1、 n 定性分析 显微鉴别 理化鉴别 (试管) 薄层色谱 (HPTLC，TLC) 化学对照品对照药材 HPTLC与普通TLCA: HPTLC Silica gel 60（Merck）B:硅胶G预制板(青岛海洋化工厂) 展开剂展开剂: 氯仿-甲醇-水（15：5：1），10以下放置后的下层溶液显色显色: 10%硫酸：乙醇， 105加热约5分钟检视检视: 可见光和紫外光灯（366nm）样品：样品：1. 华重楼； 2. 华重楼；3.重楼皂苷I； 4. 重楼对照药材；5. 滇重楼；6. 滇重楼；7. 滇重楼ABn 定性分析 HPLC, HPLC-MS, HPLC-MS-MS GC, GC-MS 乌头类药材
2、的乌头类药材的HPLC分析分析乌头对照品乌头对照品生川乌生川乌 生川乌总生物碱成分HPLC-MS图n定量分析 分光光度法 薄层色谱法（TLC）薄层扫描法 气相色谱法（GC ） 高效液相色谱法（HPLC ）n检查重金属（砷，铅，汞等）农药残留（有机氯，有机磷和除虫菊酯等） 的质量标准的质量标准 我国中药材法定质量标准概况 中药材质量标准的研究制订n药品标准系根据药物来源、生产工艺及贮运过程中的各个环节所制定的、用以检测药品质量是否达到用药要求并衡量其质量是否稳定均一的技术规定。n由国家政府制定并颁布的药品标准即为国家药品标准，系国家站在公众立场为保证药品质量而规定的药品所必须达到的最基本的技术要
3、求。国家药品标准属于强制性标准。不能达到国家药品标准要求的药品，不得作为药品销售或使用。 中药材及制剂法定质量标准概况中药材及制剂法定质量标准概况n国家标准 中华人民共和国药典中国药典 中华人民共和国卫生部药品标准（部颁标 准） 国家食品药品监督管理局药品标准（局颁 标准）n地方标准 现行中药材及制剂法定质量标准 中华人民共和国药典中华人民共和国药典中国药典中国药典 中国药典是国家为保证药品质量所制订的法典，是药品生产、经营、使用，检验和监督管理部门共同遵循的法定依据，也是对外贸易和技术交流不可缺少的准绳。 在中国药典一部中，国家对常用药材编纂制定了统一的标准，并对其中共性要求在附录等部分给予
4、统一的规定。 自1953年第一版中国药典颁布以来，已连续8版收载中药材及制剂，在品种数量、检测方法的科学性、专属性及合理性等方面不断完善、发展。n 卫生部药品标准与局颁标准卫生部药品标准与局颁标准 n中华人民共和国卫生部药品标准中药材（简称部颁药材标准） n中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂n国家食品药品监管局进口药材标准 43种n 除中国药典收载的品种外，凡来源清楚，疗效确切，较多地区经营使用的中药材，本着“一名一物”原则，分期分批制订部标准，第一批收载了101种，汇编为中华人民共和国卫生部药品标准中药材(第一册)，于1991年12月10日颁布。n 2004年5月8日，国家食品药品监管
5、局印发了关于颁布儿茶等43种进口药材质量标准的通知（国食药监注2004144号），颁布了经国家食品药品监管局修（制）订的儿茶等43种进口药材的质量标准。n 局颁标准局颁标准 包括维药标准、蒙药标准、进口药材标准、新药标准等数种n 地方标准地方标准 指各省、自治区，直辖市使用的中药材，除中国药典 与部颁标准已收载的品种外，另行颁布的标准。如四川 省中药材标准、贵州省中药材标准、黑龙江省中 药材标准等。n 饮片按照国家或省、自治区、直辖市制定颁布的饮片 炮制规范炮制。制定药品质量标准的原则和基本程序原则原则n确保药品安全性与有效性n密切结合实验研究和生产实际的原则n严格统一与协调一致的原则（规范化
6、）n先进技术与经济合理相结合的原则制定药品质量标准的原则和基本程序基本程序基本程序n药品的命名n考察药品生产全过程：原料，纯度，中间体残留溶剂，温度，湿度光照n收集国内外相关资料n对药品质量考察中发现的问题进行科学实验n起草药品标准及起草说明 中药材质量标准内容简介中药材质量标准内容简介n基原：基原：中药材的来源。n性状：性状：为中药材的宏观特征,用语以现代科学术语为主 n鉴别：鉴别：经验鉴别、显微鉴别、一般理化鉴别、 色谱鉴别、光谱鉴别n检查：检查：包括杂质、水分、灰分、酸不溶性灰分、重金属、 砷盐、农药残留量、有关的毒性成分及其它必要 的检查项目。n浸出物：浸出物：主要针对目前尚无成熟的含
