1、3.1 茎尖分生组织培养的应用茎尖分生组织培养的应用v3.1.1 3.1.1 形态建成研究形态建成研究v茎尖分生组织培养取材便利茎尖分生组织培养取材便利,培养条件能严格培养条件能严格控制控制,十分有利于形态建成的研究十分有利于形态建成的研究.v3.1.2 无病株的生产无病株的生产v 迄今为止迄今为止,人们发现的植物病毒已超过人们发现的植物病毒已超过500种种,无病毒苗的培养在农业生产中作用越来越无病毒苗的培养在农业生产中作用越来越大大,取得了良好的经济效益和社会效益取得了良好的经济效益和社会效益.v3.1.3 营养繁殖营养繁殖v 茎尖组织培养可以严格控制和茎尖组织培养可以严格控制和调节适宜的营
2、养、激素浓度、温度、调节适宜的营养、激素浓度、温度、光照等外部条件，使许多在常规条光照等外部条件，使许多在常规条件下无法生长和繁殖的植物材料成件下无法生长和繁殖的植物材料成功快速繁殖。功快速繁殖。v3.1.4 应用于育种应用于育种v 因茎尖遗传性稳定因茎尖遗传性稳定,茎尖组织茎尖组织培养技术已经成熟培养技术已经成熟,因此该技术多因此该技术多用于常规方法繁殖困难的物种用于常规方法繁殖困难的物种,有有性不亲和基因与不育基因型的繁殖性不亲和基因与不育基因型的繁殖,新杂交种的快速繁殖新杂交种的快速繁殖,繁殖大批遗繁殖大批遗传形状一致的亲本供大规模杂交制传形状一致的亲本供大规模杂交制种。种。3.2 3.
3、2 茎尖分生组织培养的方法茎尖分生组织培养的方法v3.2.1 3.2.1 材料的准备材料的准备v3.2.2 3.2.2 材料的消毒材料的消毒v3.2.3 3.2.3 组织片的分离组织片的分离v3.2.4 3.2.4 培养基培养基v3.2.5 3.2.5 培养条件培养条件3.3 3.3 脱毒苗培养和病毒检测脱毒苗培养和病毒检测v3.3.1 脱毒苗培养的意义脱毒苗培养的意义v 可以脱除严重患病毒病植物的病毒，恢可以脱除严重患病毒病植物的病毒，恢复种性，提高产量和品质。复种性，提高产量和品质。v3.3.2 3.3.2 热处理脱毒方法热处理脱毒方法v（1 1）脱毒原理：因为病毒和植物细胞对高温）脱毒原
4、理：因为病毒和植物细胞对高温的耐受性不同，高温可阻止病毒扩散并抑制的耐受性不同，高温可阻止病毒扩散并抑制其增殖，使病毒浓度不断降低，持续一段时其增殖，使病毒浓度不断降低，持续一段时间后，病毒将自行消失。间后，病毒将自行消失。v（2 2）热处理脱毒方法有二种：一中是温汤浸）热处理脱毒方法有二种：一中是温汤浸渍处理；另一种是高温空气处理。渍处理；另一种是高温空气处理。v3.3.3 3.3.3 茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒v(1)(1)茎尖培养脱毒理论依据：茎尖培养脱毒理论依据：v植物细胞的全能性学说，任何细胞都含有植物细胞的全能性学说，任何细胞都含有全套的遗传信息，具有形成完整植株的能力；全套的遗传信
