1、影响喜树中喜树碱含量的影响影响喜树中喜树碱含量的影响因子及其喜树碱在抗癌方面的因子及其喜树碱在抗癌方面的研究研究一、喜树与喜树碱开发利用进展喜树属于珙桐科旱莲属植物，落叶乔木，分布一种色氨酸-萜烯类生物碱，具有抗癌活性CPT能阻断拓扑异构酶I的合成，topo 是一种与细胞分裂密切相关的一种酶。喜树喜树喜树碱喜树碱喜树碱结构式将其定名为CPT,其分子式为C20H16O4N2,熔点为264 267 CPT 在喜树树体内的分布不同器官中CPT 含量与分布规律 组织越嫩，含量越高CPT 在树体内部的分布规律 不同组织器官之间含量有相关性，根与茎、根与枝、侧枝与茎正相关环境因子对树体内CPT 含量的影响
2、 重度遮阴叶中cpt含量提高，茎没影响，侧根下降。增施氮磷钾无影响采后贮藏与处理方法对原料中CPT 含量影响 液氮冷冻可阻止各种生理生化活动，比气干和烘干含量高含有CPT 及其类似物的其它植物 夹竹桃科海木狗牙花、茶茱萸科臭假柴龙树、茜草科硬毛蛇根草CPT 及其类似物的提取、分离与生产工艺渗漉提取与萃取分离 原料粉碎，用乙醇或石油醚渗漉，渗漉液减压浓缩，再用氯仿提取，蒸干氯仿得粗提取物柱层析提取与分离 先用氯仿提取,再向提取液中加工业乙醇,后用乙酸乙酯提取,经常压浓缩,即得提取液树脂吸附提取 喜树果粉用80%乙醇在室温下浸泡24h，用AB-8 树脂对喜树碱进行吸附，解吸附剂为pH3 的氯仿乙醇
3、混合溶剂。CPT 生产工艺 CPT 的耐热性和耐光性较差,关键是所有浓缩工序要在减压下进行，避光操作。二、光强对喜树幼苗叶片次生代谢产物喜树碱的影响叶片的喜树碱产量在处理初期随光强减弱而缓慢地略有增加,处理后期随光强的减弱而有明显增加,但光强低于全光照的60%以后喜树碱产量迅速下降。喜树碱的增加可能是对不良境的一种适应性反应。五月初，在温室中由种子获得实生苗，栽植花盆中，每盆一株。七月十五遮阴处理，遮阴处理分四组，相对光照强度分别为全光照的80%、60%、40%、20%。处理后大致每隔15 d 取样1 次,每次取样各处理分别取5 株喜树幼苗(5 重复)。摘取每株幼苗的全株叶片,烘干测定干重后粉
4、碎、混匀,用于测定喜树碱含量。当碳供应能力进一步降低时,会超过幼苗的调节能力,40%光强下处理后期喜树碱含量增加幅度的降低和20%光强下处理后期喜树碱含量的下降(图3)说明了这一点。喜树幼苗中喜树碱的代谢可对多种环境胁迫如光照(图4)、水分等产生应答,其反应可能不是特异性的。从图6 可以看出,适当的遮荫能够显著地增加喜树幼苗叶片中喜树碱的产量三、丛枝菌根对喜树幼苗喜树碱含量的影响观察了2 属6 种丛枝菌根真菌对喜树幼苗喜树碱含量的影响 无梗囊霉属:蜜色无梗囊霉(Am)、光壁无梗囊霉(Al)。球囊霉属:木薯球囊霉(Gm)、地表球囊霉(Gv)、幼套球囊霉(Ge)、透光球囊霉(Gd)。5 月末,选择
5、长势一致的喜树幼苗分为7 组(每组10 盆)进行接种处理。1 组作为对照(CK)，其他六组分别接种六种真菌。接种后放与温室，三个月后测量。实验所用球囊霉属的4 种真菌(Gm、Gv、Ge、Gd)的菌根侵染率较高,均在70%以上;无梗囊霉属的2 种真菌(Am、Al)的菌根侵染率稍低,但最低的Al 也接近50%。从本试验的结果看(图1),丛枝菌根的形成影响了喜树幼苗的喜树碱代谢,一些菌根幼苗的喜树碱含量高于无菌根幼苗。四、滤光膜对喜树幼苗叶片生长和喜树碱含量的影响通过用黄色、红色、蓝色3种滤光膜对温室栽培的喜树幼苗进行遮光处理,研究了不同光照环境下喜树幼苗叶片生物量、叶绿素含量、光合作用和喜树碱含量
