1、一、色谱起源一、色谱起源石油石油醚醚碳酸碳酸钙颗钙颗粒粒色素色素色色谱谱组组分分1906 年俄国植物学家年俄国植物学家Tsweet 发现色发现色谱分离现象谱分离现象2高效液相色谱仪的分析原理 高效液相色谱仪的结构 色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱1 Basic principle of chromatographic separation1.1 色谱分离基本原理色谱分离基本原理Partition coefficient K分配系数硅胶颗粒基质合成步骤： 1.合成硅胶基质 2.键合配体(键合相) 3.端基封尾 end-capped以传统方式制造硅胶色
2、谱填料的过程以传统方式制造硅胶色谱填料的过程: 起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱），即起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱），即A类硅胶类硅胶90年代以后方式：年代以后方式：organosilica polymer 有机有机单晶硅聚合的硅胶，即单晶硅聚合的硅胶，即B类硅胶类硅胶填料的端基封尾封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1% -1%）C18键合并端基封尾后还能看见什么？硅羟基!即使进行高密度键合，硅胶表面仍将残留约50%硅羟基(SiOH)!单、双、三官能团键合三官能团键合二官能团键合单官能团键合 键合常用封尾end-capped ：三甲基硅氧烷极性封尾，增加极性保留Hypersil
3、 ODS即没有封尾Hypersil ODS-2有封尾由于空间位阻的存在，键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保留，导致峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三甲基氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减小这种影响，这种操作被称为封尾，封端，封口。 封尾封尾 空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷空间位阻极性嵌入 polar embedded 问题：下列色谱柱如何选择？amidohexadecylsilyl silica gelColumn: size : l = 0.25 m, = 4.6 mm; stationary phase: diisoprop
4、ylcyanopropylsilyl silica gel for chromatography R (5 m) with a specific surface area of 180 m2/g and a pore size of 8 nm; stationary phase: spherical octadecylsilyl silica gel for chromatography R (5 m) with a specific surface area of 170 m2/g and a pore size of 12 nm. stationary phase: aminopropyl
5、silyl silica gel for chromatography R (5 m), stationary phase: end-capped octadecylsilyl silica gel for chromatography R (5 m), stationary phase: base-deactivated octadecylsilyl silica gel for chromatography R (3 m). stationary phase: octylsilyl base-deactivated silica gel for chromatography R (4 m)
6、 with a pore size of 6 nm, stationary phase: end-capped polar-embedded octadecylsilyl amorphous organosilica polymer R (5 m); Mobile phaseMix 35 volumes of acetonitrile R and 65 volumes of a 5.23 g/l solution of dipotassium hydrogen phosphate R previously adjusted to pH 7.0 with phosphoric acid R.（答
