1、生物学(选修1)生物学技术实践细菌的结构细菌的结构基本结构细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、质粒质粒特殊结构荚膜、菌毛、鞭毛、芽孢荚膜、菌毛、鞭毛、芽孢一、细菌的基本结构一、细菌的基本结构 Basical Structure of Bacterium 细胞壁细胞壁 cell wall 1. 化学组分化学组分 聚糖骨架聚糖骨架 肽聚糖肽聚糖 peptidoglycan 四肽侧链四肽侧链 G+菌菌 五肽交联桥五肽交联桥 磷壁酸磷壁酸 teichoic acid 肽聚糖肽聚糖 peptidoglycan 脂多糖脂多糖 lipopolysaccharide,LPS G- 菌菌
2、 脂质双层：内有脂质双层：内有OMP 外膜外膜 脂蛋白脂蛋白 革兰阳性菌细胞壁结构革兰阳性菌细胞壁结构革兰阴性菌细胞壁结构革兰阴性菌细胞壁结构 质粒（质粒（plasmid） 质粒是染色体外的遗传物质，质粒是染色体外的遗传物质，存在于细胞质中。存在于细胞质中。 为闭合环状的双链为闭合环状的双链DNA，带有，带有遗传信息，控制细菌某些特定的遗传性状。质粒遗传信息，控制细菌某些特定的遗传性状。质粒能独立自行复制，随细菌分裂转移到子代细胞中。能独立自行复制，随细菌分裂转移到子代细胞中。质粒不是细菌生长所必不可少的，失去质粒的细质粒不是细菌生长所必不可少的，失去质粒的细菌仍能正常存活。质粒除决定该菌自身
3、的某种性菌仍能正常存活。质粒除决定该菌自身的某种性状外，还可通过接合或转导作用等将有关性状传状外，还可通过接合或转导作用等将有关性状传递给另一细菌。质粒编码的细菌性状有菌毛、细递给另一细菌。质粒编码的细菌性状有菌毛、细菌素、毒素和耐药性的产生等。菌素、毒素和耐药性的产生等。二、细菌的特殊结构二、细菌的特殊结构Special Structures of Bacterium 1. 荚膜荚膜 capsule 细菌细胞壁外包围的一层粘液细菌细胞壁外包围的一层粘液性物质结构。大多数为多糖，少数为多肽。厚性物质结构。大多数为多糖，少数为多肽。厚度小于度小于0.2 m者称微荚膜者称微荚膜（microcaps
4、ule）。 荚膜的功能：荚膜的功能： 粘附作用；粘附作用； 抗吞噬作用；抗吞噬作用； 抗有害物质的损伤作用。抗有害物质的损伤作用。荚膜荚膜（肺炎球菌）（肺炎球菌）2. 鞭毛鞭毛 flagellum 由蛋白质组成的结构，与细菌的运动有关；由蛋白质组成的结构，与细菌的运动有关； 具有免疫原性，有鉴别意义；具有免疫原性，有鉴别意义； 某些菌的鞭毛与致病有关。某些菌的鞭毛与致病有关。 鞭鞭 毛毛 3. 菌毛菌毛 pilus定义：由蛋白质组成，短而直，光镜下不能观察到。定义：由蛋白质组成，短而直，光镜下不能观察到。 普通菌毛普通菌毛ordinary pilus：是细菌的粘附结构，：是细菌的粘附结构，能与
5、宿主细胞的特异受体结合，介导细菌在局部定能与宿主细胞的特异受体结合，介导细菌在局部定植，与细菌的致病性密切相关。植，与细菌的致病性密切相关。 性菌毛性菌毛 sex pilus: 数量少，中空呈管状。由数量少，中空呈管状。由F质粒编码产生，与细菌的遗传变异有关。可通过接质粒编码产生，与细菌的遗传变异有关。可通过接合方式传递细菌的毒力和耐药性等。合方式传递细菌的毒力和耐药性等。 E. coli with fimbriae4. 芽胞芽胞 spore 某些细菌在一定条件下，在菌体中形成的在光学显微镜下某些细菌在一定条件下，在菌体中形成的在光学显微镜下可见的一个圆形或卵圆型小体。可见的一个圆形或卵圆型小
6、体。 芽胞是细菌的一种特殊存活方式，而不是繁殖方式。一个芽胞是细菌的一种特殊存活方式，而不是繁殖方式。一个细菌只能形成一个芽胞，一个芽胞也只能生成一个菌体。产细菌只能形成一个芽胞，一个芽胞也只能生成一个菌体。产芽胞的细菌在未产生芽胞时的菌体称为芽胞的细菌在未产生芽胞时的菌体称为繁殖体（繁殖体（vegetative form）。细菌芽胞的大小和位置细菌芽胞的大小和位置资料资料:大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周微米。周身身鞭毛鞭毛，能运动，无，能运动，无芽孢芽孢。能发酵多种糖类产。能发酵多种糖类产酸
7、、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素能合成维生素B和和K，以及有杀菌作用的大肠，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的几占粪便干重的1/3。兼
