1、1第二十二章第二十二章 免疫学检测技术免疫学检测技术2免疫学检测技术的基本原理 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素 体内：抗原+抗体免疫反应 体外：抗原+抗体进行检测 检测抗原或抗体的体外实验(血清学实验） 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 蛋白质芯片技术 免疫细胞功能的检测3第一节 体外抗原抗体反应的特点及影响因素（一）抗原抗体反应的特点 1. 高度特异性 2. 表面化学基团之间的可逆结合（可逆性） 3. 适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性） 4.抗原抗体反应的两个阶段 抗原抗体特异性结合阶段 可见反应阶段 41.1.高度特异性高度特异性抗原抗体反应物质基础是抗原表位(决定簇)与抗体CDR的
2、互补结合(相互吻合，具有互补性)。5抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合。通过抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合。通过非共价键非共价键结合。结合。2.2.表面化学基团之间的可逆结合（可逆性）表面化学基团之间的可逆结合（可逆性）6AbAgAbAg特异性特异性结合力的表示方法结合力的表示方法亲和力和亲合力亲和力和亲合力低亲合力高亲合力Ag-Ab结合的力结合的力亲和力亲和力亲合力亲合力低亲和力高亲和力73.3.适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性）适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性）8（二）抗原抗体反应的影响因素1.1.电解质电解质 0.85%0.85%氯化钠或各种缓冲液氯化钠或各种缓冲液2 2 . .
3、温度温度 3737 56 563 3 . .酸碱度酸碱度 最适最适pHpH值在值在6-86-8之间之间9第二节第二节 检测抗原或抗体的体外试验检测抗原或抗体的体外试验10定义：颗粒性抗原(细菌、细胞等或表面包被抗原的颗粒)与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团块现象。一、凝集反应（一、凝集反应（agglutination reactions)11包括：1.直接凝集反应 (direct agglunitation reatctions) 玻片法：ABO血型鉴定、细菌鉴定 试管法：抗体效价的判定2.间接凝集反应 (indirect agglunitation reactions
4、)12直接凝直接凝集反应集反应 1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16 玻片法玻片法试管法试管法ABO血型鉴定血型鉴定或菌种鉴定或菌种鉴定检测抗体检测抗体的的滴度或滴度或效价效价13 将可溶性将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进进行反应产生凝集，叫做间接凝集反应。行反应产生凝集，叫做间接凝集反应。间接凝集反应间接凝集反应14二、沉淀反应（二、沉淀反应（precipitation reactions）定义：可溶性抗原与相应抗体在适当电解质存在条件下结合，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。15可在
5、液体可在液体/ /半固体琼脂中进行。半固体琼脂中进行。包括： 1.单向琼脂扩散（可溶性抗原定量） 2.双向琼脂扩散 3.免疫电泳16AgAgAgAgAb in gel单向琼脂扩散用于确定用于确定抗原浓度抗原浓度17Ag1AbAg2Ag3Ag4双向免疫扩散鉴定多种抗原是完全相同、部鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同，抗原纯度分相同或完全不同，抗原纯度鉴定鉴定18免疫电泳 存在于不同区域的抗原存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。形成沉淀弧。 沉淀弧的数量、位置和沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性
6、质。析样品的成分及其性质。19 将抗原抗体反应与标记技术相结合，将已知的抗体或抗原标记上失踪物质，通过检测标记物，间接测定抗原-抗体复合物的一类试验方法。 三、免疫标记技术三、免疫标记技术(immunolabeling techniques)20常用的标记物： 酶 荧光素 放射性元素 胶体金 化学发光物质等21免疫酶测定法双抗体夹心法ELISA间接ELISAa）b）BASELISA 利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁22d）免疫组化技术定位、定性、定量检测定位、定性、定量检测23免疫荧光技术2425放射免疫测定 用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。用放射性核素标
7、记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的将同位素的敏感性敏感性与抗原抗体结合的与抗原抗体结合的特异性特异性结合起来，结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测。常用的有药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。化学发光免疫技术 将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。最常用的发光物质是新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺鲁米诺。 灵敏度高、简便、可实现自动化分析。灵敏度高、简便、可实现自动化分析。26免疫胶体金技术用胶体金颗粒标记用胶体金颗粒
8、标记Ab/Ag，以检测未知，以检测未知Ag/Ab的方法。的方法。氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。该技术可应用于该技术可应用于免疫组化免疫组化(光镜下检查光镜下检查)和和免疫层析免疫层析快速诊断。快速诊断。27免疫印迹法-Western blotting28四、蛋白质芯片技术又称为蛋白质微阵列，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵列。根据又称为蛋白质微阵列，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵列。根据蛋白质分子间特异性
9、结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。29第三节第三节 免疫细胞功能的检测免疫细胞功能的检测淋巴细胞及其淋巴细胞及其亚群的分离亚群的分离免疫细胞免疫细胞功能测定功能测定磁珠分离法磁珠分离法免疫吸附分离法免疫吸附分离法流式细胞术流式细胞术肽肽-MHC-MHC四聚体技术四聚体技术T T细胞功细胞功能测定能测定B B细胞功细胞功能测定能测定细胞因细胞因子检测子检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒细胞毒试验试验吞噬功吞噬功能测定能测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法
10、硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法30一、免疫细胞的分离外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离稀释血液淋巴细胞分离液(葡聚糖-泛影葡胺) 离心31E花环形成试验花环形成试验32磁珠分离法磁珠分离法免疫吸附分离法免疫吸附分离法流式细胞术流式细胞术肽肽MHCMHC四聚体技术四聚体技术淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离33免疫吸附分离法免疫吸附分离法加入淋巴加入淋巴细胞悬液细胞悬液anti-CD4anti-CD4anti-CD4弃上清弃上清34磁珠分离法磁珠分离法35流式细胞术流式细胞术荧光抗体标记混合细胞喷嘴单细胞悬液5000-10000个/秒细胞分选器荧光检测器36二、免
11、疫细胞功能的测定二、免疫细胞功能的测定T T细胞功细胞功能测定能测定B B细胞功细胞功能测定能测定细胞因细胞因子检测子检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒细胞毒试验试验吞噬功吞噬功能测定能测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法37T T细胞功细胞功能测定能测定T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测：形态计数法：形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁；3H-TdR或或125I-UdR掺
12、入法：掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。1. MTT (四甲基偶氮唑盐四甲基偶氮唑盐)比色法：比色法：外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染、免疫缺陷病、肿瘤患者免疫功能测定。38B B细胞功细胞功能测定能测定抗体含量测定溶血空斑试验可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。绵羊红细胞(SRBC)免疫动物4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中混匀在抗体形成细胞周围出现溶解的透明区，即溶血空斑。1个空斑区代表1个浆细胞通过记录溶血空斑的数目可知抗原特异性B细胞的数目加入新鲜补体，倒入平皿中培养39复习题 体外抗原抗体结合反应的特点。体外抗原抗体结合反应的特点。 定义定义 凝集反应凝集反应 沉淀反应沉淀反应 检测抗原或抗体的试验方法有哪些？检测抗原或抗体的试验方法有哪些？ 免疫细胞功能检测的方法？免疫细胞功能检测的方法？