7、案见备注信息）以传统方式制造以传统方式制造硅胶（硅胶（A类硅胶）色类硅胶）色谱填料的过程谱填料的过程: 起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱）起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱）Na2SiO3 (矿物矿物) + 2H+Si(OH)4 (silicic acid)+ 2Na+硅胶颗粒硅胶颗粒(含金属杂质含金属杂质!)C18/C8 bonding + endcappingC18/C8 Reversed Phases(最终仍带金属杂质最终仍带金属杂质!) 与键合相的疏水性作用与键合相的疏水性作用双重保留机理双重保留机理:1). 与键合相的的疏水性作与键合相的的疏水性作用用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作
8、用与残余硅醇基间的离子交换作用O-SiO-SiO- O-SiO-SiO- O-SiO- O-SiO-SiO-SiO- O-SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+当流动相pH值小于3时, 硅醇基呈中性(未解离) BaseBase对碱性化合对碱性化合物的保留及物的保留及严重拖尾严重拖尾两实验使用相同的传统两实验使用相同的传统C8硅胶柱硅胶柱离子交换作用离子交换作用碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理当流动相为 pH6-8时, 硅醇基带负电性(大部解离)既然既然pH 55
9、 MRM 75 58 4.02 Acrylamide-C13 Acrylamide 4.02 色谱柱：Atlantis dC18色谱柱5m，2.1150m m流动相：0.1%甲酸+甲醇=98+2流速：0.2mL/min进样体积：20ml数据来源：北京CDC条件色谱柱： AtlantisTM dC18 4.6 x 150 mm, 5 m 流动相 A: 0.1% TFA 水溶液流动相 B: 0.1% TFA 乙腈溶液流速: 1.4 mL/min梯度:时间 梯度组成(min)%A %B 0.0100 0 5.0 97 3 6.0 85 15 10.0 80 20 12.0 0 100 25.0 0
10、100进样体积: 10.0 L温度: 30 oC检测: UV 268 nm仪器: AllianceTM 2695, 2996 PDA极性与非极性化合物保留的完美平衡极性与非极性化合物保留的完美平衡化合物：浓度(g/mL)1. L-抗坏血酸(VC)19.62. 烟酸 (niacin) 9.83.硫胺(VB1)19.64. 吡哆醛39.25.吡哆醇(VB6)39.26. 叶酸 (VB11)23.57. 咖啡因 9.88. 核黄素 (VB2) 3.99. 视黄醇(VA)19.610. 生育酚 (VE)39.211. 麦角钙化甾醇(VD2) 9.8Grumbach, DiehlMinutes2.004
11、.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0012345876V0 = 1.37 min10911对于水溶性维生素的极佳保留对于脂溶性维生素不过度保留注：无需离注：无需离子对试剂！子对试剂！问题AQ柱有哪些不足之处？HILICHydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) 亲水作用液相色谱 RPLCHILIC其他HILC柱硅胶柱氨基柱丙基酰胺柱亲水键合硅胶柱（多羟基等）问题：为什么不考虑SCX或SAXHILIC柱特性HILIC 柱用于在AQ柱上依然无有效保留的场合分离机制为“反反
12、相色谱”技术HILIC 柱与C18柱上的出峰顺序刚好相反由于使用含高有机溶剂成分的流动相进行分离，在LC/MS应用中的检测灵敏度比AQ柱上显著提高 可直接将样品溶于纯有机溶剂中进样，省却了将样品溶剂蒸干再定容的麻烦。HILIC保留特性1、固定水，利用氢键作用2、离子交换作用 methanol ethanol propanol acetone三聚氰胺和三聚氰酸同时检测FDA推荐Zic-HILIC突破高纯硅胶突破高纯硅胶柱局限性的必要性柱局限性的必要性硅胶硅胶柱柱pHpH适用极限适用极限0102030400123456789101112kpH硅醇基解离,带负电荷硅醇基未解离碱性化合物具良好峰形 但
13、保留不足对碱性化合物的保留增强,但需严格控制流动相pH 值。封端不佳的反相柱会面临峰拖尾的问题。pH 10NortriptylineAmitriptylineMinutes0123Minutes0123pH 2硅醇基完全解离,硅胶硅胶基体逐步溶解！基体逐步溶解！碱性化合物呈中性，保留强,峰性佳。需要全新的柱技术需要全新的柱技术宽宽pH值色谱柱值色谱柱突破硅胶柱应用禁区的有力手段突破硅胶柱应用禁区的有力手段优点优点缺点缺点无机基质无机基质 (C18 硅胶硅胶) 机械强度高机械强度高 柱效高柱效高 保留稳定保留稳定 有限的pH应用范围 对碱性分析物拖尾 化学不稳定性有机基质有机基质(高聚物高聚物)