8、性厌氧兼性厌氧菌。菌。 在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，在。因此，大肠菌群数大肠菌群数（或大肠菌值）（或大肠菌值）常作为饮常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准水和食物（或药物）的卫生学标准。大肠杆菌的。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗）、鞭毛抗原（原（H）和表面抗原（）和表面抗原（K），后者有抗机体吞噬和），后者有抗机体
9、吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为杆菌分为150多型，其中有多型，其中有16个血清型为致病性个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是性转导就是1954年在大肠杆菌年在大肠杆菌K12菌株中发现的。菌株中发现的。莱德伯格（莱德伯格（Lederberg）采用两株大肠杆菌的营）采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验，奠定了研究细菌接合方法学养缺陷型进行实验，奠定了研究细菌接合方法学上的
10、基础，以及基因工程的研究。上的基础，以及基因工程的研究。 1.进行大肠杆菌的扩增进行大肠杆菌的扩增,利用液体培养基利用液体培养基进行细菌培养的操作。进行细菌培养的操作。 2. 进行大肠杆菌的分离，用固体平面培进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。养基进行细菌的划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。的原理。二、实验原理二、实验原理: 大肠杆菌的新陈代谢是大肠杆菌的新陈代谢是异养兼性厌氧异养兼性厌氧型型，在生态系统的身份（消费者、分，在生态系统的身份（消费者、分解者），因此可以用解者），因此可以用LB液体培养基液体培养基（通用的细
11、菌培养基或普通的细菌培（通用的细菌培养基或普通的细菌培养基）扩大培养。培养后再在养基）扩大培养。培养后再在LB固体固体平面培养基上划线进行分离，分离后，平面培养基上划线进行分离，分离后，培养基上会形成一个个单独的培养基上会形成一个个单独的菌落菌落，便于观察鉴定。这种方法有利于消除便于观察鉴定。这种方法有利于消除污染杂菌，也是用于筛选高表达量菌污染杂菌，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。株的最简便方法之一。进行微生物的分离与培养进行微生物的分离与培养属于技能性独立操作水平（属于技能性独立操作水平（A）三、实验操作要求：三、实验操作要求：1.培养基的配比与制作培养基的配比与制作 原理原理:
12、培养基是微生物的生存环境和营养物质培养基是微生物的生存环境和营养物质,必须无菌。俗话说，必须无菌。俗话说，“细菌喜荤，霉菌喜素细菌喜荤，霉菌喜素”，细菌培养基通常要用蛋白胨和酵母提取物配制细菌培养基通常要用蛋白胨和酵母提取物配制,加入一定的氯化钠（加入一定的氯化钠（维持一定的渗透压维持一定的渗透压）。细）。细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长，菌通常要求在中性偏碱的环境中生长，所以在所以在配制培养基时需调节培养基的酸碱度。配制培养基时需调节培养基的酸碱度。（一）、根据培养基的物理状态来区分（一）、根据培养基的物理状态来区分固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基半固体培养基半固体培养基 1 1、
13、液体培养基、液体培养基 主要用于增菌培养、鉴别性培养主要用于增菌培养、鉴别性培养2 2、固体培养基、固体培养基 用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等数、保藏、生物测定等 3 3、半固体培养基、半固体培养基 观察微生物的动力，有时用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。保藏菌种。（二）、根据培养基的用途来区分（二）、根据培养基的用途来区分 增殖培养基增殖培养基 选择培养基选择培养基 鉴别培养基鉴别培养基 1 1、增殖培养基、增殖培养基 在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物
