1、免疫学技术2经典的免疫学方法：经典的免疫学方法：一、凝集反应（一、凝集反应（agglutination）细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块的反应。合后形成凝集团块的反应。1、直接凝集反应直接凝集反应2、间接凝集反应、间接凝集反应3、间接凝集抑制反应、间接凝集抑制反应34二、沉淀反应（二、沉淀反应（precipitation）血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物的反应。性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物的反应。1、单向免疫扩散（、单向免疫扩散（single immunodi
2、ffusion）2、双向免疫扩散（、双向免疫扩散（double immunodiffusion）3、免疫电泳（、免疫电泳（immunoelectrophoresis）4、火箭免疫电泳（火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis）5、免疫浊度测定（、免疫浊度测定（immunonephelometry）567891011免疫浊度测定：免疫浊度测定：可溶性可溶性Ag+Ab，二者比例合适时，在特殊的缓二者比例合适时，在特殊的缓冲冲液中快速形成一定的液中快速形成一定的AgAb复合物，使反应液出复合物，使反应液出现浊度。现浊度。 透射比浊法透射比浊法 散射比浊法散射比浊法 速率
3、散射比浊法速率散射比浊法 终点散射比浊法终点散射比浊法1213一定要保持抗体过量，以维持抗原抗体复合物的相一定要保持抗体过量，以维持抗原抗体复合物的相对不溶解性。对不溶解性。14该方法的分析范围主要检测的是血浆、体液该方法的分析范围主要检测的是血浆、体液中特定蛋白系列。如中特定蛋白系列。如Ig、补体、血浆蛋白、补体、血浆蛋白、炎性反应蛋白、一些小分子量的治疗性药物炎性反应蛋白、一些小分子量的治疗性药物浓度等。浓度等。15第一节第一节 免疫学检测常用标记技术免疫学检测常用标记技术16 免疫标记技术（免疫标记技术（immunolabelling technique） 指用荧光素、放射性核素、酶、发
4、光剂或电指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电 子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标 记抗体或抗原进行的抗原记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。抗体反应。 优点：高灵敏度、特异性、快速，能定性、定量、优点：高灵敏度、特异性、快速，能定性、定量、定位测定，易于观察结果并适合自动化检测。定位测定，易于观察结果并适合自动化检测。 总体分为：免疫组化：定位检测组织或细胞中的总体分为：免疫组化：定位检测组织或细胞中的 Ag/Ab 免疫测定：定量检测液体标本中的免疫测定：定量检测液体标本中的 Ag/Ab 也可分为：荧光免疫技术，放射免疫技术，酶免也可分为：荧光免疫技
5、术，放射免疫技术，酶免疫技术，化学发光免疫技术及免疫金标记技术等疫技术，化学发光免疫技术及免疫金标记技术等。17 一、酶免疫技术一、酶免疫技术 基本原理：以酶标记抗体（或抗原）用于免疫检基本原理：以酶标记抗体（或抗原）用于免疫检 测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对标本测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对标本中的抗原中的抗原/抗体进行定量、定位分析。抗体进行定量、定位分析。 标记物：酶（催化底物：生物放大作用）标记物：酶（催化底物：生物放大作用） 特点：灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记特点：灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全试剂能够较长时间保
6、持稳定，检测方法简便安全易行，容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广易行，容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。的新方法。18（一）常用的酶和酶作用底物（一）常用的酶和酶作用底物1、辣根过氧化物酶（、辣根过氧化物酶（HRP）HRP来源于植物辣根中，分子量来源于植物辣根中，分子量40KD，由主酶，由主酶（糖蛋白）和辅基（亚铁血红素）组成的复合物。（糖蛋白）和辅基（亚铁血红素）组成的复合物。HRP常用的底物有：常用的底物有：（1）邻苯二胺（）邻苯二胺（OPD）OPD显色后为橙黄色，加入终止液为棕黄色，可溶性产显色后为橙黄色，加入终止液为棕黄色，可溶性产物，应用最早，但配成溶液后稳定性差，且有