14、 很宽的很宽的pH应用范围应用范围 无离子型作用无离子型作用化学稳定性好化学稳定性好 机械强度不佳 柱效低 保留行为难以预测宽宽pH值色谱柱值色谱柱宽pH值色谱柱的几种类型双齿键合，Agilent四乙氧基硅烷四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧基硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷硅烷 (MPEOS)甲基三乙氧基硅烷甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)Waters 专利技术专利技术荣获荣获2000年全球年全球 R&D 100 大奖大奖杂化颗粒柱杂化颗粒柱(XTerra)的合的合成过程示意成过程示意Tetraethoxysilane(TEOS)Bis(triethoxysilyl)ethane(BTEE)+
15、4Polyethoxysilane(BPEOS)SiEtOEtOOEtEtOSiEtOEtOCH2EtOCH2SiOEtOEtOEtSiEtOOCH2CH2SiOSiEtOOEtSiOOOEtOSiOSiOEtOOOEtEtEtn在硅胶聚合物网络中嵌入的乙烷基桥键Anal. Chem. 2003, 75, 6781-6788U.S. Patent No. 6,686,035 B2第二代杂化颗粒技术第二代杂化颗粒技术高pH条件下柱稳定性的强化测试结果柱寿命比超纯硅胶柱提高十倍以上!pH对填料稳定性的影响对填料稳定性的影响 高高pH实验实验pH 8时时,许多许多C18硅胶基质过早地丧失柱效硅胶基质
16、过早地丧失柱效由于填料颗粒溶解由于填料颗粒溶解,色谱柱内产生空隙色谱柱内产生空隙随着键合相覆盖率的增加，色谱柱寿命延长随着键合相覆盖率的增加，色谱柱寿命延长 低低pH实验实验pH 2时时,许多许多C18硅胶基质过早地丧失柱效硅胶基质过早地丧失柱效由于键合相之水解作用由于键合相之水解作用,被测物丧失保留行为被测物丧失保留行为使用三官能团键合相可获得最佳的稳定性使用三官能团键合相可获得最佳的稳定性灵敏度与选择性的改变灵敏度与选择性的改变色谱柱色谱柱: XTerra RP18, 4.6.x 150 mm, 3.5 m检检 测测: 254 nm (相同进样量相同进样量)流动相流动相: 50% 乙腈乙腈
17、/40% 水水/10% 含含 100 mM CAPSO, pH 10流动相流动相: 30% 乙腈乙腈/60% 水水/10% 含含100 mM 磷酸钠磷酸钠, pH 2.0MinutespH 100.000.2524681012酮康唑酮康唑阿司咪唑阿司咪唑0酮康唑酮康唑阿司咪唑阿司咪唑AUpH 2色谱图重叠色谱图重叠pH 2 与与10：阿司咪唑与：阿司咪唑与 酮康唑分析酮康唑分析简化方法开发简化方法开发过程过程123456789101112pH中间中间 pH 硅胶柱硅胶柱低低 pH 硅胶柱硅胶柱高高 pH 聚合物基质柱聚合物基质柱宽宽 pH 范围范围 填料填料色谱柱色谱柱宽宽pH值色谱柱值色谱柱
18、之宽之宽pH范围范围(以一当三以一当三) 温度温度pH宽宽pH值色谱柱：值色谱柱：高温稳定性高温稳定性高温高温寿命试验寿命试验Peak Number USP Tailing Factor1. 多虑平1.22. 去甲替林1.13. 阿米替林1.14. 三甲丙咪嗪1.0AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU-0.020.48Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.001234123412341234AU0.000.26Minutes1.002.003.004.0
19、05.006.007.008.009.0010.00AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00第二十一天第二十一天第二天XTerra RP18普通硅胶普通硅胶C18 Conditions:Column: XTerra RP18, 5 m, 4.6 X 150 mmMobile Phase: 40% pH 7 ,10 mM Na2PO4, 60% ACNColumn Temp.: 60 CFlow Rate: 1.5 mL/minDetector: 254 nm三环抗抑郁药物分离三环抗抑郁药物分离宽宽pH值色谱柱值色谱
20、柱的优点的优点 为为方法开发提供了极其有效且方便的工具方法开发提供了极其有效且方便的工具宽宽pH范围范围良好色谱峰形良好色谱峰形高高稳定性稳定性Modern C18pH 1012USP TailingpH 2.5 (3.5)MeCN20 mM KH2PO4/pH 4.5MeCN10 mM CH3COONH4pH 7MeCN20 mM K2HPO4pH 10MeCN20 mM Na2B4O7pH 7MeOH20 mM K2HPO4XTerra1. Nicotine2. Nortriptyline3. Propranolol4. Methamphetamine5. Amphetamine6. Ib
