1、HLA基因分型和抗HLA抗体检测在异基因造血干细胞移植中的临床意义 HLA基因的分子结构及特征基因的分子结构及特征 HLA基因分型在基因分型在allo-HSCT中的临床应用中的临床应用 抗抗HLA抗体检测的临床意义抗体检测的临床意义 美国美国ASHI认证实验室的价值认证实验室的价值Part HLA基因的分子结构及特征基因的分子结构及特征 HLA(人类白细胞抗原人类白细胞抗原)基因的结构基因的结构HLA位于人类位于人类6 6号染色体号染色体,存在于人体的各种有核细胞表面存在于人体的各种有核细胞表面HLA的命名与分辨率的相关性的命名与分辨率的相关性HLA-A*02:101:01:02N基因基因血清
2、型血清型低分辨低分辨 02:XXSSP或或SSOP基因型基因型中分辨中分辨 02:ZAHD-SSOP蛋白相同蛋白相同,编码区无义突变编码区无义突变非编码区非编码区,内含子内含子不表达蛋白不表达蛋白特异蛋白特异蛋白高分辨高分辨 02:01G等位基因等位基因 02:01SBT+GSSPSBT实验方法学分辨率HLA基因分型实验方法的发展基因分型实验方法的发展 血清学方法血清学方法 特异性引物特异性引物PCR扩增法扩增法(SSP)正或反向寡核苷酸探针杂交法正或反向寡核苷酸探针杂交法(SSOP)-Luminex技术技术 核苷酸序列分析法核苷酸序列分析法(SBT)-一代基因测序技术一代基因测序技术 单分子
3、核苷酸序列分析法单分子核苷酸序列分析法(NGS)-二代基因测序技术二代基因测序技术HLA基因分型分辨率在基因分型分辨率在HSCT中的应用中的应用 HLA低分辨基因分型低分辨基因分型:脐血库入库供者脐血库入库供者,器官移植器官移植 HLA中分辨基因分型中分辨基因分型:家系单倍型完整的亲缘家系单倍型完整的亲缘HLA全全相合移植相合移植,脐血移植脐血移植(根据根据Code码和常见等位基因频率码和常见等位基因频率组合排除组合排除),),器官移植器官移植 HLA高分辨基因分型高分辨基因分型:无关供者入库无关供者入库,亲缘移植亲缘移植(包括家包括家系单倍型不完整的系单倍型不完整的HLA全相合和单倍体全相合
4、和单倍体),),脐血移植脐血移植 HLA等位基因分型等位基因分型:非血缘移植非血缘移植,包括包括HLA全相合和部全相合和部分等位基因错配无关供者移植分等位基因错配无关供者移植Part HLA基因分型在基因分型在allo-HSCT中的临床应用中的临床应用 日本学者对AML,CML和MDS标危患者进行HLA-1个抗原错配亲缘供者与HLA-8/8相合无关供者比较研究提示,移植后总死亡率升高;HLA-B抗原错配移植后TRM升高,OS下降;C抗原错配或多个等位基因错配在B抗原错配中出现频率高且与移植预后差相关.美国研究表明:无关供者全相合的移植效果明显好于1个等位基因或1个抗原错配的亲缘错配供者.结论结
5、论:优先选择无关全相合供者进行优先选择无关全相合供者进行HSCT无关无关HLA全相合与亲缘全相合与亲缘1个抗原错配个抗原错配HSCT的预后的预后比较比较HLA基因分型在选择无关供者错配基因分型在选择无关供者错配HSCT中中的建议的建议 NMDP数据显示:HLA-A,B,C,DR位点全相合和1个位点错配GvHD发生率28%VS 37%;1年OS 52%VS 43%.B,C位点错配的耐受好于A,DR位点.(BM-URD)NMDP推荐选择策略HLA-A,B,C等位基因错配好于抗原错配,最不利因素是C抗原错配;A,DQ等位基因和抗原与DR抗原错配均不影响移植后复发和cGvHD;DP选择可允许等位基因错
6、配;推荐选择免疫原性低和可允许的错配位点.(PSC-URD)如果供受者A,B,C,DR位点不全相合,应该增加检测DQ,DP和 DR3/4/5位点的基因分型,以便选择最合适的供者进行移植.HLA基因分型在无关脐血供者选择中的作用基因分型在无关脐血供者选择中的作用 NMDP基本原则:有核细胞数量(2.5107/kg和HLA4/6 匹配度(HLA-A/B抗原相合,DR等位基因相合);建议选择HLA-5/6以上相合脐血 强烈推荐C位点分型,以及所有位点进行高分辨分型,可以明确等位基因错配类型对移植预后的影响 强烈推荐检测抗HLA抗体;选择非遗传母系HLA抗原(NIMA)相合的脐血 NMDP/CIBMT