7、潜在的致物，应用最早，但配成溶液后稳定性差，且有潜在的致癌性，显色反应需避光。癌性，显色反应需避光。（2）四甲基联苯胺（）四甲基联苯胺（TMB） TMB经酶作用呈兰色，可溶性产物，加酸终止后黄色，经酶作用呈兰色，可溶性产物，加酸终止后黄色，稳定性好，显色反应无需避光，无致突变作用。应用最稳定性好，显色反应无需避光，无致突变作用。应用最广泛。但水溶性差。广泛。但水溶性差。19 2、碱性磷酸酶（、碱性磷酸酶（AP） AP从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，菌源性从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，菌源性活力小于小肠粘膜活力。活力小于小肠粘膜活力。AP价格较价格较HRP高，高，稳定性差，但敏感度高，空白值低。稳
8、定性差，但敏感度高，空白值低。 可催化对硝基苯磷酸酯（可催化对硝基苯磷酸酯（p-NPP），生成黄色），生成黄色的对硝基酚，的对硝基酚，NaOH终止后黄色可稳定存在一终止后黄色可稳定存在一段时间（段时间（405nm）。）。20 （二）酶免疫技术的分类（二）酶免疫技术的分类酶免疫组化酶免疫组化 （EIH） 均相酶免疫测定（均相酶免疫测定（HEI） 酶免疫测定酶免疫测定 非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 （EIA） 液相酶免疫测定液相酶免疫测定 （同（同RIA）21（三）酶免疫测定（三）酶免疫测定（EIA） 1、均相酶免疫测定（、均相酶免疫测定（HEI） 特点：仅需将待
9、测样品、酶标试剂和底物溶液特点：仅需将待测样品、酶标试剂和底物溶液混合，待抗原抗体反应完成即可直接测定结果，混合，待抗原抗体反应完成即可直接测定结果，整个检测过程都在均匀的液相中进行。整个检测过程都在均匀的液相中进行。 以酶放大免疫测定技术（以酶放大免疫测定技术（EMIT）为例：为例： 222、非均相酶免疫测定、非均相酶免疫测定（1）液相酶免疫测定（液相）液相酶免疫测定（液相EIA）：）： 同同RIA：抗原、酶标抗原、抗体相继加入后，使：抗原、酶标抗原、抗体相继加入后，使反应达到平衡，再加分离剂。反应达到平衡，再加分离剂。（2）固相酶免疫测定（固相）固相酶免疫测定（固相EIA）：）：AgAb反
10、应在固相载体的表面进行，应用最广泛反应在固相载体的表面进行，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验（的是酶联免疫吸附试验（ Enzyme linked immunosorbent assay ELISA ）231） ELISA 基本原理基本原理 将抗原或抗体结合到固相载体的表面，并保持将抗原或抗体结合到固相载体的表面，并保持其免疫活性。其免疫活性。 抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，仍分抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，仍分别保持其免疫活性和酶活性。别保持其免疫活性和酶活性。 在固相载体上按照一定的步骤加入待测抗原或在固相载体上按照一定的步骤加入待测抗原或抗体及酶标抗体或酶标抗原，洗去未结合的游抗
11、体及酶标抗体或酶标抗原，洗去未结合的游离物质，加入酶的底物显色，颜色的深浅与待离物质，加入酶的底物显色，颜色的深浅与待测物质含量呈相关性。测物质含量呈相关性。242）固相载体的种类）固相载体的种类A、塑料制品、塑料制品 聚苯乙烯：聚苯乙烯： 蛋白质非共价键或物理吸附结合到载体表蛋白质非共价键或物理吸附结合到载体表面，可制成小试管、小珠、微量反应板的形式面，可制成小试管、小珠、微量反应板的形式专用于专用于ELISA的微量反应板的微量反应板ELISA板（板（8 12=96孔）孔）B、微颗粒、微颗粒 高分子单体聚合成的微球或颗粒，带有能与蛋白质结高分子单体聚合成的微球或颗粒，带有能与蛋白质结合的功能
12、基团，易于化学偶联，结合容量大。反应时合的功能基团，易于化学偶联，结合容量大。反应时可均匀的分散到整个反应溶液中，反应速度快。其中可均匀的分散到整个反应溶液中，反应速度快。其中可包裹磁性物质，制成磁化微颗粒，使分离可在磁板可包裹磁性物质，制成磁化微颗粒，使分离可在磁板中完成，自动化分析。中完成，自动化分析。C、膜载体、膜载体 NC膜（硝酸纤维素膜）膜（硝酸纤维素膜） 、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微孔滤膜。非共价键吸附孔滤膜。非共价键吸附Ab/Ag，吸附能力强。广泛应，吸附能力强。广泛应用于斑点用于斑点-ELISA等。等。25 3）ELISA方法类型及反应原理方法类型及反应