21、uprofen7. Benzoic Acid8. Salicylic Acid1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 6 7 81.52.5基于杂化颗粒的基于杂化颗粒的XTerra RP18柱与普通柱与普通C18硅胶柱硅胶柱在分离酸性、碱性化合物时的拖尾因子比较在分离酸性、碱性化合物时的拖尾因子比较为何杂化颗粒柱可增强在高为何杂化颗粒柱可增强在高pH下的柱寿命下的柱寿命？ 硅胶快速溶解 严重的柱失效 柱寿命短暂Surface modified Silica Particles 因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速度
22、明显减缓 柱寿命大大延长XTerra Hybrid Particles普通硅胶柱普通硅胶柱基于杂化颗粒的基于杂化颗粒的Xterra 柱柱基质溶解度基质溶解度 (ppm)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12240-220-200-180-160-140-120-100- 80- 60- 40- 20- 0-pH基质溶解度曲线基质溶解度曲线传统硅胶柱适用范围传统硅胶柱适用范围pH 2-7 各种基质的液相柱在高各种基质的液相柱在高pH中溶解速率的比较中溶解速率的比较液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔，液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔，由此而造成色谱峰畸形、分叉。由此而造成色谱峰畸
23、形、分叉。现代超纯硅胶柱适用范围现代超纯硅胶柱适用范围pH 2-8宽宽pH值色谱柱值色谱柱适用范围适用范围pH 1-12宽宽pH值色谱柱对值色谱柱对创建稳定可靠的创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值分析方法的独特价值 Note: Column Particle,Temperature and % Organic Held Constant0.111010002468101214pHkAcetaminophenIbuprofenNortriptylineLidocaineDoxepinImipraminep-ToluamideMobile Phase: 35% MeCN, 65% 20 mM
24、 Buffer稳定保留区稳定保留区稳定保留区稳定保留区硅胶柱硅胶柱宽宽pH值色谱柱值色谱柱Dibucaine (局部麻醉药-碱性化合物)美国药典美国药典USP 28 上所推荐的色谱方法上所推荐的色谱方法淋洗剂: 1.2 g 十二烷基磺酸钠 (SDS), 0.2g 醋酸钠, 2.0 ml 三乙基胺溶于 300 ml 水中, 调pH 至 5.6，然后加700 ml甲醇3.9 x 300 mm L1 柱，要求 拖尾因子拖尾因子 1000 L分离在同一根色谱柱上进行分离在同一根色谱柱上进行!解决方案解决方案: 1. 在梯度表的每一个时间段中加入相应的补偿时间在梯度表的每一个时间段中加入相应的补偿时间
25、2. 在在Empower软件上软件上启动启动柱前体积柱前体积功能功能* 需指明哪个溶剂先加（如将甲醇加入水中还是水加入甲醇中？）需指明哪个溶剂先加（如将甲醇加入水中还是水加入甲醇中？）关于流动相关于流动相pH的提醒的提醒: 缓冲液的缓冲液的pH需在加入有机溶剂前调试！需在加入有机溶剂前调试！需要清楚地记录并遵循流动相的配制顺序需要清楚地记录并遵循流动相的配制顺序!60/40600400流动相的配制顺序流动相的配制顺序:您常常忽视的细节您常常忽视的细节pH0.111010002468101214保留因子保留因子 (k)酸酸(未离子化未离子化)中性化合物中性化合物碱碱 1碱碱 1+2(完全离子化完
26、全离子化)酸酸(完全离子化完全离子化)碱碱 2NA, B1B2(未离子化未离子化)B1NAB2pH 5.5pH6.0您的分析方法为何重现性不佳您的分析方法为何重现性不佳?流动相缓冲流动相缓冲pH值是否靠近分析物的值是否靠近分析物的pKa范围范围? 如图所示如图所示, 在靠近中性在靠近中性pH区间分析可离子化化合区间分析可离子化化合物时需要对流动相物时需要对流动相pH进行非常仔细的控制进行非常仔细的控制! 0.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH 5.01230.000.100.200.300.401.002.