5、息，具有形成完整植株的能力；v植物病毒在寄主体内分布不均匀，茎尖部植物病毒在寄主体内分布不均匀，茎尖部位病毒含量极低或不含病毒。位病毒含量极低或不含病毒。v 茎尖培养脱毒效果的好坏与茎尖茎尖培养脱毒效果的好坏与茎尖大小呈负相关，切取的茎尖越小，大小呈负相关，切取的茎尖越小，脱毒效果越好；而培养茎尖成活率脱毒效果越好；而培养茎尖成活率的高低则与茎尖大小呈正相关，切的高低则与茎尖大小呈正相关，切取茎尖越小，成活率越低。取茎尖越小，成活率越低。(2)(2)茎尖培养脱毒方法茎尖培养脱毒方法v1)1)培养脱毒母株培养脱毒母株,获得外植体获得外植体v2)2)选择培养基选择培养基vMSMS适合大多数双子叶植
6、物培养；适合大多数双子叶植物培养；B5B5和和N6N6培养培养基适合于大多数单子叶植物；基适合于大多数单子叶植物；WhiteWhite培养基适培养基适合于根的培养。合于根的培养。v3)3)剥离和接种剥离和接种v将消毒好的茎段或芽置超净工作台的双目解将消毒好的茎段或芽置超净工作台的双目解剖镜下，用解剖针剥离幼叶和叶原基，切取剖镜下，用解剖针剥离幼叶和叶原基，切取适当大小，接种到芽分化培养基上。适当大小，接种到芽分化培养基上。v4)4)继代培养生根和快速繁殖继代培养生根和快速繁殖v将接种外植体置于将接种外植体置于2525度左右、光照度度左右、光照度3000lx3000lx的实验室中，光周期的实验室
7、中，光周期13-16h/d13-16h/d，培养，培养2-32-3周成周成苗。苗高苗。苗高1-2cm1-2cm高时，转入生根培养基，高时，转入生根培养基，7-107-10天后生根，再继代成壮苗后移栽。天后生根，再继代成壮苗后移栽。v(3)(3)茎尖培养的关键技术环节茎尖培养的关键技术环节v1 1）剥离适当大小的茎尖）剥离适当大小的茎尖v一般剥离带一般剥离带1-21-2个叶原基的茎尖即可获得较好个叶原基的茎尖即可获得较好的脱毒效果。的脱毒效果。v2 2）选择合适培养基）选择合适培养基v生长素生长素/细胞分裂素的比值大于细胞分裂素的比值大于1 1时有利于根时有利于根的形成，否则有利于芽的分化。的形
8、成，否则有利于芽的分化。v3 3）给予适宜的环境条件）给予适宜的环境条件v茎尖培养脱毒的其他几种方法：茎尖培养脱毒的其他几种方法：v1 1）热处理结合茎尖培养脱毒）热处理结合茎尖培养脱毒v2 2）微体嫁接脱毒）微体嫁接脱毒v3 3）抗病毒药剂脱毒）抗病毒药剂脱毒v4 4）脱毒苗保存）脱毒苗保存v3.3.4 病毒的概念与形态病毒的概念与形态v(1)(1)概念概念v 病毒是一种非细胞形态的必须在活病毒是一种非细胞形态的必须在活细胞中才能增殖的专性寄生物细胞中才能增殖的专性寄生物,是最小是最小的生命实体的生命实体,是由一种核酸和蛋白质衣是由一种核酸和蛋白质衣壳组成的非细胞形态的分子生物。壳组成的非细
9、胞形态的分子生物。v（2）病毒的形态病毒的形态v植物病毒的基本形态为植物病毒的基本形态为粒体粒体(virion(virion,virus particle)virus particle)。v大部分病毒的粒体为大部分病毒的粒体为球状（等轴粒体）球状（等轴粒体）、杆状和线状杆状和线状，少数为，少数为弹状弹状、杆菌状杆菌状和和双双联体状联体状等。等。v线状病毒一般长线状病毒一般长4804801250nm1250nm，宽，宽101013nm13nm；杆状病毒一般长；杆状病毒一般长130130300nm300nm，宽，宽151520nm20nm；杆菌状病毒一；杆菌状病毒一般长般长5858240nm240