13、原理 A、双抗体夹心法、双抗体夹心法 此法是检测大分子抗原的常用方法。此法是检测大分子抗原的常用方法。上述方法亦可改为双位点一步法，使用针对抗上述方法亦可改为双位点一步法，使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。注意钩状效应。为固相抗体和酶标抗体。注意钩状效应。26 B、间接法、间接法 此法是测定抗体的常用方法此法是测定抗体的常用方法。可以用一种酶标抗可以用一种酶标抗抗体检测多种抗体。抗体检测多种抗体。2728 C、竞争结合法、竞争结合法 可用于测定小分子抗原或半抗原及抗体。以检可用于测定小分子抗原或半抗原及抗体。以检测抗
14、原为例，待测抗原和酶标抗原竞争与固相测抗原为例，待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结合于固相的酶标抗原量与标本中抗体结合，结合于固相的酶标抗原量与标本中待测抗原含量呈反比。待测抗原含量呈反比。29 D、捕获法、捕获法最常用于检测最常用于检测IgM抗体抗体包被抗人包被抗人IgM 链链+待测标本待测标本-IgM类抗体全被类抗体全被固相抗体捕获固相抗体捕获-洗涤洗涤+ 特异性抗原（针对待特异性抗原（针对待测测IgM的相应抗原）与固相上特异性的相应抗原）与固相上特异性IgM结合结合+酶标抗体（针对特异性酶标抗体（针对特异性Ag的）的）+底物底物-显色显色-显色表示有特异性显色表示有特异性IgM。3
15、0 E、 BAS-ELISA 生物素（生物素（B） -亲和素（亲和素（A）系统（系统（ biotin avidin system，BAS）是以生物素和亲和是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，它们的结合素具有的独特结合特性为基础，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。 应用生物素亲和素放大系统的应用生物素亲和素放大系统的ELISA，使反，使反应信号放大，应信号放大， 检测灵敏度提高。检测灵敏度提高。31 1个亲和素（链霉亲和素）可结合四个生物素衍个亲和素（链霉亲和素）可结合四个生物素衍化物化物 1个抗体可结合多个个抗体可结合多个B，与蛋白质
16、与蛋白质-NH2结合形成结合形成 肽键，肽键，-NH2越多，标记越多，标记B越多。越多。 E B Ag? EB ABE B Ab B B B E EBABE32BAS-ELISA包括：包括：ABC-ELISA （间接法、双抗体夹心法）（间接法、双抗体夹心法） BA-ELISA （间接法、双抗体夹心法）（间接法、双抗体夹心法） BAB-ELISA （间接法、双抗体夹心法）（间接法、双抗体夹心法）例如：例如：BAB-ELISA（双抗体夹心法）：（双抗体夹心法）：固相固相Ab+待检待检Ag+（Ab-B）+ A + B-E + 底物显色底物显色33ABC-ELISA （间接法、双抗体夹心法）（间接法、
17、双抗体夹心法）34（四）酶免疫组化（四）酶免疫组化（EIH） 原理：原理：以酶标记抗体与用于相应抗原反应，以酶标记抗体与用于相应抗原反应，通过底物被酶解显色以示踪抗原通过底物被酶解显色以示踪抗原-抗体结合抗体结合物存在的部位。物存在的部位。 酶免疫组化染色标本可在普通光学显微镜酶免疫组化染色标本可在普通光学显微镜下观察，并能长期保存。下观察，并能长期保存。 此外，作为辣根过氧化物酶底物的二氨基此外，作为辣根过氧化物酶底物的二氨基联苯胺（联苯胺（DAB），），其分解产物为不溶性，其分解产物为不溶性，适于镜下观察。适于镜下观察。351、直接法、直接法组织标本待测抗原组织标本待测抗原+ 酶标记抗体酶
18、标记抗体DAB显色显色2、间接法、间接法 组织标本待测抗原组织标本待测抗原 + Ab1 + 酶标酶标-二抗二抗使用一种酶标抗体可检测多种抗原。敏感性较直使用一种酶标抗体可检测多种抗原。敏感性较直接法高，但低于接法高，但低于PAP法。法。36 3、生物素、生物素-亲和素法亲和素法 将亲和素（将亲和素（A）与生物素（与生物素（B）系统应用于酶系统应用于酶免疫组化免疫组化包括：包括：ABC法（直接法、间接法）法（直接法、间接法） BAB法（直接法、间接法）法（直接法、间接法） BA法法 （直接法、间接法）（直接法、间接法） 373. 3. 1 1）ABCABC法法直接直接ABCABC法法: :玻片玻