6、的差异。通过滤光膜遮光促进喜树碱在幼苗叶片中的积累,提高了叶片喜树碱产量,对喜树碱的生产实践有一定的意义。将幼苗栽植到花盆中，每盆一株。待幼苗长出4 对真叶后,进行滤光膜处理,分别遮以黄色、红色和蓝色的滤光膜,每个处理由每行10 盆每列10 盆幼苗形成试验种群,在各取样时期,选取各处理中具代表性的幼苗进行测定。由此可以看出,在整个30d 的遮光过程中,蓝膜和红膜造成光照环境的差异对幼苗生物量的影响较明显,黄膜不明显。这种差异不仅与遮光造成的光质环境差异有关,还与光照强度的差异有关。五、喜树碱与DNA相互作用的光谱学研究采用光谱法研究了抗癌药物喜树碱与DNA 的相互作用。DNA 引起喜树碱的吸收
7、光谱轻微的红移和减色并导致喜树碱的荧光猝灭，说明喜树碱和DNA 形成基态复合物。取适量的DNA 和喜树碱储备液混合并用0 05 mol/L Tris-HCl 缓冲溶液(包含0.10 mol/L NaCl，pH=7.40)稀释到合适的浓度。以混合物的吸收光谱对相应浓度的喜树碱光谱作差谱获得喜树碱对DNA 吸收光谱的影响。以混合物的吸收光谱对相应浓度的DNA光谱作差谱获得DNA 对喜树碱的吸收光谱的影响。取适量的DNA 和喜树碱储备液混合并稀释到合适的浓度及CPT DNA 比例。溶液充分混合并反应30 min，然后在不同的温度下测量荧光光谱。激发波长分别为222，252，365 nm。双链DNA
8、经过超声处理0 5 h、在沸水中加热10 min 并在冰浴中快速冷冻获得单链DNA。喜树碱与单链(ssDNA)及双链DNA(dsDNA)的相互作用采用荧光光谱法进行研究和比较。采用NaCl(非荧光猝灭剂)来控制离子强度的大小，研究离子强度对喜树碱和DNA 相互作用的影响。DNA 的磷酸骨架带有负电荷，很容易和带正电荷的离子产生静电相互作用。如果喜树碱和DNA 相互作用主要为静电作用模式，Na+将会包裹在负电荷的DNA 磷酸骨架周围，从而阻止DNA 和喜树碱的结合。因此喜树碱的荧光猝灭程度将会降低。结果显示，随着Na+的加入，CPT-DNA复合物的荧光强度基本不发生变化如图，因此可以排除静电作用
9、为主要的作用模式。六、喜树碱的抗肿瘤活性及其作用机制喜树碱对许多肿瘤的生长有抑制作用,尤其对消化道肿瘤、白血病、绒毛膜上皮癌、膀肤癌有显著效果。喜树碱能抑制哺乳动物细胞的DNA和RNA合成，有效的抑制拓扑异构酶I。Topol一DNA复合物是喜树碱的作用底物TopoI可以与DNA形成一种可裂解的二元复合物TopoI一DNA,使DNA解旋,同时在DNA聚合酶的作用下进行复制。而喜树碱可以与这种复合物结合，形成药物CPT一ToPol一DNA三元复合物喜树碱能稳定这个可裂解的复合物,继而抑制了DNA缺口的修复喜树碱作用机理 在体内环境中,喜树碱存在着内酯环形式与开环羧酸盐形式的平衡,人血清蛋白(HSA)会优先与喜树碱的开环形式结合,该结合能力是HSA与内酷环的结合能力的100倍以上。水解平衡向开环形式方向移动,从而导致喜树碱内酷环形式(活性形式)的浓度降低,抗肿瘤活性下降;开环羧酸盐形式浓度升高,毒性大增。因此,内酯环的稳定性是喜树碱保持活性的重要指标,保持内酯环稳定与阻止开环羧酸盐与HSA的结合对提高抗肿瘤活性和降低毒性都有益,也是喜树碱衍生物开发的一个方向。喜树碱的毒性主要是来自其开环梭酸盐形式