7、量测定方法或所测成 分含量低于万分之一的品种，常用的有醚浸出物、 醇浸出物和水浸出物的测定。n含量测定：含量测定：系指药材中某类成分或某一成分的含量测定（已知有效成分，毒性成分或能反映内在质量的指标成分）含量测定书写内容及顺序：药材粉碎程度、提取分离、供试液配置、测定方法、含量限度 重量法 指采用溶剂萃取或沉淀剂沉淀等方法，对药 材提取物进行适当的纯化后，进行称量的一种 测定方法。 容量法 指采用滴定的方法对药材中某类成分进行测 定的方法，常用于总生物碱、总有机酸等的含量 测定。 色谱法 包括薄层扫描法、高效液相色谱 法、气相色谱法、毛细管电泳色谱法等。光谱法 常用的为可见紫外分光光度法，主要
8、用于测定药材及制剂中的某类成分。中药制剂质量标准内容简介中药制剂质量标准内容简介n处方：处方：制剂组成n制法：制法：制剂的制备方法n性状：性状：制剂的宏观特征n鉴别：鉴别：理化鉴别、色谱鉴别、光谱鉴别n含量测定：含量测定：系指中药制剂中某类成分或某一成分的含量测定 测定方法同药材n功能与主治：n用法用量：n规格：n贮藏 ：中药材质量标准的研究制订中药材质量标准的研究制订n含量测定含量测定 对药物中的有效或指标成分及成分类别的质量评价进行的测定。 药效成分或成分类别 指标成分或成分类别 应选择专属性强、灵敏度高、重现性好，简便、经济的含量测定方法。中药质量标准中含量测定项要求中药质量标准中含量测
9、定项要求 分析方法的验证n 准确性 回收率试验n 精密度（重复性） 重复性试验n 检测限度 检出限n 定量限度 测定限n 线性和范围 线性范围n 专属性n 耐用性中药质量标准中含量测定项要求中药质量标准中含量测定项要求n回收率试验 考察测量值与真实值或认可的参考值之间的接近程度。 一般采用加样回收方法进行试验，样品中含有量与加入的纯品量应大致相当。 中药质量标准中含量测定项要求中药质量标准中含量测定项要求回收率计算测得量 - 样品中含量回收率% = X 100%加入量n同一样品，制备相同浓度的6份供试品（样品取样量减半，以1：1比例加入对照品）；n同一样品，制备3个浓度的供试品，每个浓度分别制
10、备3份供试液，对照品的加入方式又有以下三种方式：中药质量标准中含量测定项要求中药质量标准中含量测定项要求n取相同量样品9份（一般为样品取样量的一半），设计 3个浓度，按不同比例加入对照品。中间浓度一般按1：1比例加入，低、高浓度可选0.5：1，1.5：1的比例。加入的对照品的量要适当，保证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内n取3种不同量的样品各3份，每个取样量分别按1：1比例加入对照品，中间浓度应选定在正常测定浓度，其他两个浓度可以结合范围测定项目选择低、高浓度。n按标示量计算的组分，可参照化学药品测定方法，取9份样品，按0.8：1，1：1，1：1.2的比例加入对照（样品取样量减半）。
11、n测定数据的精度要求，一般应满足以下规定：回收率计算值在95105范围， 相对标准偏差（RSD%）薄层扫描法5%，高效液相色谱法/气相色谱法3%。n 精密度试验精密度试验 仪器精密度 薄层扫描法 同板精密度 异板精密度 n 重复性试验重复性试验 指在同样的操作条件下，在较短的时间间隔的精密度。一般取不少于5份样品，重复测定，以含量值计算RSD%。 n 重现性试验重现性试验 指不同试验室之间的精密度(用于合作研究或协作标定等)。中药质量标准中含量测定项要求中药质量标准中含量测定项要求重复性：重复性：以下几种方法可选择使用。测定数据的精度要求，一般应满足以下规定：相对标准偏差（RSD%）薄层扫描法