19、片Ag + BAg + BAb Ag-AbAb Ag-AbB B ABCABC Ag-AbAg-AbB-ABB-AB* *C C 特点特点: :将将BABBAB法中的法中的A A先与先与B BE E结合，制备成复合物结合，制备成复合物ABCABC间接间接ABCABC法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合复合物结合玻片玻片Ag + Ab1 Ag-Ab1 Ag + Ab1 Ag-Ab1 B BAb2Ab2 Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2B B ABCABC Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2B-ABB-AB* *C C382 2）BABB
20、AB法（桥联亲合素法（桥联亲合素- -标记生物素法标记生物素法BRABBRAB）直接直接BABBAB法法: :组织切片或细胞涂片组织切片或细胞涂片Ag + BAg + BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A A Ag-AbAg-AbB-AB-A B BE E Ag-Ab Ag-AbB-A-BB-A-BE E 特点：以游离特点：以游离A A分别连接分别连接B BAbAb和和B BE E 间接间接BABBAB法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合组织切片或细胞涂片组织切片或细胞涂片Ag + Ab1 Ag-Ab1 Ag + Ab1 Ag-Ab1
21、 B BAb2Ab2 Ag-Ab1- Ag-Ab1-Ab2Ab2B B A A Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2B-A B-A B BE E Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2B-A-BB-A-BE E393 3）BABA法（标记亲合素法（标记亲合素- -生物素法生物素法LABLAB法）法）直接直接BABA（或（或LABLAB）法）法玻片玻片Ag + BAg + BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A AE E Ag-Ab Ag-AbB-AB-AE E特点：以特点：以A AE/SAE/SAE E代替代替BABBAB法中的法中的A A，省却了加，省却了加B BE E的步骤
22、的步骤间接间接BABA（或（或LABLAB）法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体）法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合复合物结合玻片玻片Ag + Ab1 Ag-Ab1 Ag + Ab1 Ag-Ab1 B BAb2Ab2 Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2B B A AE E Ag-Ab1-Ab2Ag-Ab1-Ab2B-AB-AE E40 BASBAS实验方法及反应层次实验方法及反应层次 方方 法法 反应层次反应层次 直接法直接法 BA AgBA Ag(Ab-B)(Ab-B)A A* * BAB Ag BAB Ag(Ab-B)(Ab-B)A AB B* * ABC Ag ABC A
23、g(Ab-B)(Ab-B)ABAB* *C C 间接法间接法 BA AgBA AgAb1Ab1(Ab2-B)(Ab2-B)A A* * BAB Ag BAB AgAb1Ab1(Ab2-B)(Ab2-B)A AB B* * ABC Ag ABC AgAb1Ab1(Ab2-B)(Ab2-B)ABAB* *C C Ag Ag 抗原；抗原； Ab-B Ab-B 生物素化抗体；生物素化抗体； A A 亲合素；亲合素； A A* * 标记亲合素；标记亲合素； B B 生物素；生物素； B B* * 标记生物素；标记生物素； Ab1 Ab1 第一抗体；第一抗体； Ab2 Ab2 第二抗体第二抗体; ; Ab
24、2-B Ab2-B 生物素化第二抗体生物素化第二抗体414、过氧化物酶、过氧化物酶-抗过氧化物酶（抗过氧化物酶（peroxidase anti-peroxidase complex，PAP）法和碱性法和碱性磷 酸 酶磷 酸 酶 - 抗 碱 性 磷 酸 酶 （抗 碱 性 磷 酸 酶 （ a l k a l i n e phosphatase-antialkaline phosphatase，APAAP）法法 原理：应用抗酶抗体与酶结合，形成可溶性、原理：应用抗酶抗体与酶结合，形成可溶性、稳定的酶稳定的酶-抗酶抗体复合物。此法优点是：未抗酶抗体复合物。此法优点是：未经化学交联反应，故避免了抗体和酶