14、的繁殖欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。称为增殖培养基。增菌、运送用培养基增菌、运送用培养基B2胆盐乳糖培养基（BL）大肠杆菌增菌B3亚硒酸盐增菌培养基沙门氏菌增菌B4亚硒酸盐半胱氨酸增菌培养基食品中沙门氏菌增菌B5四硫磺酸钠亮绿基础培养基沙门氏菌增菌B6GN肉汤培养基志贺氏菌增菌B7碱性蛋白胨水培养基霍乱弧菌增菌B87.5%氯化钠肉汤培养基金黄色葡萄球菌增菌B9缓冲蛋白胨水培养基沙门氏菌增菌B 10血液增菌培养基血液中细菌增菌B 11SCDLP液体基础培养基化妆品中细菌增菌2 2、选择培养基、选择培养基
15、 在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。分离培养用的培养基分离培养用的培养基名 称 用 途SS琼脂培养基 沙门氏和志贺氏菌属分离HE琼脂培养基志贺氏菌分离鉴别伊红美蓝琼脂培养基 大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别麦康凯琼脂培养基（MacC）肠道致病菌分离甘露醇高盐琼脂培养基）绿脓杆菌分离鉴别XLD琼脂培养基志贺氏、沙门氏菌分离中国蓝琼脂培养基肠道菌分离鉴别碱性琼脂培养基霍乱弧菌分离高盐蔡氏琼脂培养基真菌、酵母菌分离3 3、鉴别培养基、鉴别培养基 在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，
16、因而有助分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。别培养基。鉴别用培养基鉴别用培养基名名 称称用用 途途蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基靛基质和霍乱红试验靛基质和霍乱红试验乳糖胆盐发酵培养基乳糖胆盐发酵培养基大肠杆菌发酵乳糖试验大肠杆菌发酵乳糖试验0.5%0.5%乳糖发酵培养基乳糖发酵培养基肠道菌生化试验（复发酵）肠道菌生化试验（复发酵）半固体培养基半固体培养基动力试验和菌种保存动力试验和菌种保存三糖铁琼脂培养基（三糖铁琼脂培养基（TSTTST）肠杆菌糖发酵及硫化氢反应肠杆菌糖发酵及硫化氢反应氰化钾基础培
17、养基氰化钾基础培养基沙门氏菌分离沙门氏菌分离脱羧酶试验对照培养基脱羧酶试验对照培养基细菌脱羧酶试验细菌脱羧酶试验 LB培养基的配方如下: 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠(NaCl) 5g/L 另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4(该pH适合目前使用最广的原核表达菌种E.coli的生长)（三）培养基制备的基本方法和注意事项（三）培养基制备的基本方法和注意事项 培养基的制备记录培养基的制备记录 培养基成分的称取培养基成分的称取 培养基各成份的混合和溶化培养基各成份的混合和溶化 培养基培养基pHpH的初步调正
18、的初步调正 培养基的过滤澄清培养基的过滤澄清 培养基的分装培养基的分装 培养基的灭菌培养基的灭菌 培养基的质量测试培养基的质量测试 培养基的保存培养基的保存 范例解读：牛肉膏蛋白胨培养基的配制范例解读：牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基细菌基础培养基.其配方如下其配方如下: 牛肉膏牛肉膏3g,蛋白胨蛋白胨10g,Nacl5g,琼脂琼脂1520g,水水1000mL,PH7.47.6 1.称药品称药品 按实际用量计算后按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入按配方称取各种药品放入大烧杯中大烧杯中.牛肉膏可
