1、生物样品的预处理生物样品的预处理 江南江南大学生物工程学大学生物工程学院院2 2 生物样品的预处理生物样品的预处理概述概述不同来源样品分离的预处理不同来源样品分离的预处理细胞的破碎与分离细胞的破碎与分离沉淀技术沉淀技术2.1 2.1 概述概述 选材选材 提取（预处理）提取（预处理）分离纯化分离纯化浓缩、结晶、干燥浓缩、结晶、干燥 保存保存来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少少将目的物从材料中以溶解状态释放将目的物从材料中以溶解状态释放出来，方法与存在部位及状态出来，方法与存在部位及状态有关有关核心操作，须根据目的物的核心操作，须根据目的物的理化理化及生物学及生
2、物学性质及具体条件确定性质及具体条件确定整个整个过程应有快速灵敏准过程应有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果确的分析方法来衡量效果（回收率（回收率、纯度）、纯度）生化分离基本步骤生化分离基本步骤选材的重要性之案例：青蒿素的提取选材的重要性之案例：青蒿素的提取中药青蒿的植物来源中药青蒿的植物来源中华人民共和国药典中华人民共和国药典一九七七年一九七七年前版均规定为菊科植物黄花蒿（前版均规定为菊科植物黄花蒿（ArtemesiaArtemesia annuaannua）及青蒿及青蒿（A.A.apiaceaapiacea），二者的亲脂性化合物成分存在很大差异，），二者的亲脂性化合物成分存在很大差异，A.A
3、.annuaannua具抗疟成分青蒿素，而在具抗疟成分青蒿素，而在A.A.apiaceaapiacea中则无此成分中则无此成分因而无抗疟作用因而无抗疟作用本草纲目中的附图本草纲目中的附图2.2 2.2 不同来源样品分离的预处理不同来源样品分离的预处理样品来源：植物、动物、微生物，例如：植物或动样品来源：植物、动物、微生物，例如：植物或动物的细胞培养液、微生物发酵液、动物血液、乳液物的细胞培养液、微生物发酵液、动物血液、乳液和动植物组织器官提取液等。和动植物组织器官提取液等。生物样品中往往含有大量有机物、无机物及各种微生物样品中往往含有大量有机物、无机物及各种微量元素等，因此量元素等，因此将目标
4、物释放到溶液中，对其进行将目标物释放到溶液中，对其进行初步富集和分离，对干扰组分进行初步去除初步富集和分离，对干扰组分进行初步去除等工作等工作都属于预处理。都属于预处理。生物样品的特征生物样品的特征目标产物目标产物浓度普遍较低浓度普遍较低，悬浮液大部分是，悬浮液大部分是“水水”，组分复杂组分复杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、，是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类、无机盐类等多种物质的混合物；脂类、糖类、无机盐类等多种物质的混合物；分离过程很容易发生分离过程很容易发生失活失活现象，现象，pHpH、离子强度、温、离子强度、温度等变化常常造成产物的失活；度等变化常常造成产物的失活；
5、性质不稳定，性质不稳定，易随时间变化易随时间变化，如受空气氧化，微生，如受空气氧化，微生物污染，蛋白水解作用等。物污染，蛋白水解作用等。2.2.1 2.2.1 植物组织中活性物质的提取植物组织中活性物质的提取植物组织中所存在的植物组织中所存在的酚类化合物酚类化合物使植物中提取生物大分使植物中提取生物大分子的过程变得复杂。子的过程变得复杂。植物组织被破坏时，蛋白质等大分子和酚类处混合接触植物组织被破坏时，蛋白质等大分子和酚类处混合接触状态，很易发生反应。酚类氧化产物醌类和单宁酸类会状态，很易发生反应。酚类氧化产物醌类和单宁酸类会继续和蛋白质反应继续和蛋白质反应,使目的蛋白失去活性。为此去除酚使目
6、的蛋白失去活性。为此去除酚类化合物或避免反应是必须进行的步骤。类化合物或避免反应是必须进行的步骤。在提取酶、核酸、多糖等生物大分子时，其他大分子的在提取酶、核酸、多糖等生物大分子时，其他大分子的存在会对提取产生干扰，需要有效手段去除。存在会对提取产生干扰，需要有效手段去除。预处理需要注意预处理需要注意温度尽可能低温度尽可能低提取液的量要保证提取液的量要保证“充分浸入充分浸入”加入足量加入足量酚类吸附剂酚类吸附剂加入足量加入足量氧化酶抑制剂氧化酶抑制剂搅拌转速要恰当搅拌转速要恰当pHpH要控制在合适范围，一般要控制在合适范围，一般5.55.57 7 酚类吸附剂的种类酚类吸附剂的种类聚乙烯吡咯烷酮