25、活性降低，经化学交联反应，故避免了抗体和酶活性降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁复过程。并省去酶标记抗体需纯化的繁复过程。42 二、荧光免疫技术二、荧光免疫技术（fluoroimmunoassay） 原理：以荧光素标记的抗体或抗原，用于相应原理：以荧光素标记的抗体或抗原，用于相应抗原或抗体的分析鉴定。抗原或抗体的分析鉴定。荧光免疫技术分为：荧光免疫技术分为：免疫荧光显微技术（荧光免疫组化）：用荧光抗免疫荧光显微技术（荧光免疫组化）：用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原（或体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原（或抗体）进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜抗体）进行鉴定和定位检测，可在荧光显微
26、镜下直接观察实验结果，下直接观察实验结果，流式细胞术：进行自动分析检测流式细胞术：进行自动分析检测荧光免疫测定：用于检测体液标本中抗原或抗体。荧光免疫测定：用于检测体液标本中抗原或抗体。43（一）常用的荧光色素（一）常用的荧光色素1、异硫氰酸荧光素（、异硫氰酸荧光素（FITC）橙黄色橙黄色/黄色粉末，发出黄绿色荧光。最大吸收峰黄色粉末，发出黄绿色荧光。最大吸收峰490495nm，最大发射峰最大发射峰520530nm，含异硫氰基含异硫氰基-N=C=S。应用最多的荧光素。应用最多的荧光素。2、四乙基罗丹明（、四乙基罗丹明（RB200）橘红色粉末，发出橘红色或橙色荧光。最大吸收峰橘红色粉末，发出橘红
27、色或橙色荧光。最大吸收峰570nm，最大发射峰最大发射峰595600nm。含磺酸基。与含磺酸基。与FITC做双标记或对比染色。做双标记或对比染色。3、藻红蛋白（、藻红蛋白（R-RE） 发出橙色荧光，最大吸收峰发出橙色荧光，最大吸收峰565nm，最大发射峰最大发射峰575nm，可与可与FITC共用共用488nm激发光，可用于流式细激发光，可用于流式细胞仪的双标记。胞仪的双标记。44（二）免疫荧光显微技术（二）免疫荧光显微技术1、方法及原理方法及原理1）直接）直接法法应用特异性荧光抗体直接检查标本中的相应抗原。应用特异性荧光抗体直接检查标本中的相应抗原。2）间接）间接法法以特异性抗体（或待测抗体）
28、为第一抗体，以荧以特异性抗体（或待测抗体）为第一抗体，以荧光素标记的抗球蛋白抗体（标记的抗抗体）为第光素标记的抗球蛋白抗体（标记的抗抗体）为第二抗体，用于检测抗原或抗体。二抗体，用于检测抗原或抗体。45 3）补体法补体法 此法是在间接法的第一步抗原此法是在间接法的第一步抗原- -抗抗体反应加入补体，使之与抗原体反应加入补体，使之与抗原- -抗体复合物抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗补体抗体进行示结合；再用荧光素标记的抗补体抗体进行示踪。踪。 4）双标记）双标记法法 此法用异硫氰酸荧光素（此法用异硫氰酸荧光素（FITC）及罗丹明及罗丹明（TRITC）分别标记不同抗体，进行同一标分别标记不同抗体
29、，进行同一标本的荧光染色，若有两种相应抗原存在，可本的荧光染色，若有两种相应抗原存在，可同时见两种（橙红、黄绿）荧光。同时见两种（橙红、黄绿）荧光。46 2、荧、荧光显微镜检查光显微镜检查1）染色标本尽可能立即观察结果。）染色标本尽可能立即观察结果。2）镜下观察时同一标本区观察时间不易过长。）镜下观察时同一标本区观察时间不易过长。3）通风较好的暗室中进行。）通风较好的暗室中进行。4）油镜检查时用无荧光镜油，先观察对照，再）油镜检查时用无荧光镜油，先观察对照，再看待测标本。看待测标本。47（三）流式细胞术（三）流式细胞术（FCM） FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，是将免疫荧光技术应用于流
30、式细胞仪，对单个细胞表面标志（抗原或受体）进行快对单个细胞表面标志（抗原或受体）进行快速、精确分析和自动检测，并可对不同类型速、精确分析和自动检测，并可对不同类型细胞进行分选和收集。细胞进行分选和收集。FCM还可对同一细胞还可对同一细胞的多种参数（如的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，故成为当代生胞体积等）进行多信息分析，故成为当代生命科学研究领域中被广泛应用的一项新技术。命科学研究领域中被广泛应用的一项新技术。 48 1、基本概念与原理、基本概念与原理 FCM是一种分析单个微粒（如细胞、微生物和是一种分析单个微粒（如细胞、微生物和人工合成微球等）物理和
31、化学特性的技术，其人工合成微球等）物理和化学特性的技术，其特点是快速、准确、客观，能定量。特点是快速、准确、客观，能定量。 FCM的原理：悬浮在液体中的分散细胞单个地的原理：悬浮在液体中的分散细胞单个地依次通过测量区时产生电信号，从而可快速对依次通过测量区时产生电信号，从而可快速对大量细胞进行多参数检测和分析，并可从整个大量细胞进行多参数检测和分析，并可从整个群体中分选出特定的细胞亚群。群体中分选出特定的细胞亚群。4950 2、流式细胞术在免疫细胞研究中的应用、流式细胞术在免疫细胞研究中的应用1）细胞表型分析）细胞表型分析 表型分析可用于免疫细胞鉴定、计数和功能评表型分析可用于免疫细胞鉴定、计