10、nm，宽，宽181819nm19nm。球状。球状病毒为多面体，直径病毒为多面体，直径161680nm80nm。球形病毒的结构球形病毒的结构球形病毒的结构模式结构图球形病毒的结构模式结构图植物病毒的各种形态植物病毒的各种形态常见形态有常见形态有 杆形杆形 线形线形 球形球形 弹形等弹形等(3)植物病毒对生产的影响植物病毒对生产的影响引起多种植物病害，大多数植物都不同程度地引起多种植物病害，大多数植物都不同程度地受到病毒的危害受到病毒的危害:v茄科和十字花科植物上，有茄科和十字花科植物上，有50%50%的病害为病毒病；的病害为病毒病；v在烟草在烟草,马铃薯上病毒危害重要；马铃薯上病毒危害重要；v在
11、花卉上，病毒病使品质和产量降低，甚至影响进出在花卉上，病毒病使品质和产量降低，甚至影响进出口；口；v大麦黄矮病毒，曾使美国小麦损失大麦黄矮病毒，曾使美国小麦损失60006000万美元，加拿万美元，加拿大损失大损失17001700万美元。万美元。(4)植物病毒的组成成分植物病毒的组成成分v植物病毒主要成分是植物病毒主要成分是核酸核酸和和蛋白质蛋白质，核酸在内核酸在内部，外部由蛋白质包被，称为外壳。合称为核部，外部由蛋白质包被，称为外壳。合称为核蛋白或核衣壳。有的病毒粒体中还含有少量的蛋白或核衣壳。有的病毒粒体中还含有少量的糖蛋白或脂类、水分等。糖蛋白或脂类、水分等。v类病毒则没有蛋白质外壳，仅为
12、类病毒则没有蛋白质外壳，仅为RNA的分子。的分子。核酸是病毒的核心核酸是病毒的核心，组成了病，组成了病毒的遗传信息组毒的遗传信息组基因组基因组(genome)(genome)，决定病毒的增殖、，决定病毒的增殖、遗传、变异和致病性。遗传、变异和致病性。(5)(5)病毒核酸的比例病毒核酸的比例 不同形态粒体的病毒中核酸的比例不同，不同形态粒体的病毒中核酸的比例不同，一般说，球形粒体病毒的核酸含量高，一般说，球形粒体病毒的核酸含量高，占粒体重量的占粒体重量的15 45，长条形粒体，长条形粒体病毒中核酸含量占病毒中核酸含量占5%6；而在弹；而在弹状病毒中只占状病毒中只占1左右。左右。卫星卫星RNARN
13、A 在某些多分体病毒中发现了小分子量的在某些多分体病毒中发现了小分子量的RNARNA，其，其与病毒与病毒RNARNA没有同源性，单独不能侵染，要依赖病毒没有同源性，单独不能侵染，要依赖病毒的核酸才能侵染和增殖，这种核酸称为卫星的核酸才能侵染和增殖，这种核酸称为卫星RNA(satellite RNARNA(satellite RNA，sRNAsRNA)，其依赖的病毒称为，其依赖的病毒称为辅辅助病毒助病毒。卫星。卫星RNARNA与辅助病毒包被在同一衣壳内，并与辅助病毒包被在同一衣壳内，并能抑制辅助病毒的复制，降低其浓度并改变其致病能抑制辅助病毒的复制，降低其浓度并改变其致病力，利用力，利用sRNA