19、放在小烧杯或表面皿中称量牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水用热水溶解后倒入大烧杯溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量也可放在称量纸上称量,随后放入热随后放入热水中水中,牛肉膏使与称量纸分离牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片立即取出纸片.蛋白胨极易蛋白胨极易吸潮吸潮,故称量时要迅速故称量时要迅速. 2.加热溶解加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量在烧杯中加入少于所需要的水量,然后然后放在石棉网上放在石棉网上,小火加热小火加热,并用玻棒搅拌并用玻棒搅拌,待药品完待药品完全溶解后再补充水分至所需量全溶解后再补充水分至所需量.若配制固体培养基若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中
20、则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化再加热融化,此过程中此过程中,需不断搅拌需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出以防琼脂糊底或溢出,最后最后补足所失的水分补足所失的水分. 3. 调调pH 检测培养基的检测培养基的pH,若若pH偏酸偏酸,可滴加可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌边加边搅拌,并随时用并随时用pH试纸检测试纸检测,直至达到所需直至达到所需pH范围范围.若偏碱若偏碱,则用则用lmol/L HCl进进行调节行调节.pH的调节通常放在加琼脂之前的调节通常放在加琼脂之前.应注意应注意pH值不要调过头值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的以免回调而影响培养基内各离子的浓度浓度.
21、4.过滤过滤 液体培养基可用滤纸过滤液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基固体培养基可用可用4层纱布趁热过滤层纱布趁热过滤,以利培养的观察以利培养的观察.但是供但是供一般使用的培养基一般使用的培养基,这步可省略这步可省略. 5.分装分装 按实验要求按实验要求,可将配制的培养基分装入可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分装量分装量:固体培养基约为试管高度的固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后灭菌后制成斜面制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积的分装入三角瓶内以不超过其容积的一
22、半为宜一半为宜.半固体培养基以试管高度的半固体培养基以试管高度的1/3为宜为宜,灭菌后垂直待凝灭菌后垂直待凝. 6.加棉塞加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉试管口和三角瓶口塞上用普通棉花花(非脱脂棉非脱脂棉)制作的棉塞制作的棉塞.棉塞的形状棉塞的形状,大小大小和松紧度要合适和松紧度要合适,四周紧贴管壁四周紧贴管壁,不留缝隙不留缝隙,才才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要要使棉塞总长约使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内塞入试管口或瓶口内,以防以防棉塞脱落棉塞脱落.有些微生物需要更好的通气有些微生物需要更好的通气,则可则可用用8层纱布制成通气塞层纱布制成通
23、气塞.有时也可用试管帽或有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞塑料塞代替棉塞. 7.包扎包扎 加塞后加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试若培养基分装于试管中管中,则应以则应以5支或支或7支在一起支在一起,再于棉塞外包一层牛皮再于棉塞外包一层牛皮纸纸,用绳扎好用绳扎好.然后用记号笔注明然后用记号笔注明,培养基名称培养基名称,组别组别,日期日期. 8.灭菌灭菌 将上述培养基于将上述培养基于121.3湿热灭菌湿热灭菌20min.如因如因特殊情况不能及时灭菌特殊情况不能及时灭菌,则应故人冰箱内