32、数和功能评价。价。2）细胞功能检测）细胞功能检测 （1）细胞功能状态和活化信号转导：）细胞功能状态和活化信号转导： 包括检测胞内钙离子浓度、蛋白磷酸化、蛋白激包括检测胞内钙离子浓度、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性状态、信息传递相关蛋白表达及相互作酶活性状态、信息传递相关蛋白表达及相互作用等。用等。51 （2）细胞增殖：）细胞增殖： 应用活细胞染料应用活细胞染料5-二醋酸羧基荧光素琥珀酸二醋酸羧基荧光素琥珀酸单胞菌酯（单胞菌酯（5-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）作）作为标记物，建立了检测细胞增殖的新技术。为标记物，建立了检测细
33、胞增殖的新技术。原理：原理：CFSE能自动穿过胞膜，与胞内蛋白能自动穿过胞膜，与胞内蛋白赖氨酸不可逆结合，并随细胞分裂而倍减，赖氨酸不可逆结合，并随细胞分裂而倍减，借助借助FCM检测荧光强度，可判断细胞的增殖检测荧光强度，可判断细胞的增殖状态。状态。 52 （3）细胞分化：）细胞分化：借助胞内细胞因子染色（借助胞内细胞因子染色（intracelluar cytokine staining，ICCS），），可应用可应用FCM检检测单细胞产生和分泌的测单细胞产生和分泌的CK，从而判断单一细，从而判断单一细胞亚群的分化和功能状态。胞亚群的分化和功能状态。原理：应用蛋白转运抑制剂使胞内合成的原理：应用
34、蛋白转运抑制剂使胞内合成的CK滞留在高尔基体；应用透膜剂（滞留在高尔基体；应用透膜剂（saponin）使荧光标记抗体可逆性穿透胞膜，以进行胞内使荧光标记抗体可逆性穿透胞膜，以进行胞内染色。染色。53（4）细胞毒效应：）细胞毒效应：通过检测某些效应分子（通过检测某些效应分子（FasL、穿孔素和颗粒穿孔素和颗粒酶等）可判断细胞毒效应。酶等）可判断细胞毒效应。（5）细胞凋亡：见下文。）细胞凋亡：见下文。54（四）荧光免疫测定（四）荧光免疫测定（FIA）1、荧光偏振免疫测定（、荧光偏振免疫测定（FPIA） 该法主要用于小分子物质（特别是药物浓度）测定。该法主要用于小分子物质（特别是药物浓度）测定。原理
35、：荧光素标记的已知抗原原理：荧光素标记的已知抗原+待测抗原待测抗原+抗体抗体形成形成标记抗原抗体复合物，由于其分子量大，旋转慢，在激标记抗原抗体复合物，由于其分子量大，旋转慢，在激发光照射下，吸收的偏振光多，发出的偏振荧光强，小发光照射下，吸收的偏振光多，发出的偏振荧光强，小分子游离标记抗原旋转快，其偏振荧光弱。因此，标本分子游离标记抗原旋转快，其偏振荧光弱。因此，标本中抗原浓度越高，形成的标记抗原抗体复合物越少，发中抗原浓度越高，形成的标记抗原抗体复合物越少，发出的偏振荧光越弱。反之，发出的偏振荧光越强。出的偏振荧光越弱。反之，发出的偏振荧光越强。55 2、时间分辨荧光免疫测定（、时间分辨荧
36、光免疫测定（TR-FIA） 原理：应用具有较长荧光寿命的镧系螯合原理：应用具有较长荧光寿命的镧系螯合物（如铕）标记抗原或抗体，并利用时间物（如铕）标记抗原或抗体，并利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，有效消除分辨荧光分析仪延缓测量时间，有效消除非特异性本底荧光的干扰，所得信号完全非特异性本底荧光的干扰，所得信号完全是镧系螯合物发射的特异荧光，从而最大是镧系螯合物发射的特异荧光，从而最大限度提高测定方法的灵敏度和特异性。限度提高测定方法的灵敏度和特异性。 56573、酶免疫荧光测定（、酶免疫荧光测定（ELFIA） 原理：应用具有潜在荧光的物质作为酶的底原理：应用具有潜在荧光的物质作为酶的底物，经
37、过酶解反应产生高强度荧光，可用荧物，经过酶解反应产生高强度荧光，可用荧光测量仪进行定量测定。光测量仪进行定量测定。58三、放射免疫技术三、放射免疫技术 是以放射性核素作为示踪剂的标记是以放射性核素作为示踪剂的标记 免疫测定方法，其特点是将核素分析的高免疫测定方法，其特点是将核素分析的高 灵敏度与抗原灵敏度与抗原-抗体反应的特异性相结合。抗体反应的特异性相结合。 广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大的推动作用。的发展起到了极大的推动作用。 包括放射免疫测定（包括放射