12、5%，高效液相色谱法/气相色谱法3%n测定同一浓度6份样品，计算含量平均值和RSD%n测定3个不同浓度9份样品（三个不同浓度，每个不同浓度分别制备3份供试品溶液），高低浓度可以结合线性范围测定项目考察设计。一般中间浓度为正常测定的样品浓度。计算9份样品的含量平均值和RSD% n线性关系考察线性关系考察 以分析方法的响应值对被分析物的浓度或含量作图，或用适当的统计方法评价两者是否呈线性关系，以及线性的程度。 * 至少要用5个浓度 * 线性关系的测试范围一般为正常分析量的25%-150% 中药质量标准中含量测定项要求中药质量标准中含量测定项要求n将苦参碱对照品稀释至20%、50%、100%、120
13、%、150%五个浓度，按上述色谱条件，分别精密吸取10l，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线n计算得回归方程：n苦参碱：y=2056508.06x+36389.72n r=0.9997。 n表明苦参碱在0.792-5.996g 范围内具有良好的线性关系。 n 专属性试验专属性试验 指可能存在的组分，如类似物、降解物、基质等存在时，对被分析物准确可靠测定的能力。 空白阴性对照 与参照物比较 保留时间 DAD吸收光谱等 对照物加入试验 中药质量标准中含量测定项要求中药质量标准中含量测定项要求n耐用性试验耐用性试验 * * 指试验参数发生一定范围的改变
14、时，测量保持不受影响的能力。 不同色谱柱比较 流动相组成比例变化比较(不同pH值) 不同柱温比较 不同检测波长的比较 中药质量标准中含量测定项要求中药质量标准中含量测定项要求 按中药材所含化合物的类别，选择适当溶剂进行提取。根据提取物的性质，选择适当的分离方法，如：正相或反相HPLC、CE等等，摸索出若干套最佳色谱条件，尽可能达到样品中的各化学成分被分离和检测到。 结合各分离组分的性质，选择合适的检测系统和手段，如：紫外、蒸发光散射、HPLC/MS、GC/MS等方法获取化学成分的数据。中药材质量评价中的指纹图谱方法中药材质量评价中的指纹图谱方法 指纹图谱是指采用一定的分析方法得到的中药化学物质
15、或生物物质的图谱，包括化学指纹图谱和生物指纹图谱。 用于中药质量控制的主要为化学指纹图谱，即采用一定的分析方法得到的能够标示该中药主要化学成分的图谱，简称指纹图谱。 中药材质量评价中的指纹图谱方法中药材质量评价中的指纹图谱方法 我国对黄芪、三七、黄芩等多种常用中药材的指纹图谱进行了系统研究，建立了指纹图谱检测标准，此方法对比较药材质量与鉴别物种具有较大的作用。 中药材质量评价中的指纹图谱方法中药材质量评价中的指纹图谱方法 黄芩黄芩HPLCHPLC图谱图谱12 12 黄芩苷黄芩苷 23 23 汉黄芩苷汉黄芩苷25 25 黄芩素黄芩素 26 26 汉黄芩素汉黄芩素 在中药材指纹图谱的相似性评价研究
16、技术和方法方面已取得了较大进展，开发了多种计算机指纹图谱相似度评价软件，使指纹图谱评价由最初的峰面积比值计算发展成为计算机模拟识别。 这不仅节约了大量的时间，而且使评价更加客观、科学。 中药材质量评价中的指纹图谱方法中药材质量评价中的指纹图谱方法 由于中药材大部分来源于生物体，其化学成分受产地、气候、生态环境、栽培、加工技术等影响很大。 选择“地道药材”或现代研究证明为优质的药材样品作为“中药材实物对照”，用于研究中药材质量的变化较为可行，且可以消除一些噪音和干扰，使对质量的评价更科学和合理。中药材质量评价中的指纹图谱方法中药材质量评价中的指纹图谱方法 品品 名名 所所 测测 成成 分分测定方
17、法测定方法含量限度含量限度 人人 参参人参皂甙人参皂甙Re，和人参皂甙，和人参皂甙Rg1的总量的总量 HPLC 0.25 人参叶人参叶人参皂甙人参皂甙Re，和人参皂甙，和人参皂甙Rg1的总量的总量 HPLC 2.25 儿儿 茶茶儿茶素和表儿茶素的总量儿茶素和表儿茶素的总量 HPLC 21.0 大大 黄黄大黄素和大黄酚的总量大黄素和大黄酚的总量 HPLC 0.5 吴茱黄吴茱黄吴茱萸碱和吴茱萸次碱的总量吴茱萸碱和吴茱萸次碱的总量 HPLC 0.20 厚厚 朴朴厚朴酚与和厚朴酚的总量厚朴酚与和厚朴酚的总量 HPLC 2.0 穿心莲穿心莲穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的总量穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的总量