24、暂存则应故人冰箱内暂存. 9.摆斜面摆斜面 灭菌后灭菌后,如制斜面如制斜面,则需趁热将试管口端搁在则需趁热将试管口端搁在一根长木条上一根长木条上,并调整斜度并调整斜度,便斜面的长度不超过试管便斜面的长度不超过试管总长的总长的1/2. 10.无菌检查无菌检查 将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入37温箱中培养温箱中培养2448h,无菌生长即可使用无菌生长即可使用,或贮存于冰箱或清洁的橱或贮存于冰箱或清洁的橱内内,备用备用. 2.无菌技术无菌技术(灭菌操作灭菌操作):在培养微生物时必须进行无菌操作。在培养微生物时必须进行无菌操作。（1）各种器皿必须是无菌的，如各种大小的培）各种器皿必须是无菌的，如
25、各种大小的培养皿、试管等等通常用高压蒸汽灭菌法灭菌养皿、试管等等通常用高压蒸汽灭菌法灭菌（自主学习：自主学习：P20-21）。）。（2）各种培养基也必须是无菌的。如加入培养）各种培养基也必须是无菌的。如加入培养基的三角瓶、试管也要在基的三角瓶、试管也要在1210 C 下灭菌下灭菌15min（自主学习：自主学习：P21 ）。）。（3）在操作过程中必须是无菌的（菌转移操作）在操作过程中必须是无菌的（菌转移操作必须是无菌的）。在将培养基加入到三角瓶、必须是无菌的）。在将培养基加入到三角瓶、试管和培养皿中时，三角瓶口、试管口、和试管和培养皿中时，三角瓶口、试管口、和培养皿壁上不能沾有培养基，否则容易发
26、生培养皿壁上不能沾有培养基，否则容易发生污染（污染（自主学习：自主学习：P21 ） 无菌操作无菌操作斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞检验操作过程的无菌操作要求（1）、在操作中不应有大幅度的动作；）、在操作中不应有大幅度的动作；（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放。）、使用玻璃器皿应轻取轻放。（3）、在正火焰上方操作；）、在正火焰上方操作；（4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）、在接种培养物时，协作应轻、准）、在接种培养物时，协作应轻、准。（6）、不能用嘴直接吸吹吸管。）、不能用嘴直
27、接吸吹吸管。（7）、）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有盛有5%5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。来苏尔溶液的消毒桶内消毒。 3.接种之平板划线操作接种之平板划线操作如果用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培如果用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线的过程中菌液逐渐养皿平板上划线，在划线的过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线最后，可使细减少，细菌也逐渐减少。划线最后，可使细菌间的距离加大。在培养菌间的距离加大。在培养1020h后，可由一后，可由一个细菌产生单个菌落，菌落不会重叠。如果个细菌产生单个菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落
28、分别接种至含有固体培养基的再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。菌群就是由一个细菌产生的后代。“龙生九龙生九子，各有不同子，各有不同”。例如：我们要筛选乳酸菌，可用斜面扩增的菌例如：我们要筛选乳酸菌，可用斜面扩增的菌制作酸奶，根据效果不同，如制作酸奶，根据效果不同，如发酵时间快慢发酵时间快慢不同、口感不同、发酵是条件不同等等，筛不同、口感不同、发酵是条件不同等等，筛选出工作菌株选出工作菌株。划线分离法也可将污染的杂。划线分离法也可将污染的杂菌除去，如乳酸菌是厌氧菌，但时间长了也菌除去，如乳
29、酸菌是厌氧菌，但时间长了也有可能被需氧杂菌污染，因此在制成酸奶时，有可能被需氧杂菌污染，因此在制成酸奶时，酸奶上酸奶上 层会有麻稣的口感。将菌种重新划线分离后，可除去层会有麻稣的口感。将菌种重新划线分离后，可除去需氧杂菌。需氧杂菌。用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，也可用划线分离用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，也可用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有中通常有抗性基因抗性基因（如抗氨苄青霉素基因），如在（如抗氨苄青霉素基因），如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素（培养基中加入一定量的氨苄青霉素（选择培养基选择培养基），），由于非工