38、免疫测定（RIA）和免疫放射测定）和免疫放射测定（IRMA）59 射线：射线：131I、125I、51Cr、60Co 射线：射线：14C、3H、32P 射线半衰期长，易造成对环境的污染，比活射线半衰期长，易造成对环境的污染，比活性差，需液体闪烁仪。一般不用。性差，需液体闪烁仪。一般不用。60（ 1、RIA基本原理基本原理以放射性核素标记的抗原（以放射性核素标记的抗原（Ag*）和检品中待测和检品中待测的未标记抗原（的未标记抗原（Ag）与固定量特异性抗体竞争与固定量特异性抗体竞争结合反应。结合反应。若若Ag*和和Ab的量固定，二者结合所形成的量固定，二者结合所形成Ag*-Ab复复合物受合物受Ag含
39、量制约。若反应系统中含量制约。若反应系统中Ag含量高，含量高，其对其对Ab竞争结合能力即强，竞争结合能力即强，Ag-Ab复合物生成复合物生成量增加，量增加，Ag*-Ab复合物则相对减少。因此，复合物则相对减少。因此，Ag*Ab复合物形成量与复合物形成量与Ag含量间呈一定负相关含量间呈一定负相关函数关系。函数关系。61Ag*+AbAg*Ab+Ag* + Ag AgAb+ Ag B F B0 T 622、 RIA测定方法测定方法1）AgAb反应反应2）B、F的分离的分离加入加入PR试剂（二抗和试剂（二抗和PEG混合物，混合物， 也可制成固相二抗也可制成固相二抗（二抗与颗粒固相物连接）（二抗与颗粒固
40、相物连接）Ag*Ab1+Ab2Ag*Ab1-Ab23） 放射性强度的测定放射性强度的测定 计数仪测上清计数仪测上清/沉淀沉淀cpm，制备标准曲线（，制备标准曲线（B/（B+F），），B/F，B/B0）。亦可用计算机处理。）。亦可用计算机处理。631、单位点、单位点IRMA是将待测抗原与过量标记抗体直接反应，然后加是将待测抗原与过量标记抗体直接反应，然后加入固相的抗原免疫吸附剂与游离的标记抗体结合入固相的抗原免疫吸附剂与游离的标记抗体结合经离心去除沉淀物，测定上清液放射性强度，从经离心去除沉淀物，测定上清液放射性强度，从而推算出检品中待测抗原含量。而推算出检品中待测抗原含量。2、双位点、双位点I
41、RMA测定固相上的测定固相上的cpm数数64 四、化学发光免疫技术四、化学发光免疫技术 是将发光技术与免疫反应和计算机技术结合是将发光技术与免疫反应和计算机技术结合 的自动化仪器分析技术，目前已趋替代的自动化仪器分析技术，目前已趋替代RIA而而 成为免疫检测广泛采用的分析技术。成为免疫检测广泛采用的分析技术。 可用于多项指标的检测。可测定内分泌激素可用于多项指标的检测。可测定内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测。血类等方面的检测。 65（一）化学发光免疫
42、测定（一）化学发光免疫测定（CLIA） CLIA是以化学发光剂（如鲁米诺、吖啶酯等）是以化学发光剂（如鲁米诺、吖啶酯等）标记抗体或抗原，免疫反应完成后，直接引发标记抗体或抗原，免疫反应完成后，直接引发化学发光反应进行检测。化学发光反应进行检测。66（二）化学发光酶免疫测定（二）化学发光酶免疫测定（CLEIA） CLEIA的抗原的抗原-抗体反应步骤与酶免疫测定相抗体反应步骤与酶免疫测定相同，仅酶促反应所用的底物为发光剂，通过同，仅酶促反应所用的底物为发光剂，通过化学发光反应进行检测。化学发光反应进行检测。67 （三）电化学发光免疫测定（三）电化学发光免疫测定（ECLIA）ECLIA实际上是在电极
43、表面由电化学引发的特异性实际上是在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。化学发光反应。三联吡啶钌三联吡啶钌 RU(bpy)32+三丙胺（三丙胺（TPA）.68电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫分析示意图69电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图70五、免疫金标记技术（五、免疫金标记技术（immunogold labelling technique） 氯金酸（氯金酸（HAuCl4）在还原剂（枸橼酸三钠）作用下被）在还原剂（枸橼酸三钠）作用下被还原成原子金，聚合成特定大小的金颗粒悬液，并由还原成原子金，聚合成特定大小的金颗粒悬液，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态于静电作用成为
44、一种稳定的胶体状态胶体金。胶体金。 是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原-抗体反应。抗体反应。胶体金具有高电子密度，胶体金具有高电子密度，最初主要用于免疫电镜技术，最初主要用于免疫电镜技术，以后其应用范围逐步扩展以后其应用范围逐步扩展。 在免疫组化方面，胶体金标记的抗体可直接用于检测在免疫组化方面，胶体金标记的抗体可直接用于检测细胞表面和组织切片中的抗原或受体，并可在普通光细胞表面和组织切片中的抗原或受体，并可在普通光学显微镜下观察。学显微镜下观察。 在流式细胞术中，胶体金可作为多参细胞分析和分选在流式细胞术中，胶体金可作为多参细胞分析和分选的有效标记物。的