27、003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH 5.4312pH 5.20.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00132pH 5.61320.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.001. p-Toluamide2. Lidocaine3. IbuprofenGrumbach, Diehl分析方法对分析方法对pH敏感度的测试敏感度的测试- 糟糕的结果糟糕的结果Column: XTerra RP18 4.6 x 1
28、00 mm, 5 mMobile Phase A: 20mM Ammonium Acetate (pH 5.0 to 5.8) or 20mM Ammonium Bicarbonate (pH 6.8 to 7.0)Mobile Phase B: ACNFlow Rate: 0.5 mL/minIsocratic Mobile Phase Composition: 40% A; 60% B Injection volume: 10LTemperature: 30oCDetection: UV 230 nmInstrument: AllianceTM 2690, 996 PDA0.000.100
29、.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH 7.03120.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH 6.83121. p-Toluamide2. Lidocaine3. IbuprofenGrumbach, Diehl132pH 5.81.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.000.000.100.200.300.40Column: XTerra RP18 4.6 x 100 mm, 5 mMobile Ph
30、ase A: 20mM Ammonium Acetate (pH 5.0 to 5.8) or 20mM Ammonium Bicarbonate (pH 6.8 to 7.0)Mobile Phase B: ACNFlow Rate: 0.5 mL/minIsocratic Mobile Phase Composition: 40% A; 60% B Injection volume: 10LTemperature: 30oCDetection: UV 230 nmInstrument: AllianceTM 2690, 996 PDA分析方法对分析方法对pH敏感度的测试敏感度的测试- 糟糕
31、的结果糟糕的结果分析方法对分析方法对pH敏感度的测试敏感度的测试- 优异的结果优异的结果杂化颗粒柱对创建稳定可靠的杂化颗粒柱对创建稳定可靠的HPLC分析分析方法的独特价值方法的独特价值 Note: Column Particle,Temperature and % Organic Held Constant0.111010002468101214pHkAcetaminophenIbuprofenNortriptylineLidocaineDoxepinImipraminep-ToluamideMobile Phase: 35% MeCN, 65% 20 mM Buffer稳定保留区稳定保留区稳
32、定保留区稳定保留区硅胶柱硅胶柱Xterra & X-Bridge 杂化颗粒柱杂化颗粒柱您在日常您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题分析工作中所面临的常见问题Peak TailingRetentionReproducibilityProductQualityPriceWatersPeak TailingRetentionReproducibility峰拖尾: 28%保留时间重现性不佳: 25%分离不佳: 24%柱寿命太短柱寿命太短 11%极性化合物保留不佳: 12%我的色谱柱寿命为何不长我的色谱柱寿命为何不长? 您是否有恰当的样品前处理手段您是否有恰当的样品前处理手段? 样品前处理样品前处
33、理 (净化和富集净化和富集)的好坏不仅影响分析结果的灵的好坏不仅影响分析结果的灵敏度和可靠性，而且直接影响色谱柱的寿命敏度和可靠性，而且直接影响色谱柱的寿命 您的色谱柱是否有适当的保护措施您的色谱柱是否有适当的保护措施? 在线过滤器在线过滤器 保护柱保护柱 您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件? 使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐 (如在中性如在中性或碱性或碱性pH区域使用区域使用高浓度缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐高浓度缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐) 柱温过高柱温过高 将色谱柱暴露在极端将色谱柱暴露在极端pH的流动相
34、中的流动相中 您在日常您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题分析工作中所面临的常见问题Peak TailingRetentionReproducibilityProductQualityPriceWatersPeak TailingRetentionReproducibility峰拖尾: 28%保留时间不重现: 25%分离不佳分离不佳: 24%柱寿命太短 11%极性化合物保留不佳: 12%()()1kk14NRs22+a-a=影响分离度的若干因素影响分离度的若干因素柱效柱效N 2, 2, R 40% 40%分离选择性分离选择性(方法开发归根结底是如何使得方法开发归根结底是如何使得a 1)