7、聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（可溶的（PVPPVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮）和聚乙烯聚吡咯烷酮-不溶的（不溶的（PVPPPVPP）：）：PVPPVP和和PVPPPVPP中的中的COCON N基有很基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强合物中芳环羟基数量的增加而加强聚乙烯和聚丙烯树脂，如离子交换树脂聚乙烯和聚丙烯树脂，如离子交换树脂XAD-2XAD-2、-4-4和和-7-7聚苯乙烯的离子交换树脂，包括阴离子交换树脂（聚苯乙烯的离子交换树脂，包括阴离子交换树脂（Bio-Bio-Rad AG1-X8,AG2-X8Rad
8、AG1-X8,AG2-X8和和Dowex-1Dowex-1）和阳离子交换树脂）和阳离子交换树脂（Dowex-50Dowex-50）TrisTris-硼酸硼酸 硼酸可与酚类靠氢键形成复合物，抑制了酚类物质的硼酸可与酚类靠氢键形成复合物，抑制了酚类物质的氧化及其与生物分子的结合氧化及其与生物分子的结合 牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSABSA）法）法 原花色素类物质与原花色素类物质与BSABSA间可产生类似于抗原抗体间间可产生类似于抗原抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与了原花色素类物质与RNARNA结合的机会结合的机
9、会 其他聚合物如尼龙粉其他聚合物如尼龙粉氧化酶抑制剂的种类氧化酶抑制剂的种类抗氧化剂：抗氧化剂：2-2-巯基乙醇，二硫苏糖醇巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)(DTT)，二硫赤藓，二硫赤藓糖醇糖醇(DTE)(DTE)，半胱氨酸，半胱氨酸(CysCys)，抗坏血酸盐，抗坏血酸盐前三种既是多酚氧化酶的抑制剂又是醌的清除剂前三种既是多酚氧化酶的抑制剂又是醌的清除剂抗坏血酸盐在低浓度的醌存在下就很易被消耗，因此抗坏血酸盐在低浓度的醌存在下就很易被消耗，因此须在相对较高的浓度条件下使用（须在相对较高的浓度条件下使用（50 50 mmolmmol/L/L）硼氢化钠（硼氢化钠（NaBHNaBH4 4）是还原剂，
10、可以还原醌）是还原剂，可以还原醌2.2.2 2.2.2 动物组织预处理注意事项动物组织预处理注意事项 匀浆前的预处理匀浆前的预处理 (冷冻冷冻)提取缓冲液的选择提取缓冲液的选择(缓冲物质、缓冲物质、pHpH、离子强度、离子强度)蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂的添加的添加 蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶（如弹性蛋白酶，凝血酶，蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶（如弹性蛋白酶，凝血酶，枯草杆菌蛋白酶，胰蛋白酶等），天冬氨酸蛋白酶，半枯草杆菌蛋白酶，胰蛋白酶等），天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶四个家族，各有对应的抑制胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶四个家族，各有对应的抑制剂，如常用的苯甲基磺酰氟（剂，如常用的苯甲基磺酰氟
11、（PMSFPMSF）是丝氨酸蛋白酶）是丝氨酸蛋白酶的抑制剂的抑制剂保护剂的添加保护剂的添加(-(-巯基乙醇、巯基乙醇、EDTAEDTA、辅酶等、辅酶等)提取液的澄清提取液的澄清 (高速离心、沉淀、吸附等高速离心、沉淀、吸附等)2.2.3 2.2.3 微生物物质的提取制备微生物物质的提取制备各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。预处理方法的选择也有所不同。有的发酵产物存在于发酵液中，也有的产物存在于菌有的发酵产物存在于发酵液中，也有的产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。体中，或发酵液和菌体中都含有。对于对于胞