18、 TLCS 0.80 蟾蟾 酥酥华蟾蜍次素与脂蟾毒配基的总量华蟾蜍次素与脂蟾毒配基的总量 HPLC 6.0 总量结合某一成分的含量测定是今后一段时间内中药材质量标准的发展方向。川乌、草乌、附子及炮制品品质鉴定川乌、草乌、附子及炮制品品质鉴定 研究目的 活性成分的分离制备及结构鉴定 草乌，川乌，附子及炮制品双酯，单酯型生 物碱成分的含量测定 草乌，川乌，附子及炮制品HPLCMS分析 生、制川乌的药效学和毒理学初步研究 小 结 川乌，草乌，附子为常用有毒中药，川乌和附子分别是毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)的干燥母根和子根，草乌是毛茛科植物北乌头 (Aconi
19、tum kusnezoffii Reichb.) 的干燥块根，具有回阳救逆、祛风除湿、温经止痛等功效，生品有大毒，其中所含的双酯型二萜生物碱乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等毒性很强，用药剂量与中毒剂量接近。 概概 述述概述概述 乌头乌头 Aconitum carmichaeli Debx Debx. . 川乌川乌概述概述 乌头乌头 Aconitum carmichaeli Debx Debx. . 川川乌乌附子附子概述概述 北乌头北乌头Aconitum kusnezoffii Reichb. 草乌草乌概述概述 北乌头北乌头Aconitum kusnezoffii Reichb.草乌草乌概述概述 乌
20、头乌头 Aconitum carmichaeli Debx Debx. . 川乌川乌白附片白附片 黑顺片黑顺片 盐附子盐附子 经炮制加工后双酯型生物碱可转化为单酯型生物碱,从而减小毒性。炮制过程中应严格控制双酯型生物碱的转化程度,防止炮制不完全,有毒成分含量偏高,用药不安全;或炮制太过,有效成分流失严重,影响疗效。建立专属的,可有效控制饮片质量的检测方法，一直是一项难度很大的课题 。OHH3COOCH3OHOBZH3COOHNCH3OOCH3OCH38H3COOCH3OHOBZH3COOHNCH3OOCH3OCH38 活性成分的提取分离和结构鉴定活性成分的提取分离和结构鉴定 Structure
21、OHH3COOCH3OHOBZH3COOHNCH3OOCH3OCH38 Mesaconitine （新乌头碱新乌头碱） Benzoylmesaconine (苯甲酰新乌头碱苯甲酰新乌头碱) OHH3COOCH3OHOBZH3COOHNCH3OHOCH38 Structure8H3COOCH3OHOBZH3COOHNCH3OHOCH3Hypaconitine（次乌头碱次乌头碱） H3COOCH3OHOBZH3COOHNCH3OOCH3OCH38Benzoylhypaconine(苯甲酰次乌头碱苯甲酰次乌头碱 ) 从制川乌中分离得到苯甲酰次乌头碱、苯甲酰新乌头碱2个单酯型生物碱,为制川乌炮制原理的
22、阐明，质量评价和质量控制奠定了基础。 乌头类药材的乌头类药材的HPLC定量分析定量分析n 在制川乌质量控制方面,国内外学者在生物碱含量测定方法上作了大量研究，高效液相色谱法测定生物碱成分，选择性较好，但目前报道的方法中多采用二乙胺或三乙胺为流动相，碱性较强，易破坏色谱柱固定相，且一般只测定双酯型乌头生物碱，而单酯型乌头生物碱测定及同时测定单、双酯型乌头生物碱的文献几乎没有报道。 乌头类药材的乌头类药材的HPLC定量分析定量分析HPLC色谱条件色谱条件 仪器: 岛津10AD,岛津2010/SPD-M, Waters 2690 色谱柱: DiamonsilTM C18 5m, 4.6 mmX250
