1、非小细胞肺癌基因检测非小细胞肺癌基因检测明显提高。EGFREGFR突变检测中需要明确的几个基本概念突变检测中需要明确的几个基本概念2 2、基因突变是指、基因突变是指DNADNA发生碱基序列的改变：发生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段，针对非DNA的检测手段如：RT-PCR（检测RNA表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及针对非碱基序列的检测手段如：FISH（检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等，均不适用。体细胞突变体细胞突变发生在非种系组织中不具有遗传性不会遗传给子代种系突变种系突变发生于精子或卵子中可以遗传子代子代所有细胞均带突变1 1、EGFREGFR突变为体细胞突变：突变为体细胞
2、突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。EGFREGFR基因突变检测概念基因突变检测概念EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态检测并不是：EGFR基因DNA拷贝数的检测（FISH法）EGFR蛋白表达量的检测（IHC法）。XNature Review 2007, 7:169NSCLCNSCLC中中EGFREGFR酪氨酸激酶区突变酪氨酸激酶区突变种类种类标本采集及病理评估DNA 抽提及质控检测报告EGFR突变检测ARMS测序法其它方法EGFR 突变检测流程
3、突变检测流程EGFREGFR突变检测中的相关角色突变检测中的相关角色患者患者临床医生临床医生胸外科医师胸外科医师内镜医师内镜医师收集肺癌组织标本收集肺癌组织标本病理科医生病理科医生准备样本准备样本实验操作及结果分析实验操作及结果分析实验室人员实验室人员报告结果给临床医生报告结果给临床医生-肿瘤科医生肿瘤科医生-放疗科医生放疗科医生-呼吸科医生呼吸科医生用于用于EGFR突变检测的标本突变检测的标本 肿瘤组织肿瘤组织目前最可靠的标本；目前最可靠的标本；其它样本： 外周血（血浆、血清） 细胞学 （胸水、痰液细胞学） 支气管刮取物 仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用还可以获得分子标志物
4、的进一步信息。标本因素标本因素对对EGFR突变检测的影响突变检测的影响-肿瘤组织特点肿瘤组织特点-遗传异质性遗传异质性 对检测方法敏感度有较高要求对检测方法敏感度有较高要求正常细胞混杂正常细胞混杂标本因素标本因素对对EGFR突变检测的影响突变检测的影响-组织标本种类组织标本种类- 对检测方法有对检测方法有相应相应要求要求，组织标本及，组织标本及DNADNA质控尤其重要质控尤其重要 冰冻新鲜组织冰冻新鲜组织 固定包埋组织固定包埋组织-外科手术标本完整，量多广泛-小活检标本完整，量少受限-外科手术标本片段化，量多受限-小活检标本片段化，量少极度受限DNA质与量质与量适用方法适用方法图4. EGFR
5、基因检测使用的临床样本及其操作。基因检测使用的临床样本及其操作。A.被切成被切成10微米的石蜡包埋标本。微米的石蜡包埋标本。B.在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净（悬浮），可以就这样冷冻保存，在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净（悬浮），可以就这样冷冻保存，C.进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于AL缓冲液，缓冲液，此状态此状态可以室温保存。可以室温保存。 肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本病理学评估组织切片非小细胞性肺癌诊断及类型肿瘤细胞比例肿瘤细胞总数标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞H&E 染色片用于病理评估白片
6、用于提取DNA建议最少切片数：-手术标本，5 m X4-小活检标本，5 m X8 组织标本来源组织标本来源手术标本支气管下活检经皮穿刺活检 标本处理及贮存标本处理及贮存新鲜冻存：液氮或-80CFFPE之一，但只能检测已知的突变，且标本需进行预处理，检测费用较高。直接测序法直接测序法流程及数据分析流程及数据分析PCR*纯化纯化测序反应测序反应测序仪毛细管电泳测序仪毛细管电泳纯化纯化数据分析数据分析EGFR deletionEGFR L858R电泳质控电泳质控组织标本组织标本DNA*PCR是关键：是关键：-特异性-产物长度-必要时巢式-建议通用测序引物DNAARMS反应反应实时定量实时定量 PCR
7、ARMS法法操作流程及数据解读操作流程及数据解读数据分析数据分析内参信号内参信号 (HEX)突变突变信号信号: + -内参内参信号信号: + +标本 1（突变阳性突变阳性）标本 2（突变阴性）突变信号突变信号 (FAM)组织标本组织标本内参信号内参信号 (HEX)测序法与测序法与ARMSARMS法比较法比较小结：小结：了解你的标本-新鲜/冰冻组织FFPE组织-手术标本小活检标本选择合适的方法-ARMS是目前较敏感快速方法，且容易开展是目前较敏感快速方法，且容易开展-测序是传统的方法，但敏感度有限，过程复杂，不易普及做好组织标本及DNA质控是关键非肿瘤组织标本的有效利用-在无肿瘤组织情况下，外周
8、血cfDNA、胸水及细针穿刺等细胞学标本均可用于检测EGFR突变，但其确切的敏感度与特异性尚需进一步探索-必须选择足够敏感的方法再进行基因检测，可以选择与其耐药机制相对应的治疗方法。即在一个患者的各种临床情况中，掌握EGFR与相关基因的信息，以期进一步改善临床疗效。耐药性。第三代EGFR抑制剂。国外多个制药公司和研究机构都在开展对T790M突变的小分子抑制剂研究，其中包括克洛维斯肿瘤公司的CO-1686和阿斯利康的AZD9291, 但还没有针对该突变的药物上市。 ALK 融合基因是新发现的 NSCLC 驱动基因，其中棘皮动物微管相关类蛋白 4（EML4）基因与 ALK（间变性淋巴瘤激酶）的融合
9、（EML4-ALK）为最常见类型。ALK 融合基因主要出现在不吸烟或少吸烟的肺腺癌患者，且通常与 EGFR 基因突变不同时存在于同一患者。NSCLC 患者中 ALK 融合基因的发生率约为 5%，而在 EGFR、KRAS、HER2 或 TP53 等基因无突变的 NSCLC 患者中，ALK 融合基因阳性率达 25%；我国 EGFR 和 KRAS 均为野生型的腺癌患者中 ALK 融合基因的阳性率高达 30%42% 。病理形态学研究提示在含印戒细胞的粘液型或实性腺癌中，ALK的发生率高于其他类型的肺腺癌（46.2% vs 8%）ALK阳性的NSCLC虽然仅占全部NSCLC的5%，但是每年新发病例数在中
10、国仍接近30,000例 ALK融合基因概念融合基因概念目前检测 ALK 融合基因的常用方法主要有荧光原位杂交技术（FISH）、基于 PCR 扩增基础上的技术和免疫组织化学方法（IHC）。FISH 目前仍是确定 ALK 融合基因的参照标准方法，但价格昂贵，操作规范要求较高，尚不适用于 ALK 阳性患者的筛查。实时荧光定量 PCR 操作简便，敏感度高，但需要特定的试剂盒和仪器。IHC 简便易行、价格便宜、操作方法成熟。VentanaALK 融合蛋白 IHC 诊断试剂盒在不影响特异度的前提下，进一步提高了敏感度，与 FISH 结果的吻合率达到 98.8%，可重复性达 99.7%，已经获 CFDA 批准用于诊断 ALK 阳性的 NSCLC 患者。 ALK融合基因检测方法融合基因检测方法品和药品监督管理总局（CFDA）已批准克唑替尼用于治疗ALK融合阳性的局部晚期或转移性NSCLC患者常见不良反应（发生率25%）包括视力障碍、恶心、腹泻、水肿及便秘等谢 谢 ！