7、R最新研究表明:HLA-C和DR位点错配是移植相关死亡的高危因素 目前还没有双份脐血与受着之间的匹配原则,但实践证明2份脐血最佳达到HLA-A/B抗原和DR等位基因相合,最低为4/6相合 HLA基因分型在单倍体移植供体选择中的意义基因分型在单倍体移植供体选择中的意义 在非清髓的恶性血液病单倍体移植中HLA-和错配程度的增加并没有明显影响cGvHD和NRM的累积发生;存在HLA-DR抗原错配和与2个HLA-A,B,C等位基因错配与低的累积复发率和改善的EFS密切相关,DQ抗原错配无此影响 KIR基因分型的价值:在未去T细胞的AML移植中供者为B/x单倍型的OS显著高于A/A.因此,KIR基因分型
8、应该加入到供者选择的标准中,未来应用KIR-B单倍体的亚型分类可更精确的选择供者 抗HLA抗体检测:如为抗供者的特异性抗体应进行相应处理后再接受移植 北大人民医院推荐单倍体移植供者选择考虑因素:子女首选，父亲好于母亲，同胞兄长、年龄、NIMA相合Clinical outcomes of allo-HSCT from matched or mismatched URDAML (n=359)ALL (n=275)CML (n=200)P vlaueOS62.5%(226/359)53.5%(150/275)79.2%(158/200)0.003HLA match68.6%(103/150)61.1
9、%(71/117)81.2%(67/82)0.098HLA mismatch58.8%(123/209)50.3%(79/158)77.5%(91/118)0.035Relapse9.7%(35/359)10.5%(29/275)2.0%(4/200)HLA match11.3%(17/150)11.1%(13/117)1.2%(1/82)HLA mismatch8.6%(18/209)10.1%(16/158)2.5%(3/118)P value0.390.790.51TRM16.2%(58/359)25.8%(71/275)17.5%(35/200)HLA match13.3%(20/15
10、0)23.9%(28/117)14.6%(12/82)HLA mismatch18.2%(38/209)27.2%(43/158)19.5%(23/118)P value0.220.540.37aGVHD46.2%(166/359)47.6%(131/275)49.0%(98/200)HLA match42.0%(63/150)40.2%(47/117)41.5%(34/82)HLA mismatch49.3%(103/209)53.2%(84/158)54.2%(64/118)P value0.170.030.08根据根据20102010年中华骨髓库随访数据总结年中华骨髓库随访数据总结可允许
11、和不允许可允许和不允许HLA高分辨等位基因和抗原错配类型高分辨等位基因和抗原错配类型 中华骨髓库非血缘中华骨髓库非血缘HSCT的的3年随访数据总结年随访数据总结 各种白血病接受等位基因或抗原错配无关供者allo-HSCT后1年和2年OS,以及aGVHD,cGVHD存在差异,因此,需要根据疾病分型选择可允许错配类型 在AML,ALL中C*07:02与C*03:04抗原错配;在ALL,CML中涉及各种A*02:07等位基因错配,DR等位基因加DQ抗原错配;在ALL中2个等位基因错配,B*15:XX等位基因加Cw抗原错配;在AML,ALL中A*02:01与A*02:06等位基因错配;以及在所有白血病
12、中涉及B*39:XX等位基因的错配类型,是目前CMDP随访数据中可考虑为不允许错配类型,并影响移植的预后Part 抗抗HLA抗体检测的临床意义抗体检测的临床意义NMDP在脐血或错配无关供者在脐血或错配无关供者HSCT中需要检测中需要检测HLA抗体抗体 抗体阴性组,NDSA组,DSA组的粒系重建率分别是83%,73%,32%(P0.0001)抗体阴性组,NDSA组,DSA组的血小板重建率分别是72%,60%,33%(P=0.0036)抗体阴性组,NDSA组,DSA组的2年EFS分别是43%,29%,15%(P=0.0001)抗体阴性组,NDSA组,DSA组的2年OS分别是57%,50%,31%(
