全玻璃仪器重蒸馏。其次是采用专属的检测方法。（四）化学衍生化带来的杂质（四）化学衍生化带
33、来的杂质：由于试剂未经纯化致使色谱分析中往往呈现额外的杂质峰。（五）实验环境和器皿、材料的污染（五）实验环境和器皿、材料的污染：实验室的去污剂、润滑油、滤纸、玻璃器皿不够洁净，蒸馏水纯度不够等。 二、导致待测物损失的因素：二、导致待测物损失的因素： （一）吸附与共沉淀（一）吸附与共沉淀： 玻璃表面或橡胶塞会吸附药物，特别是脂肪胺类及含硫化合物。可采用硅烷化减少玻璃表面的吸附性，非极性提取溶剂中加入少量极性溶剂可减少器皿对药物的吸附。血样中红血球和纤维蛋白元凝块的形成，常能引起待测物的共沉淀。所以宜将全血样品加入缓冲液后再行提取。这样血球散开，药物可从血球表面解吸，以减少共沉淀的损失。缓冲液的一
34、定离子强度，可蛋白质变性时形成疏松的絮状物，这样可减少药物的物理性滞留和共沉淀的损失。（二）化学降解（二）化学降解： 药物的化学和生物学不稳定性常引起化学分解；光化学及热稳定性（尤其在净化步骤中强酸、强碱的中和所产生的热）引起的损失，也应加注意。应尽量采用温和条件制备样品，经免引起药物的部分分解、开环等情况发生，有的药物尚需避光操作。（三）衍生化反应（三）衍生化反应： 由于不完全反应，待测药物仅部分转化为所需的产物或形成副产物。有时在蒸发除去过量衍生化试剂时，使得衍生物与溶剂形成共沸混合物而导致损失。（四）络合（四）络合： 某些药物会与重金属离子络合或与内源必性大分子相互作用，这种情况虽较少遇
35、到，但往往是某些样品制备中药物损失的一个因素。（五）蒸发（五）蒸发： 有的是药物本身的挥发性（如苯丙胺）或因蒸发所得残渣未能完全溶于所加的小体积溶剂中；或因减压浓缩引起溶液暴沸而导致损失；或在吹氮过程中使药物以气溶胶形式逸出。第五节 体内药物分析常用分析方法一、常用分析方法的特点一、常用分析方法的特点分析方法分析方法 检测限度检测限度/10-9g 特异性特异性/分离能力分离能力紫外分光光度法（紫外分光光度法（UV） 100 荧光分光光度法（荧光分光光度法（Fluor） 1 原子吸收光度法（原子吸收光度法（AA） 1 +薄层扫描法（薄层扫描法（TLSC） 紫外检测器（紫外检测器（UV） 10 +
36、 荧光检测器（荧光检测器（Fluor） 1 +气相色谱法（气相色谱法（GC） 氢火焰离子化检测器（氢火焰离子化检测器（FID） 110 + 氮磷检测器（氮磷检测器（N-PD） 0.10.01 + 电子捕获检测器（电子捕获检测器（ECD） 0.01 + 质量碎片选择离子检测器（质量碎片选择离子检测器（MS） 0.01 +高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC） 紫外检测器（紫外检测器（UV） 1 + 荧光检测器（荧光检测器（Fluor） 0.1 + 电化学检测器（电化学检测器（ECD） 0.010.001 +免疫法（免疫法（IA）放射免疫法（放射免疫法（RIA） 0.01 + 酶免疫法（酶免疫
37、法（EIA） 0.01 + 荧光免疫法（荧光免疫法（FIA） 0.01 +二、分析方法的设计依据及建立分析检测二、分析方法的设计依据及建立分析检测方法的主要依据方法的主要依据 待测药物的理化性质及体内存在状况待测药物的理化性质及体内存在状况 分析测定的目的与要求分析测定的目的与要求 生物样品的类型与样品制备方法生物样品的类型与样品制备方法 实验室条件实验室条件 1、待测药物的理化性质、待测药物的理化性质 萃取方法和萃取条件的选择萃取方法和萃取条件的选择 亲脂性亲脂性 、药物的、药物的pKa值值 、水和有机溶剂中的溶水和有机溶剂中的溶解度及分配系数解度及分配系数 亲脂性亲脂性在适当的在适当的pH
38、值下用有机溶剂萃取值下用有机溶剂萃取 强极性或亲水性强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、离子沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃对萃 取或衍生化后萃取等取或衍生化后萃取等 挥发性挥发性极性小有机溶剂萃取极性小有机溶剂萃取 药物稳定性药物稳定性萃取浓缩技术萃取浓缩技术 对酸碱不稳定对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定对热不稳定避免高温蒸发溶剂避免高温蒸发溶剂 对光不稳定对光不稳定 避光操作避光操作2、待测药物的体内存在状态、待测药物的体内存在状态 与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低低 分离萃取方法分离萃取方法 蛋白结合较强不宜直接采用溶剂
39、萃取蛋白结合较强不宜直接采用溶剂萃取 体内浓度高低、代谢过程及其代谢产体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物物 分析检测技术分析检测技术3、分析测定的目的与要求、分析测定的目的与要求（1）药代动力学研究药代动力学研究 要求要求同时测定原形药物和代谢产物同时测定原形药物和代谢产物 检测检测宽线性范围宽线性范围(CmaxCmax的的1/20)、 高灵敏度高灵敏度(10-9g/ml)和高专属性和高专属性 方法方法不必强调方法的简便、快速；不必强调方法的简便、快速； 重点考虑测定浓度范围较宽重点考虑测定浓度范围较宽多采用多采用HPLC、GC-MS 、LC-MS（2）临床治疗药物监测）临床治疗药物监测 测定