30、程菌的其他杂菌都没有抗性，所以在划线由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。因此，后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。因此，用这一方法可以筛选高表达能力的工程菌的菌株。用这一方法可以筛选高表达能力的工程菌的菌株。涂布分离法（自主学习）涂布分离法（自主学习）划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更容易划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更容易分开，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点，分开，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点，都可采用。都可采用。4.菌落观察菌落观察细菌的菌落表面一般是光滑而湿润细菌的菌落表面一般是光滑而湿润,有粘稠有粘稠性
31、性,多数透明或半透明多数透明或半透明,但也有细菌的菌落但也有细菌的菌落表面是干燥、有皱褶的。放线菌由于有表面是干燥、有皱褶的。放线菌由于有纤细的菌丝并可产生孢子，所以菌落表纤细的菌丝并可产生孢子，所以菌落表面是紧密的绒状、坚实多皱，长孢子后面是紧密的绒状、坚实多皱，长孢子后就成粉末状。由于菌丝和孢子有多种色就成粉末状。由于菌丝和孢子有多种色素，所以在菌落培养基底部和菌落表面素，所以在菌落培养基底部和菌落表面都有不同的颜色，菌丝可深入到培养基都有不同的颜色，菌丝可深入到培养基内，菌落不易用接种环或接种针挑动。内，菌落不易用接种环或接种针挑动。酵母菌菌落类似于细菌菌落，表面光滑酵母菌菌落类似于细菌
32、菌落，表面光滑 而湿润，有粘稠性，但大多呈乳白色（少数而湿润，有粘稠性，但大多呈乳白色（少数呈红色）；酵母菌落为绒毛状，孢子有各种呈红色）；酵母菌落为绒毛状，孢子有各种颜色，容易区分。颜色，容易区分。 如果菌落无法辨认如果菌落无法辨认,只有借助于显微镜观察。只有借助于显微镜观察。在显微镜下，细菌（在高倍镜下才能看到）在显微镜下，细菌（在高倍镜下才能看到）一般为杆状、球状和弧状；放线菌菌丝是没一般为杆状、球状和弧状；放线菌菌丝是没有横隔的分枝丝状体，气生菌丝顶端分裂成有横隔的分枝丝状体，气生菌丝顶端分裂成串状孢子，孢子丝有直线形、螺旋状、弯曲串状孢子，孢子丝有直线形、螺旋状、弯曲式或轮生等；酵母
33、有卵圆形或丝状，但卵圆式或轮生等；酵母有卵圆形或丝状，但卵圆形细胞大于细菌；霉菌以菌丝组成菌丝体，形细胞大于细菌；霉菌以菌丝组成菌丝体，菌丝结构和丝状酵母的菌丝相似。菌丝结构和丝状酵母的菌丝相似。染色法染色法 革兰染色革兰染色 Gram stain：由丹麦细菌学家革兰：由丹麦细菌学家革兰(Hans Christian Gram)创建的一种鉴别染色法。采用创建的一种鉴别染色法。采用4 种试种试剂分剂分4 步：步： 结晶紫结晶紫 碘液碘液 95%乙醇乙醇 复红复红 （初染）（初染） （媒染）（媒染） （脱色）（脱色） （复染）（复染） 革兰阳性菌革兰阳性菌 革兰阴性菌革兰阴性菌 （菌体为紫色（菌体
34、为紫色 ） （ 菌体为红色）菌体为红色）革兰阳性菌革兰阳性菌 革兰阴性菌革兰阴性菌四四.设备、用品及材料：设备、用品及材料：自主学习：自主学习：P21-22五五.实验步骤实验步骤: 1.在两个在两个250ml的三角瓶中分别装的三角瓶中分别装入入50mlLB液体培养基和液体培养基和50mlLB固体培固体培养基养基(刚配好刚配好,尚未凝固尚未凝固),加上封口膜。将加上封口膜。将培养皿用牛皮纸包好培养皿用牛皮纸包好,放入灭菌锅内放入灭菌锅内,1kg压力灭菌压力灭菌15min。 2.灭菌后灭菌后,待高压锅或灭菌锅压力与待高压锅或灭菌锅压力与大气压相同时大气压相同时(即没有压力了即没有压力了)打开锅盖。