13、P=0.030)Takanashi et al.The impact of anti-HLA antibodies on unrelated cord blood transplantations.Blood,2010,116:2839-2846预存预存HLA抗体对单份脐血移植后造血重建的影响抗体对单份脐血移植后造血重建的影响 移植前预存抗MICA抗体延缓脐血移植后患者巨核系重建时间 移植前预存抗HLA抗体,特别是HLA-类抗体导致脐血移植后患者aGVHD发生率升高 移植前预存抗HLA抗体患者的生存率降低 Ansari et al.The clinical relevance of pre-F
14、ormed anti-HLA and antiMICA antibodies after cord bood transplantation in Children.PLoS ONE.2013;8(8):e72141.预存预存HLA抗体对儿童脐血移植预后的影响抗体对儿童脐血移植预后的影响抗抗HLA抗体检测在儿童移植再障移植中的意义抗体检测在儿童移植再障移植中的意义 移植前预存HLA抗体是判断HSCT预后的独立危险因素 移植前预存HLA-类抗体影响HSCT的长期生存率,而HLA-类抗体与抗体阴性相比无差异 移植前预存低滴度HLA-类抗体,特别是HLA-A和C抗体影响HSCT的生存率 在MUD-H
15、SCT的恶性血液病患者,36.5%患者预存抗HLA抗体,HLA-I类,类,I和类均阳性患者比例分别为13.%,4.3%,19.1%预存抗HLA抗体阳性组中女性患者比例为57.1%,高于阴性组(27.4%),差异具有统计学意义.移植后血小板重建时间预存抗HLA抗体阳性组和阴性组患者分别为平均13天(7-43)和14天(11-35),差异具有统计学意义.-度aGVHD的发生率在抗HLA阳性组和阴性组之间的差异有统计学意义(40.0%VS 22.2%,P=0.023).2年总生存率(OS)预存抗HLA抗体阳性组患者低于阴性组患者(66.6%VS 83.6%,P=0.04),差异有统计学意义;但是2年
16、无病生存率(DFS)的差异无统计学意义(82.5%VS 93.1%,P=0.085);移植后复发率,移植相关并发症发生率无差异.预存抗预存抗HLA抗体在成人无关供者全相合抗体在成人无关供者全相合HSCT中的意中的意义义 患者张XX，女性，10岁，汉族，学生 患者于2014年02月22无明显诱因发热，体温最高39度，伴咽痛，无咳嗽咳痰，伴全身散在性出血点，血常规：白细胞 2.2109/L，血红蛋白64g/L，血小板2109/L。形态学：骨髓有核细胞增生减低，全片未见巨核细胞，血小板少见；AA免疫分型提示CD3+CD8+达30.6%；自身抗体检测：粒系CD15，73.5%阳性，干系CD34，50.
17、0%阳性，红系阳性 15.1%；CMV和EBV的DNA检测均为阴性。患者明确诊断为急性重型再生障碍性贫血I型（SAA-I型）。入院后予以输注血小板，G-CSF、TPO等刺激造血及对症支持后血象改善不明显。患者有异基因造血干细胞移植适应症，但无同胞供体，家属选择行双份脐血造血干细胞移植。病例分析-本院移植中心HLA高分辨高分辨基因分型基因分型双份脐血低分辨相合，高分辨结果分析是与父亲一条单倍型相同 患者2014-3-17开始FC+ATG方案预处理,GVHD预防采用CsA+短程MTX方案;患者移植前检测抗HLA-I类抗体阳性(MFI值 537-2678),移植前-3天开始予大剂量静脉丙球(0.4g
18、/kg3d)输注-阻断抗体介导的淋巴毒反应;03-26回输双份脐血(血型相同):第一份有核细胞数 12.01108,CD34+细胞数 21.64105;第二份:有核细胞数 8.54108，CD34+细胞数 6.83105,细胞活力 87.2%。移植后造血重建延缓,+26天粒系重建,血小板持续低于20109/L,未脱离输注;+29天复查骨穿:骨髓增生活跃,粒系占29.5%,红系占62.5%,全片未见巨核细胞;PB-STR 95.9%;移植后+21天检测HLA-类抗体仍阳性(MFI值551-1460);+30天予美罗华200mg治疗一次,+36天血小板回升至97109/L;移植后2个月复查抗体转变