40、有效治疗浓度范围内药物浓度测定有效治疗浓度范围内药物浓度 分析方法尽量简便易行、快速，适用于长期、批分析方法尽量简便易行、快速，适用于长期、批量样量样 大多采用大多采用UV、RIA或或EIA等等（3）中毒患者的临床抢救）中毒患者的临床抢救 药物浓度极高不必强调方法的灵敏度，药物浓度极高不必强调方法的灵敏度， 特别强调方法特异性，速度快特别强调方法特异性，速度快 大多采用大多采用GC、GC-MS、RIA或或EIA4、样品类型与预处理方法与分析方法相关、样品类型与预处理方法与分析方法相关 以血浆或血清为分析样品，采用蛋白沉淀以血浆或血清为分析样品，采用蛋白沉淀-溶剂萃溶剂萃取预处理技术，样品取预处
41、理技术，样品 较为较为“干净干净”，可用，可用HPLC检测检测 RIA分析分析 样品的预处理方法可较为粗放，经简单样品的预处理方法可较为粗放，经简单 蛋白沉淀或不经预处理直接测定蛋白沉淀或不经预处理直接测定5、实验室条件、实验室条件 实验室现有的或有可能在其它实验室使用的实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。仪器装备，合理选择可行的分析方法。三、分析方法建立的一般步骤三、分析方法建立的一般步骤 步骤：第一步：检测条件的筛选 第二步：分离条件的筛选检测条件：以待测药物对照品照拟定的分析方法（预处理除外）测定。根据测定结果确定最佳分析检测条件 例：HPLC 检测器
42、、色谱柱、流动相、柱温、 内标;使具有足够的方法灵敏度、良好 的色谱参数(n、R、T)、适当保留时间(tR）分离条件： 在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰 以对照品确定的检测条件确认是否适用于实际生物样品体内药物分析方法应用示例体内药物分析方法应用示例 第三代喹诺酮类广谱抗菌药第三代喹诺酮类广谱抗菌药 盐酸环丙沙星片人体生物等效性研究盐酸环丙沙星片人体生物等效性研究一、文献调研一、文献调研 理化性质理化性质在水中溶解，在甲醇中微溶，在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中几乎不溶，在在乙醇中极微溶解，在氯仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶
43、；环丙沙星游离体在水氢氧化钠试液中易溶；环丙沙星游离体在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在中不溶，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。稀醋酸中溶解。 药动学参数药动学参数 吸收过程吸收过程空腹口服后吸收迅速、人体生物利空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度约用度约 为为49%70% Cmax 口服口服500mg后后平均平均Cmax2.42.6mg/L Tmax 12h T1/2 血中血中T1/2约为约为4h，肾功能减退时延长，肾功能减退时延长至至6h 蛋白结合率蛋白结合率20%40% 代谢代谢口服给药口服给药24h内，内，40%50%原形、原形、15% 以代谢物经肾排出以代谢物经肾排
44、出 体内分析方法体内分析方法 RP-HPLC 色谱柱色谱柱ODS色谱柱色谱柱 流动相流动相甲醇甲醇(乙腈乙腈)-磷酸磷酸(枸橼酸枸橼酸) 缓冲液缓冲液(三三乙胺调节乙胺调节pH2.33.5) 检测检测紫外或荧光检测紫外或荧光检测 生物样品预处理方法生物样品预处理方法 蛋白沉淀法蛋白沉淀法甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋 白后直接进样白后直接进样 溶剂萃取法溶剂萃取法二氯甲烷二氯甲烷-异丙醇、异丙醇、 氯仿氯仿-异丙醇混合溶剂提取异丙醇混合溶剂提取 蛋白沉淀蛋白沉淀-溶剂萃取法溶剂萃取法乙腈沉淀蛋白后乙腈沉淀蛋白后 二氯甲烷二氯甲烷-异丙醇提取异丙醇提取分析方法设计分析方法设计1
45、分离检测方法分离检测方法 本试验为生物等效性研究本试验为生物等效性研究 测定血浆中环测定血浆中环丙沙星原形药物的血药浓度丙沙星原形药物的血药浓度-时间曲线。时间曲线。 初步拟定：采用初步拟定：采用RP-HPLC法法 紫外或荧光检测紫外或荧光检测紫外紫外灵敏度灵敏度1ng，若取血浆，若取血浆0.5ml，采用，采用3倍量乙腈沉淀倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液蛋白，取上清液100 l进样，则要求血浆中环丙沙星浓度在进样，则要求血浆中环丙沙星浓度在50ng/ml（0.05ng/ l 1ng/20 l）以上，当）以上，当Cmax在在2 g/ml以上以上时基本可满足生物等效性研究要求时基本可满足生物等效性研究
46、要求 荧光荧光灵敏度灵敏度0.1ng，能满足本试验要求，能满足本试验要求 2生物样品预处理方法生物样品预处理方法 初步拟定初步拟定采用乙腈沉淀蛋白后取上清液直采用乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进样接进样 ，色谱峰理论板数、对称性下降，色谱峰理论板数、对称性下降(前沿前沿峰峰)，进而导致检测灵敏度降低，进而导致检测灵敏度降低 经进一步试验确定为：经进一步试验确定为： 血浆血浆0.5ml乙腈乙腈1ml沉沉淀蛋白淀蛋白二氯甲烷二氯甲烷-异丙醇异丙醇(95:5)5ml萃取萃取 60氮气流吹干氮气流吹干流动相流动相200 l溶解溶解20 l进样进样 3、分析方法验证、分析方法验证 （1）方法特异性）方法特异性 （2）标准曲线与线性范围）标准曲线与线性范围 （3）方法精密度与准确度）方法精密度与准确度 （4）方法定量下限（5）样品的稳定性