12、外产物胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到，经预处理应尽可能使目的产物转移到液相，然后经固液分离除去固相；液相，然后经固液分离除去固相；对于对于胞内产物胞内产物，则应首先收集菌体或细胞，经细胞破，则应首先收集菌体或细胞，经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎片分离。碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎片分离。2.2.3.1 2.2.3.1 微生物发酵液预处理微生物发酵液预处理主要包括主要包括（1 1）发酵液杂质的去除）发酵液杂质的去除（2 2）改善发酵液的处理性能）改善发酵液的处理性能（1 1）发酵液杂质的去除）发酵液杂质的去除发酵液成分复杂，对提取影响较大的是高价无机离子、发
13、酵液成分复杂，对提取影响较大的是高价无机离子、杂蛋白和色素物质，影响后期离子交换、萃取、膜过滤、杂蛋白和色素物质，影响后期离子交换、萃取、膜过滤、测定等测定等无机离子的去除无机离子的去除u钙离子：加入草酸形成沉淀，酸化发酵液，草酸钙还钙离子：加入草酸形成沉淀，酸化发酵液，草酸钙还能促使蛋白质凝固能促使蛋白质凝固u镁离子：加入三聚磷酸钠可与之形成可溶性络合物，镁离子：加入三聚磷酸钠可与之形成可溶性络合物，可不再干扰离子交换可不再干扰离子交换u铁离子：加黄血盐使其形成普鲁士蓝沉淀铁离子：加黄血盐使其形成普鲁士蓝沉淀可溶性蛋白质的去除可溶性蛋白质的去除u盐析盐析u等电点沉淀等电点沉淀u加热法加热法u
14、有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法u吸附法吸附法u其它沉淀法其它沉淀法有色物质的去除：常用脱色方法为吸附法，如活性炭有色物质的去除：常用脱色方法为吸附法，如活性炭吸附、树脂吸附等吸附、树脂吸附等（2 2）改善发酵液的处理性能）改善发酵液的处理性能细菌及某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，往细菌及某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，往往不能直接过滤，直接用离心法除菌体，则能耗往不能直接过滤，直接用离心法除菌体，则能耗很大，应用微滤的方法，又容易产生膜堵塞。很大，应用微滤的方法，又容易产生膜堵塞。需要通过一些简单手段需要通过一些简单手段降低发酵液粘度降低发酵液粘度，改善处，改善处理性能。理性能。降低发酵液的
15、粘度的方法降低发酵液的粘度的方法加热法加热法加水稀释法加水稀释法调节调节pHpH值值 因因pHpH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，通过调节性质，通过调节pHpH值可以改善过滤特性。值可以改善过滤特性。细胞絮凝技术细胞絮凝技术u絮凝指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，絮凝指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。集合为主的过程。u通常需控制通常需控制絮凝剂浓度絮凝剂浓度保持在较窄的范围内保持在较窄的范围内,如胶体如胶体的颗粒表面吸附大量的
16、高分子物质的颗粒表面吸附大量的高分子物质,反而会在表面形反而会在表面形成空间保护层。成空间保护层。絮凝剂分类絮凝剂分类无机絮凝剂无机絮凝剂 无机盐类絮凝剂无机盐类絮凝剂(如硫酸铝、硫酸亚铁、氯化铝等如硫酸铝、硫酸亚铁、氯化铝等)无机高分子絮凝剂无机高分子絮凝剂(如聚合氯化铝、聚合铝铁等如聚合氯化铝、聚合铝铁等)有机絮凝剂有机絮凝剂 天然高分子絮凝剂天然高分子絮凝剂(如淀粉的改性产物如淀粉的改性产物)人工合成高分子絮凝剂人工合成高分子絮凝剂 (如阳离子聚丙烯酰胺如阳离子聚丙烯酰胺)无机与有机复合絮凝剂往往效果更好无机与有机复合絮凝剂往往效果更好微生物絮凝剂具较好发展潜力，主要以多糖、微生物絮凝剂