14、sRNA与病毒的关系，可进行生物防治及基与病毒的关系，可进行生物防治及基因工程抗病毒育种研究。因工程抗病毒育种研究。病毒的其它组成成分病毒的其它组成成分v除蛋白和核酸外，植物病毒含有的最大量的除蛋白和核酸外，植物病毒含有的最大量的其它组分是其它组分是水分水分，例如在西红柿束矮病毒和，例如在西红柿束矮病毒和芜菁黄花叶病毒的结晶体中，水分的含量分芜菁黄花叶病毒的结晶体中，水分的含量分别为别为4747和和5858。v 碳水化合物碳水化合物主要发现在植物主要发现在植物弹状病毒科病毒弹状病毒科病毒中，以糖蛋白或脂类的形式存在于病毒的囊中，以糖蛋白或脂类的形式存在于病毒的囊膜中。如西红柿斑萎病毒合有膜中。
15、如西红柿斑萎病毒合有7 7的碳水化合的碳水化合物。物。v某些病毒粒体含某些病毒粒体含多胺多胺，主要是精胺和亚精胺，主要是精胺和亚精胺，它们与核酸上的磷酸基团相互作用，为稳定折它们与核酸上的磷酸基团相互作用，为稳定折迭的核酸分子。迭的核酸分子。v金属离子金属离子也是许多病毒必须的，主要有也是许多病毒必须的，主要有钙离子钙离子、钠离子钠离子和和镁离子镁离子。这些金属离子与衣壳蛋白亚。这些金属离子与衣壳蛋白亚基上的离子结合位点作用，稳定衣壳蛋白与核基上的离子结合位点作用，稳定衣壳蛋白与核酸的结合利用离子整合剂去掉这些金属离子，酸的结合利用离子整合剂去掉这些金属离子，往往导致病毒粒体膨胀，易受核酸酶的
16、分解。往往导致病毒粒体膨胀，易受核酸酶的分解。v3.3.5 植物病毒的侵染与传播植物病毒的侵染与传播v(1)(1)植物病毒的侵染植物病毒的侵染v因病毒是极小的生命体因病毒是极小的生命体,不能靠自身不能靠自身力量主动侵入植物细胞力量主动侵入植物细胞,只能借助只能借助外力外力,通过植物细胞的微伤或昆虫通过植物细胞的微伤或昆虫刺吸式口器刺吸式口器,把病毒送入植物细胞把病毒送入植物细胞内。内。(2)植物病毒的传播植物病毒的传播 1)1)介体传播介体传播 蚜虫传播蚜虫传播:在蚜虫介体中，大约有在蚜虫介体中，大约有200200种蚜虫可种蚜虫可传播传播160160多种植物病毒，有的蚜虫只传播多种植物病毒，有
17、的蚜虫只传播2-32-3种病种病毒，有的可以传播毒，有的可以传播40-5040-50种病毒种病毒(如蚕豆蚜和马铃如蚕豆蚜和马铃薯蚜薯蚜)，桃蚜甚至可以传播，桃蚜甚至可以传播100100种以上的病毒。在种以上的病毒。在这这160160多种植物病毒中，有的只由一种蚜虫传播，多种植物病毒中，有的只由一种蚜虫传播，有的可由多种蚜虫传播，黄瓜花叶病毒甚至可以有的可由多种蚜虫传播，黄瓜花叶病毒甚至可以由由7575种蚜虫传播。种蚜虫传播。线虫传播：线虫传播：现存发现的介体线虫均为外现存发现的介体线虫均为外寄生类型线虫寄生类型线虫,属矛线目属矛线目(Dorilaimida(Dorilaimida)，游离生活于
18、土壤中。游离生活于土壤中。线虫传病毒集中在线虫传病毒集中在蠕传病毒属蠕传病毒属(Nepovirus(Nepovirus)和烟草脆裂病和烟草脆裂病毒属毒属(Tobravirus(Tobravirus)中。中。叶蝉和飞虱：叶蝉和飞虱：在叶蝉亚目大约在叶蝉亚目大约2000个属个属15000种叶蝉中，只有种叶蝉中，只有21个属中的个属中的49种是种是病毒的传播介体。介体的寄主主要是禾本病毒的传播介体。介体的寄主主要是禾本科植物，重要的作物病害如水稻矮缩病、科植物，重要的作物病害如水稻矮缩病、小麦丛矮病和玉米粗缩病等。小麦丛矮病和玉米粗缩病等。v土壤中的介体：土壤中的介体：现已明确除了现已明确除了TMV