35、1)保留因子保留因子K最佳最佳=5如何在实践中调控如何在实践中调控 a a?这是方法开发的根本这是方法开发的根本!低低高高甲醇甲醇乙腈乙腈C18RP18C8RP8苯基苯基a a选择性选择性溶剂选择性溶剂选择性 常用溶剂常用溶剂:甲醇甲醇(MeOH)乙腈乙腈 (MeCN) 其他溶剂其他溶剂: 异丙醇异丙醇(IPA) 乙醇乙醇 (EtOH) THF (Tetrahydrofuran)使用不同溶剂，可以改变选择性和洗脱强度使用不同溶剂，可以改变选择性和洗脱强度反相色谱中选择性的调节工具反相色谱中选择性的调节工具色谱柱选择色谱柱选择 溶剂溶剂pH a a选择性选择性 1 不同类型不同类型 2 不同不同
36、键合键合相相 3 不同不同品牌品牌色谱柱选择反相色谱中选择性的调节工具反相色谱中选择性的调节工具色谱柱化学色谱柱化学 溶剂溶剂pH a a选择性选择性选择性与选择性与pH 仅影响带离子型官能团的待测物仅影响带离子型官能团的待测物 如：胺，羧酸及酚类等如：胺，羧酸及酚类等 pH不影响不能发生电离的中性物质的保留不影响不能发生电离的中性物质的保留 大多数药物含有一个或多个离子型官能团大多数药物含有一个或多个离子型官能团 pH变化引起的选择性变化最大变化引起的选择性变化最大pH带来的保留与选择性变化带来的保留与选择性变化 化合物从离子化状态变化到非离子化状态其保化合物从离子化状态变化到非离子化状态其
37、保留因子变化留因子变化10 到到 30倍倍 上述变化相当于有机溶剂的比例变化上述变化相当于有机溶剂的比例变化20% pH带来最显著的选择性变化带来最显著的选择性变化 pH是方法开发最强有力的选择性调节工具是方法开发最强有力的选择性调节工具 方法开发的基本思路方法开发的基本思路 哪一根色谱柱可以在低哪一根色谱柱可以在低PH下得到下得到: 所有杂质峰基线分离所有杂质峰基线分离? 所有杂质峰之峰形良好所有杂质峰之峰形良好? 主峰与杂质完全分离主峰与杂质完全分离(用用PDA或或MS确定峰纯度确定峰纯度)? 次要色谱峰足够的信噪比次要色谱峰足够的信噪比(S/N)? 如果答案是肯定的，则选择此色谱柱，并如
38、果答案是肯定的，则选择此色谱柱，并在此基础上进一步优化方法在此基础上进一步优化方法(有机相比例有机相比例) 如果答案是否定的，尝试使用高如果答案是否定的，尝试使用高pH分离条分离条件件90运行低pH快梯度：在选择性不同的所有色谱柱上确定等度分离条件在选择性不同的几根色谱柱上运行低pH等度分离实验药物破坏性实验产物(降解原料药)对上述结果满意吗?运行高pH快梯度： 硅胶基质色谱柱 pH 7 杂化基质色谱柱 pH10确定等度分离条件在选择性不同的几根色谱柱上运行高pH等度分离实验药物破坏性实验产物(降解原料药)对上述结果满意吗?选择色谱柱并优化等度方法选择色谱柱并优化等度方法是是是是否否其他选择：
39、其他选择：1. 考虑用甲醇替换乙腈2. 考虑采用更高的温度否否HPLC方法开发思路方法开发思路91频繁切换分析柱、流动相溶剂和缓冲液过于繁琐？频繁切换分析柱、流动相溶剂和缓冲液过于繁琐？自动方法开发系统（自动方法开发系统（AMDS system）可帮您解决问题）可帮您解决问题 ACBDSolvent Selector:Controlled via Contact ClosuresD3D2D1Mobile Phases:AH2OBMeCNCMeOHD1pH 3 NH4COOHD2pH 10 NH4HCO3D310% MeCN (valve wash)Total of 6 bottles can
40、be used for line D.3/6 column selectorNote: For full control via computer,upgrade to Empower software.探索性探索性HPLC方法开发方法开发 优化条件优化条件甲醇甲醇, 低低pH 乙腈乙腈, 低低pH 甲醇甲醇, 高高pH乙腈乙腈, 高高pH XTerra RP18 XTerra MS C18 XTerra Phenyl色谱条件色谱条件 色谱柱规格色谱柱规格 4.6 mm x 50 mm, 3.5 m mm 梯度洗脱梯度洗脱 0% to 80%, tg = 15 min MeOH 和和 MeCN
41、 pH 3 (甲酸铵缓冲液甲酸铵缓冲液) 或或 pH 9 (碳酸氢铵缓冲液碳酸氢铵缓冲液) 流速流速 = 2 mL/min 温度温度 = 30 oC Alliance HPLC 系统系统例例: 利尿剂利尿剂 分离极性相差很大的分离极性相差很大的9种物质种物质 用梯度方法考察用梯度方法考察pH、固定相，及流动相对分离的固定相，及流动相对分离的影响影响 选择最佳色谱条件，最终获得梯度分离结果选择最佳色谱条件，最终获得梯度分离结果梯度分离测试混合物：利尿剂梯度分离测试混合物：利尿剂 5 Benzthiazide (WA)NNHSOOClH2NO2SCH2SCH2C6H5 8 Bumetanide (
42、Z)NH(CH2)3CH3COOHC6H5OH2NO2S7 利尿酸利尿酸(Ethacrynic acid,A)CH2OCH2COOHClClCH3CH2CCO6 丙磺舒丙磺舒(Probenecid, A)COOH(CH3CH2CH2)2NO2S4 利尿磺胺利尿磺胺 (Furosemide, Z)COOHClH2NO2SNHCH2O2 氯噻酮氯噻酮 (Chlorthalidone, WA)NHOOHClSO2NH29 Canrenoic acid (A)HOOCOOH1 氨苯喋啶氨苯喋啶(Triamterene,B)NNNNNH2NH2C6H5NH23 Althiazide (WA)CH2SCH