35、打开锅盖。自主学习：自主学习：P22-23 3.将大肠杆菌斜面和有液体培养基将大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶放在左手中的三角瓶放在左手中,靠近酒精灯火焰靠近酒精灯火焰;右右手拿着接种环手拿着接种环,并用右手无名指和小指夹并用右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜住斜面的棉塞和三角瓶封口膜(请看请看P23图图2)。将接种环在火焰上烧红。将接种环在火焰上烧红,再深入到斜再深入到斜面面,使环接触培养基冷却后使环接触培养基冷却后,再取菌体。将再取菌体。将菌体放入三角瓶的液体培养基中菌体放入三角瓶的液体培养基中,将三角将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。三角瓶瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。三角瓶在
36、在370C摇床震荡培养摇床震荡培养12h。 4.划线分离。在酒精灯火焰上灼烧划线分离。在酒精灯火焰上灼烧接种环，将摇床上培养接种环，将摇床上培养12h的菌液打开，的菌液打开， 接种环部分深入到菌液中。然后，在固接种环部分深入到菌液中。然后，在固体培养基的平板上连续划线（体培养基的平板上连续划线（请看请看P23图图3），接种环只在菌液中蘸菌液一次。划），接种环只在菌液中蘸菌液一次。划线后盖好培养皿。将培养皿倒置（盖在线后盖好培养皿。将培养皿倒置（盖在下面），放到下面），放到370C恒温培养箱中培养恒温培养箱中培养1224h后，可看到在划线的末端出现不后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表
37、明菌已被分离。连续的单个菌落，表明菌已被分离。 5.在无菌操作下将单菌落用接种环在无菌操作下将单菌落用接种环取出取出,再用划线法接种在斜面上再用划线法接种在斜面上, 370C培培养养24h后，后， 40C冰箱保存。冰箱保存。课堂反馈课堂反馈：请根据所学知识回答以下问题请根据所学知识回答以下问题: （1）有）有2位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得的培养基中，得到以下到以下2种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为平板，统计的
38、菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布；乙同学在该浓度下涂布了了3个平板统计的菌落数分别为个平板统计的菌落数分别为21、212、256，并且，并且取平均值取平均值163作为统计结果；请评价这两位同学的实作为统计结果；请评价这两位同学的实验结果的有效性验结果的有效性甲同学甲同学 ，原因是，原因是 。乙同学乙同学 ，原因是，原因是 。不合理不合理没有设置重复组，结果不具有说服力没有设置重复组，结果不具有说服力不合理不合理1个计数结果与另个计数结果与另2个相差太远（或在操作过程个相差太远（或在操作过程中可能出现错误，或只简单地计算了平均值）中可能出现错误，或只简单地计算了平均值）正确做法是正确做法是
39、。 稀释涂布平板法所用培养基按物理性质划分属稀释涂布平板法所用培养基按物理性质划分属于哪一种于哪一种 培养基；培养基；倒平板前保证培养基无杂菌的常用方法是倒平板前保证培养基无杂菌的常用方法是 在设计实验时，一定要涂布至少在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否相当，结果差一定要考虑所设置的重复组的结果是否相当，结果差距太大，意味着操作有误，需要重新实验。距太大，意味着操作有误，需要重新实验。固体培养基固体培养基用高温蒸汽灭菌用高温蒸汽灭菌（
40、2）生物工程常需分离酵母菌和）生物工程常需分离酵母菌和Taq耐热菌，耐热菌，分离方法常用选择培养基。例如用加高浓度分离方法常用选择培养基。例如用加高浓度食盐的适宜培养基，分离金黄色葡萄球菌。食盐的适宜培养基，分离金黄色葡萄球菌。请提出从含细菌、酵母菌和请提出从含细菌、酵母菌和Taq耐热菌的培养耐热菌的培养液中分离酵母菌和液中分离酵母菌和Taq耐热菌的方案。耐热菌的方案。分离酵母菌分离酵母菌 分离分离Taq耐热菌耐热菌 分离和培养分离和培养Taq耐热菌的主要目的是为了从中耐热菌的主要目的是为了从中获得获得 供供PCR技术利用。技术利用。用加抗生素的选择培养基分离酵母菌用加抗生素的选择培养基分离酵母菌用高温培养条件分离用高温培养条件分离Taq耐热菌耐热菌热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶作业布置作业布置:思考与练习思考与练习P24 再见再见!