19、TMV可在土可在土壤中存活较久外，土壤本身并不传毒，主壤中存活较久外，土壤本身并不传毒，主要是土壤中的线虫或真菌传播病毒。要是土壤中的线虫或真菌传播病毒。v病毒侵染植物以后，在活细胞内增殖后病毒侵染植物以后，在活细胞内增殖后代病毒需要两个步骤：代病毒需要两个步骤：(1)(1)病毒核酸的复制病毒核酸的复制(replication)(replication)从亲代向子代病毒传送核酸性状的过从亲代向子代病毒传送核酸性状的过程，即病毒的基因传递程，即病毒的基因传递 (2)(2)病毒核酸信息的表达病毒核酸信息的表达植物病毒增殖复制的主要步骤植物病毒增殖复制的主要步骤v侵入活细胞并脱壳侵入活细胞并脱壳v核
20、酸复制和基因表达核酸复制和基因表达v病毒粒体的装配病毒粒体的装配v扩散转移扩散转移植物病毒的植物病毒的复制概况示意图复制概况示意图v2)接触传播接触传播v无性繁殖材料和嫁接传播无性繁殖材料和嫁接传播:由于病毒系统侵染的由于病毒系统侵染的特点，在植物体内除生长点外各部位均可带毒，在特点，在植物体内除生长点外各部位均可带毒，在以球茎、块根、接穗芽为繁殖的作物中特别重要，以球茎、块根、接穗芽为繁殖的作物中特别重要，如马铃薯、大蒜、郁金香、苹果树等，如母株受侵如马铃薯、大蒜、郁金香、苹果树等，如母株受侵染则无一幸免。这些无性繁殖材料都可以带毒，故染则无一幸免。这些无性繁殖材料都可以带毒，故成为重要的检
21、疫对象。成为重要的检疫对象。v嫁接是园艺上非常普通的农事措施之一，也是证明嫁接是园艺上非常普通的农事措施之一，也是证明疑难病原物侵染性的重要方法之一。嫁接可以传播疑难病原物侵染性的重要方法之一。嫁接可以传播任何种类的病毒、植物菌原体和类病毒病害。任何种类的病毒、植物菌原体和类病毒病害。v种子和花粉传播种子和花粉传播:随着研究发展及检测随着研究发展及检测技术水平的提高，已报道种传的病毒及技术水平的提高，已报道种传的病毒及其寄主植物种类大为增加，现在估计约其寄主植物种类大为增加，现在估计约15的已知病毒可以种传。种子带毒的的已知病毒可以种传。种子带毒的危害主要表现在早期侵染和远距离传播，危害主要表
22、现在早期侵染和远距离传播，早期侵染提供初侵染来源，在田间形成早期侵染提供初侵染来源，在田间形成发病中心；尤其是和蚜虫非持久性传毒发病中心；尤其是和蚜虫非持久性传毒方式结合极有可能造成严重危害。方式结合极有可能造成严重危害。v种传病毒的寄主以豆科、葫芦科、菊科种传病毒的寄主以豆科、葫芦科、菊科植物为多，而茄科植物却很少。植物为多，而茄科植物却很少。v由花粉直接传播的病毒数量并不多，现在知由花粉直接传播的病毒数量并不多，现在知道的有十几种，但多数是木本寄主，如危害道的有十几种，但多数是木本寄主，如危害樱桃的桃环斑病毒、樱桃卷叶病毒；危害悬樱桃的桃环斑病毒、樱桃卷叶病毒；危害悬钩子的悬钩子环斑病毒、