23、 mm 流动相: 流动相A: 乙腈-四氢呋喃 流动相B: 0.1M 醋酸铵 梯度洗脱 流速：0.8 mLmin-1 检测波长：235nm 柱温：室温 乌头类药材的乌头类药材的HPLC定量分析定量分析乌头对照品乌头对照品生川乌生川乌 制川乌对照制川乌对照品品制川乌制川乌 生川乌生川乌制川乌制川乌 方法学考方法学考察察 线性范围的考察线性范围的考察 精密度试验精密度试验 稳定性试验稳定性试验 重复性试验重复性试验 加样回收率试验加样回收率试验 耐受性试验耐受性试验 流动相不同流动相不同pH对含量的影响对含量的影响 乌头碱 (aconitine ) Y=1.820106X-2.591105 0.32
24、-5.16 0.9999 Y=2.620106X-6.301103 0.01-0.36 0.9996 次乌头碱(hypaconitine） Y=1.791106X -5.409105 1.29-20.60 0.9999 Y=2.022106X -2.591105 0.05-1.32 0.9999 Y=1.366106 X+2.604102 0.01-1.06 0.9999 新乌头碱（mesaconitine） Y=1.832106 X-1.727105 0.22-3.59 0.9999 苯甲酰新乌头碱（Benzoylmesaconine） Y=1.110106X+2.374104 0.13-2
25、.04 0.9998 Y=1.033106X+1.326103 0.02-0.10 0.9997苯甲酰次乌头碱（benzoylhypaconine） Y=1.318106X+3.571104 0.15-2.41 0.9999 Y=1.613106X+1.127103 0.02-0.12 0.9996线性范围线性范围 精密度试验精密度试验 精密吸取同一供试品溶液 (四川江油1) 10 L，按上述色谱条件重复进样5次，测定峰面积积分值，结果生川乌中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积的RSD（n=5）分别为0.51%，0.18% 和0.21%，制川乌中苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱和次乌头碱峰面积的R
26、SD（n=5）分别为1.1%，1.5% 和0.32%。 重复性试验重复性试验 取同一批生川乌药材样品（四川江油1）5份，按供试品溶液制备方法操作，依上述测定条件分别进样10 L测定含量，结果乌头碱、次乌头碱、新乌头碱平均含量分别为0.011%，0.138%，0.024%， RSD分别为2.1%，1.1%和2.5%。同法测得制川乌中苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱和次乌头碱平均含量分别为0.050%，0.059%和0.016%，RSD分别为1.8%，2.5%和1.6%。 加样回收率试验加样回收率试验 精密称取已测知含量的生川乌药材样品（四川江油1）0.5 g，共9份，平均分为3组，分别精密加入乌头
27、碱、次乌头碱、新乌头碱混合对照品适量（分别约相当于样品中含量的50%，100%，150%），照供试品溶液制备方法操作，并按上述测定条件测定，每份进样2次，进样量10 L，计算回收率，结果低、中、高3个加入量的平均回收率（n=3）分别为新乌头碱112.2%（RSD=3.2%），106.3% (RSD=1.5%），103.5%（RSD=2.3%）；次乌头碱107.6%（RSD=3.3%），104.2%（RSD=1.5%），102.9%（RSD=1.9%）；乌头碱105.0%（RSD= 4.4%），104.9%（RSD=1.8%），新乌头碱100.4%（RSD=3.0%）。 精密称取已测知含量的制川