45、有效标记物。 71常用的方法：常用的方法： 1、免疫金（银）染色法（、免疫金（银）染色法（IGS/IGSS） 组织切片（抗原）组织切片（抗原）+特异性抗体特异性抗体+胶体金标胶体金标记二抗记二抗+银显影剂，标记物上的金颗粒催化硝银显影剂，标记物上的金颗粒催化硝酸银离子还原成银颗粒，在抗原抗体复合物酸银离子还原成银颗粒，在抗原抗体复合物上形成黑色上形成黑色“银壳银壳”，使，使Ag位置放大，从而位置放大，从而提提高了镜下的可见度。高了镜下的可见度。 72用用NC膜或微孔滤膜为载体吸附抗原，用胶体金膜或微孔滤膜为载体吸附抗原，用胶体金标记抗体代替酶标抗体。标记抗体代替酶标抗体。2、斑点免疫层析试验（
46、、斑点免疫层析试验（DICA）73 六、免疫印迹技术（六、免疫印迹技术（immunoblotting） 又称为又称为Western-blotting，是将凝胶电泳的高是将凝胶电泳的高分辨力与固相免疫测定结合起来的一种方法。分辨力与固相免疫测定结合起来的一种方法。 由十二烷基磺酸钠由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、）、蛋白质转印和固相膜免疫测蛋白质转印和固相膜免疫测定三项技术结合而成。定三项技术结合而成。74七、免疫七、免疫PCR （immuno-PCR，IM-PCR） 是将免疫学反应和是将免疫学反应和PCR技术相结合而创建的技术相结合而创建的一种新的检
47、测技术，具有抗原、抗体反应的一种新的检测技术，具有抗原、抗体反应的特异性和特异性和PCR技术的高效性。技术的高效性。 基本原理：用一段已知的基本原理：用一段已知的DNA分子作为标记分子作为标记物，结合一抗或二抗后去检测相应抗原或抗物，结合一抗或二抗后去检测相应抗原或抗体，再用体，再用PCR法扩增该法扩增该DNA分子，扩增产分子，扩增产物用琼脂糖电泳定性，根据该物用琼脂糖电泳定性，根据该DNA分子的存分子的存在与否，确定检测结果。在与否，确定检测结果。 该方法与该方法与ELISA的原理类似，不同的是以的原理类似，不同的是以DNA分子作为标记物。免疫分子作为标记物。免疫PCR可采用直可采用直接法、
48、间接法和双抗体夹心法。接法、间接法和双抗体夹心法。7576 八、细胞凋亡检测技术八、细胞凋亡检测技术（一）形态学检测（一）形态学检测 应用电子显微镜或普通光学显微镜直接观察应用电子显微镜或普通光学显微镜直接观察细胞大小、凋亡小体和其他凋亡细胞的形态细胞大小、凋亡小体和其他凋亡细胞的形态学改变；学改变；应用某些可直接、间接产生荧光的染料应用某些可直接、间接产生荧光的染料如双如双苯并咪唑（苯并咪唑（HO）、）、碘化丙啶（碘化丙啶（PI）、）、 Annexin V等等使细胞着染，借助荧光显微镜使细胞着染，借助荧光显微镜区分凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞。区分凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞。77（二）生物
49、化学检测方法（二）生物化学检测方法 凋亡细胞染色质凋亡细胞染色质DNA在核小体单位间连接处在核小体单位间连接处断裂，形成断裂，形成180200bp整数倍的寡核苷酸片整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上 表 现 为 梯 形 电 泳 图 谱段，在凝胶电泳上 表 现 为 梯 形 电 泳 图 谱（DNA ladder）。）。（三）免疫学检测方法（三）免疫学检测方法 原理：凋亡细胞染色质原理：凋亡细胞染色质DNA断裂而产生的核断裂而产生的核小体小体DNA，可与组蛋白结合为复合物。应用可与组蛋白结合为复合物。应用抗组蛋白和抗抗组蛋白和抗DNA单抗，借助单抗，借助ELISA方法可方法可测定细胞凋亡。测定细胞凋
50、亡。 该技术优点是：可用于检测不同培养细胞株该技术优点是：可用于检测不同培养细胞株或不同动物来源的细胞凋亡；灵敏度高，且或不同动物来源的细胞凋亡；灵敏度高，且可检测早期细胞凋亡。可检测早期细胞凋亡。78（四）分子生物学检测方法（四）分子生物学检测方法 常用技术为脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口常用技术为脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（末端标记法（TUNEL），）， 原理：凋亡细胞的原理：凋亡细胞的DNA链发生断裂而暴露链发生断裂而暴露3-OH末端，可借助末端转移酶（末端，可借助末端转移酶（TdT）将脱氧核将脱氧核糖核酸与荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或糖核酸与荧光素、过氧化物酶、碱