23、黑悬钩子潜隐病毒、钩子的悬钩子环斑病毒、黑悬钩子潜隐病毒、悬钩子丛矮病毒以及酸樱桃黄化病毒等。这悬钩子丛矮病毒以及酸樱桃黄化病毒等。这些花粉也可以由蜜蜂携带传播。些花粉也可以由蜜蜂携带传播。植物病毒在植植物病毒在植株体内的转移株体内的转移3.3.6 病毒的检测病毒的检测v植物病毒的鉴定与检测方法植物病毒的鉴定与检测方法:v(1)(1)指示植物法指示植物法v 利用病毒在其他植物上产生的利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的标准，也枯斑作为鉴别病毒种类的标准，也叫枯斑和空斑测定法。叫枯斑和空斑测定法。v 有的植物对污染物非常敏感。如牵牛花中有的植物对污染物非常敏感。如牵牛花中含有花青素，
24、该色素在碱性溶液中为蓝色，在含有花青素，该色素在碱性溶液中为蓝色，在酸性溶液中为红色，故从早晨至晚上，随着二酸性溶液中为红色，故从早晨至晚上，随着二氧化碳含量增加，牵牛花花色从蓝变红。牵牛氧化碳含量增加，牵牛花花色从蓝变红。牵牛花即是对空气中二氧化碳浓度的指示植物。雪花即是对空气中二氧化碳浓度的指示植物。雪松对二氧化硫和氟化氢很敏感，当空气中存在松对二氧化硫和氟化氢很敏感，当空气中存在这两种气体时，其叶片就会出现枯黄现象。紫这两种气体时，其叶片就会出现枯黄现象。紫鸭跖草在低强度的辐射后，花色即由蓝色变成鸭跖草在低强度的辐射后，花色即由蓝色变成粉红，这种植物可以作为测量辐射强度的粉红，这种植物可
25、以作为测量辐射强度的“指指示剂示剂”。v(2)(2)抗血清鉴定法抗血清鉴定法v 抗体是动物在外来抗原的刺激下产抗体是动物在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白。抗体主要存在于生的一种免疫球蛋白。抗体主要存在于血清中，含有抗体的血清称为抗血清。血清中，含有抗体的血清称为抗血清。因不同病毒的血清具有特异性，因此用因不同病毒的血清具有特异性，因此用已知病毒的抗血清即可鉴定未知病毒的已知病毒的抗血清即可鉴定未知病毒的种类。种类。v 抗血清也是植物病毒鉴定中最有用抗血清也是植物病毒鉴定中最有用的方法之一。的方法之一。v(3)(3)电子显微镜鉴定法电子显微镜鉴定法 电子显微镜分辨力可达电子显微镜分辨力可达
26、0.5nm0.5nm。比。比生物学鉴定更直观，鉴定速度快。生物学鉴定更直观，鉴定速度快。v(4)(4)酶联免疫测定法酶联免疫测定法v具有极高的灵敏度、特异性强、安具有极高的灵敏度、特异性强、安全快速和容易观察结果的优点。全快速和容易观察结果的优点。3.3.7 无病毒苗的保存和繁殖无病毒苗的保存和繁殖v(1)无病毒苗的保存方法无病毒苗的保存方法v隔离保存隔离保存:为防止无毒植株重被感染，需为防止无毒植株重被感染，需将无毒原种种在温室或防虫罩内已灭菌将无毒原种种在温室或防虫罩内已灭菌的土壤中。的土壤中。v长期保存：通过离体培养进行繁殖长期保存：通过离体培养进行繁殖和保存。和保存。（2 2）无病毒苗的繁殖）无病毒苗的繁殖 无病毒苗的繁殖方法有：嫁无病毒苗的繁殖方法有：嫁接繁殖、扦插繁殖、压条繁殖、接繁殖、扦插繁殖、压条繁殖、匍匐茎繁殖等。匍匐茎繁殖等。建立无病毒苗繁殖生产体系建立无病毒苗繁殖生产体系v 在单轴兰花中，用茎尖建外在单轴兰花中，用茎尖建外植体时，意味耗费整个植株，植体时，意味耗费整个植株，因此一般用带有营养芽的花梗因此一般用带有营养芽的花梗节段进行培养。节段进行培养。v作业：作业：v P74 P74 页页 第第1 1、2 2、3 3、5 5题题