28、乌样品0.5 g，共5份，分别精密加入苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱混合对照品适量，同法测得制川乌中苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱的平均回收率（n=5）分别为104.1%（RSD=2.2%），100.8%（RSD=2.9%）。 耐受性试验耐受性试验 流动相不同流动相不同pH对含量的影响对含量的影响 由于乌头中所含生物碱成分结构不稳定，对酸碱较敏感，由于乌头中所含生物碱成分结构不稳定，对酸碱较敏感， 因此考察了流动相不同因此考察了流动相不同pH（5.50，5.75，6.00）对含量的影对含量的影 响，实验结果表明，流动相响，实验结果表明，流动相pH在在5.5-6.0范围内苯甲酰新头范围内苯甲酰新
29、头 碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、次乌头碱和乌头碱含量基本碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、次乌头碱和乌头碱含量基本 稳定。稳定。 稳定性试验稳定性试验 取同一供试品溶液 (四川江油1)，在0，4，8，14，20 h进样10 L测定，结果生川乌中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积的RSD分别为0.89%，0.94%， 0.71%；制川乌中苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱和次乌头碱峰面积的RSD分别为0.45%，0.50%，0.99%。表明供试品溶液在20 h内测得峰面积值基本不变。 乌头类药材的乌头类药材的HPLC定量分析定量分析对68个样品（川乌13个，制川乌17个，草乌9个，附子3个，附片9个，伪
30、品17个）药材样品：药材样品： 生川乌样品测定结果生川乌样品测定结果 (%, n=2)Results of Radix Aconiti samples determination来源（source）新乌头碱（mesaconitine）次乌头碱 (hypaconitine )乌头碱 (aconitine )四川江油1 四川江油2 四川江油3（四川江油市河西乡）陕西 河北 陕西汉中 陕西城固 0.030 0.094 0.0080.043 0.192 0.021 0.056 0.191 0.077 0.082 0.111 0.034 0.068 0.073 0.016 0.010 0.015 0.0
31、39 0.020 0.025 广西钦州四川雅安市汉源县大岭乡内蒙古霍林郭勒旗村木沟乡重庆巫山县建平乡贵州遵义金沙县团溪乡广西靖西市安德乡0.070 0.006 -0.0110.0580.121 0.099 -0.022 0.054 0.050 0.010 -1.060 -0.0060.029 质谱条件质谱条件 Waters Micromass ZQ-2000 高效液相色谱高效液相色谱-质谱系统质谱系统 电喷雾电离源正离子模式电喷雾电离源正离子模式 (ESI+) 毛细管电压：毛细管电压：3.20 kV ，锥孔电压，锥孔电压30V ，提取电压：，提取电压：4V，预六极杆电压：，预六极杆电压：0.5
32、 V 源温：源温：105，去溶剂温度，去溶剂温度150，去溶剂气流，去溶剂气流280Lh-1，锥孔气流，锥孔气流50 Lh-1川乌，草乌，附子及炮制品川乌，草乌，附子及炮制品HPLCMS分析分析 生川乌总生物碱成分HPLC-MS图 制川乌总生物碱成分HPLC-MS图草乌总生物碱成分HPLC-MS图附子总生物碱成分HPLC-MS图黑附片总生物碱成分HPLC-MS图白附片总生物碱成分HPLC-MS图 黄附片总生物碱成分HPLC-MS图 乌头类药材的乌头类药材的HPLC定量分析定量分析生川乌样品生川乌样品 乌头类药材的乌头类药材的HPLC定量分析定量分析草乌样品草乌样品乌头类药材的乌头类药材的HPLC定量分析定量分析附子样品附子样品乌头伪品样品乌头伪品样品