43、2CHNHNHSOClH2NO2SCH2O利尿剂利尿剂: 使用乙腈的起始使用乙腈的起始梯度分离梯度分离pH 3.64 pH 9.0Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00124397568XTerraPhenyl0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerraRP1812358974612439,57680.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerraMSC180.001.002.003.004.005.006.007.00
44、8.009.0010.0012965,387XTerraMSC1843Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerraPhenyl4162,9, 8,750.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerraRP184126985,73Wagrowski, TranpH 3.64pH 9.0436,1,587,9XTerraPhenylMinutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.002Minutes0.002.004.006.008.0010.
45、0012.0014.00XTerraRP18123,458,9Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00123456,78,9XTerraPhenylMinutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0043,215,689,7XTerraMSC1842,16,3859,7XTerraRP18Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerraMSC18124567896,73Wagrowski,
46、 Tran利尿剂利尿剂: 使用甲醇的起始梯度分离使用甲醇的起始梯度分离两种条件下的分离结果考察两种条件下的分离结果考察 没有任何起始条件可以完全分离所有化合物没有任何起始条件可以完全分离所有化合物 pH带来最大的选择性变化带来最大的选择性变化 碱性碱性pH条件下色谱峰间隔较小条件下色谱峰间隔较小 酸性酸性pH条件下色谱峰的分离度较大条件下色谱峰的分离度较大利尿剂酸性利尿剂酸性pH条件下的起始梯度条件下的起始梯度分离比较分离比较:Wagrowski, Tran乙腈乙腈甲醇甲醇Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerraRP18123,456,7
47、8,9Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00123456,78,9XTerraPhenylMinutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010124397568XTerraPhenyl0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010XTerraRP181258974630.001.002.003.004.005.006.007.008.009.001012439,5768XTerraMSC18Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.001
48、4.00XTerraMSC18124567893甲醇体系：最终梯度优化结果甲醇体系：最终梯度优化结果色谱柱色谱柱: XTerra MSC18; 4.6 x 50mm 3.5 m. 柱温：柱温： 30C. 流速流速: 2.0 mL/min. 检测检测: 254nm. 进样体积进样体积: 20 l. 运行时间运行时间: 20 min. 流动相流动相: A: 100mM 甲酸铵甲酸铵 pH 3.64. B: 水水; C: 甲醇甲醇 样品浓度样品浓度: 20 g/mL0.015Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerraMSC18起始梯度起始梯度12
49、45678930.060Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.00123456789XTerraMSC18最终梯度分离结果最终梯度分离结果Time (min) %A %B %C010 90 0110 50 403 10 46 441010 46 441110 90 015 10 90 01)Triamterene2)Chlorthalidone3)Althiazide4)Furosamide5)Benzthiazide6)Probenecid7)Ethacrynic acid8)Bumetanide9)Canre
50、noic acidWagrowski, Tran利尿剂分离利尿剂分离 样品复杂：样品中含有样品复杂：样品中含有9种化合物种化合物 基于起始梯度实验的结果，优化了色谱柱类型，基于起始梯度实验的结果，优化了色谱柱类型，有机相比例及有机相比例及pH 平梯度获得最终满意分离结果平梯度获得最终满意分离结果pH 9.0条件下的溶剂选择性：条件下的溶剂选择性：等度分离条件探索等度分离条件探索Wagrowski, Tran3,5Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00129687XTe