19、为阴性动态检测抗动态检测抗HLA抗体的结果分析抗体的结果分析检测时间 抗体类型 抗体的MFI值 治疗2014-3-3移植前HLA-I类抗体阳性 其中A2抗体阳性 3047静脉丙球2014-4-16移植后20天HLA-I类抗体阳性 新增B48,B37,B27,B7,B41,B47,B57,B61,A3,A22780,2314;1194-1813美罗华2014-4-30移植后34天HLA-I类抗体可疑阳性 572,3392014-5-14移植后60天抗体转变为阴性抗体清除常用的治疗措施抗体清除常用的治疗措施 移植前预存抗HLA抗体是影响造血干细胞植入和造血重建时间延缓及存活最重要因素之一；对移植前
20、预存HLA抗体阳性患者，可采取相应的预处理治疗措施：n 抑制或清除B细胞或浆细胞，如利妥昔单抗、硼替佐米；n 清除循坏抗体，如血浆置换、免疫吸附、供者来源的新鲜血小板输注；n 阻断已生成抗体介导的淋巴毒反应，如静脉注射免疫球蛋白；n 抑制T/B细胞作用，如抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞抗体等在在allo-HSCT中遴选供受者的推荐流程中遴选供受者的推荐流程病人病人:HLA-A,B,C,DRB1,DQB1高分辨基因分型高分辨基因分型供体供体亲缘供者亲缘供者非亲缘供者非亲缘供者中华骨髓库中华骨髓库脐带血库脐带血库HLA中分辨相合中分辨相合供者供者HLA-A,B,C,DRB1,DQB1高分辨确认分型高
21、分辨确认分型HLA高高/低分辨相合低分辨相合HLA低分辨低分辨4/64/6相合相合单倍型相同单倍型相同筛选供者筛选供者:HLA中分辨基因分型中分辨基因分型检索供者检索供者针对各种白血病分型进行供受者针对各种白血病分型进行供受者HLA等位基因错配分等位基因错配分析析,增加检测受者增加检测受者HLA抗体和抗体和供受者的供受者的KIR基因分型基因分型URD:HLA-8,9/10MM;RD:HLA-5/10以上以上MM选择可允许选择可允许HLA错配位点错配位点,DSA阴性阴性,KIR-B/x分型等因素分型等因素首选亲缘或无关全相合供者移植首选亲缘或无关全相合供者移植最快选择到最佳供者最快选择到最佳供者
22、选择最合适选择最合适的错配供者的错配供者综合判断综合判断Part HLA配型实验室为何进行配型实验室为何进行ASHI认证认证 ASHI(美国组织相容性和免疫遗传学会)是世界范围内该领域权威认证机构,按照国际标准从事临床移植相关领域的实验室必须取得相关领域的认证资质 ASHI认证委员会组织全世界该领域的专家制定了一套完善的质量控制标准是帮助实验室减少发生差错的几率和提高HLA基因分型的质量,并且每年都对该标准进行更新 实验室在进行ASHI认证的过程中本身就是一个不断学习和提高的过程,对于实验室的进步和发展起决定性的推动作用,并且每2年重新认证对实验室保持高水准至关重要 实验室出具的HLA基因分型
23、报告单可被中外移植机构认可,如NMDP,德国骨髓库,香港等医院ASHI认证实验室为临床提供最好的服务认证实验室为临床提供最好的服务 从临床申请HLA配型报告单开始,以及样本到达实验室后每一个实验技术平台都有严格的质量控制体系,从而可保证HLA基因分型结果的准确性 严格按照SOP文件及与临床移植中心的协议,在规定的时间内最快完成HLA基因分型 对于临床危重患者(如重AA),按照加急标本进行处理,不需要临床另行申请 为所有在本实验室进行HLA基因分型的患者,在HSCT前(包括无关和亲缘)均提供二次免费复核,已免费复核一千例以上 对HLA基因分型报告单结果进行单倍型分析,匹配度,Code码注,解释和
24、备注,对一些需要临床引起特别重视的内容加黑和加线标注,对特别情况及时打电话通知临床重视 HLA基因分型报告单送至临床有登记,重打报告单有记录,避免产生医疗纠纷.延误或超过TAT规定的时间,需向临床说明 为临床提供免费的为临床提供免费的HLA咨询服务咨询服务 在异基因HSCT中对无关供者和患者提供HLA可允许错配分析的咨询服务-包括CMDP,北京,天津,广州,江苏,上海等地患者 对脐血移植备选供者的选择-包括安徽,上海,苏州儿童医院等地患者 对亲缘单倍体HSCT备选供者的选择-苏州大学附属第一医院和儿童医院的患者 初步制定各种在allo-HSCT中遴选供者的推荐策略流程图,对于一些中外文献报道中已明确的不允许错配类型进行排序,以便临床更好的理解和遴选供者