17、具较好发展潜力，主要以多糖、多聚氨基酸或糖蛋白为主，还有少量的多聚氨基酸或糖蛋白为主，还有少量的DNADNA和和脂类絮凝剂脂类絮凝剂絮凝效果与加入量、分子量和类型，溶液的絮凝效果与加入量、分子量和类型，溶液的pHpH值、搅拌速率和时间等因素有关值、搅拌速率和时间等因素有关絮凝机理絮凝机理（1 1）胶体理论）胶体理论 细菌可看做胶粒，因细胞表面的极性基团引起的表面细菌可看做胶粒，因细胞表面的极性基团引起的表面吸附吸附（2 2）高聚物架桥理论）高聚物架桥理论 细胞表面分泌的高聚物形成的胞外纤丝通过架桥交联细胞表面分泌的高聚物形成的胞外纤丝通过架桥交联而使细胞絮凝而使细胞絮凝（3 3）双电层理论）双
18、电层理论 细胞表面本身有电荷，加入的电解质的排斥作用而促细胞表面本身有电荷，加入的电解质的排斥作用而促使细胞产生聚并作用使细胞产生聚并作用2.2.3.2 2.2.3.2 大肠杆菌重组蛋白的提取制备大肠杆菌重组蛋白的提取制备多拷贝质粒上强启动子过量表达重组蛋白质使整个细多拷贝质粒上强启动子过量表达重组蛋白质使整个细胞的蛋白质表达水平提高，但大多情形下会导致诸如胞的蛋白质表达水平提高，但大多情形下会导致诸如包含体的不溶性蛋白聚集的形成包含体的不溶性蛋白聚集的形成重组菌重组菌E.coli M15(pQE32-AGN)外源基因的诱导表达外源基因的诱导表达(A未诱导，未诱导，B诱导诱导)重组蛋白的提取步
19、骤重组蛋白的提取步骤大肠杆菌的酶解大肠杆菌的酶解 采用溶菌酶或超声破碎方法来破壁采用溶菌酶或超声破碎方法来破壁包含体的清洗包含体的清洗 用溶剂清洗包含体能进一步除去杂蛋白用溶剂清洗包含体能进一步除去杂蛋白从包含体中溶解重组蛋白（变性）从包含体中溶解重组蛋白（变性）选择和优化溶解液（一般为尿素和盐酸胍），使包含选择和优化溶解液（一般为尿素和盐酸胍），使包含体中重组蛋白溶解体中重组蛋白溶解重组蛋白的复性重组蛋白的复性 稀释法、透析法、层析法、分子伴侣等稀释法、透析法、层析法、分子伴侣等2.3 2.3 细胞的破碎与分离细胞的破碎与分离细胞的破碎细胞的破碎 用一定方法（用一定方法（机械法、物理法、化学
20、法、酶法机械法、物理法、化学法、酶法等）打等）打开开细胞壁或膜细胞壁或膜，使细胞内含物有效地释放出来，使细胞内含物有效地释放出来提取提取 目的物从胞内转移到外界溶液中。目的物从胞内转移到外界溶液中。2.3.1 2.3.1 细胞的破碎方法细胞的破碎方法2.3.1.1 2.3.1.1 机械法机械法 原理：机械运动产生原理：机械运动产生剪切力剪切力的作用破细胞的作用破细胞组织捣碎组织捣碎利用高速旋转的叶片所产生利用高速旋转的叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎的剪切力将组织细胞破碎（1000020000 r/min1000020000 r/min）适用：动植物组织适用：动植物组织DS-1高速组织捣碎高速
21、组织捣碎机机(常用于实验室规模常用于实验室规模)笼式笼式粉碎机（工业规模）粉碎机（工业规模）原理图原理图高速匀浆法高速匀浆法特点特点 相对温和相对温和，其机械剪切力对生物大分子的破坏较，其机械剪切力对生物大分子的破坏较少，少，处理量大处理量大原理原理 利用高压使细胞悬浮液通过针性阀，由于突然减利用高压使细胞悬浮液通过针性阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂压和高速冲击撞击环使细胞破裂适用适用 较柔软、易分散的组织细胞较柔软、易分散的组织细胞高速匀浆法为大规模细胞破碎的常用方法，设备高速匀浆法为大规模细胞破碎的常用方法，设备由高压泵和匀浆阀组成由高压泵和匀浆阀组成高压匀浆阀的结构高压匀浆阀
22、的结构 不同规格的高速匀浆机不同规格的高速匀浆机研磨法与珠磨法研磨法与珠磨法研磨法研磨法(实验室规模实验室规模)由陶瓷的研钵和研杆组成，加入少量研磨剂（如精制由陶瓷的研钵和研杆组成，加入少量研磨剂（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土）石英砂、玻璃粉、硅藻土）研磨？研磨？特点：费时费力，规模小特点：费时费力，规模小珠磨法珠磨法(工业规模工业规模)进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径砂、氧化铝等研磨剂（直径1mm1mg/ml1mg/ml（2 2）吸附法）吸附法目的物浓度目的物浓度1mg/ml1mg/ml时可用此法时可用此法（3
23、3）膜分离技术）膜分离技术超滤超滤属加压膜分离技术之一属加压膜分离技术之一（4 4）干胶溶涨法）干胶溶涨法加入具一定孔径微孔能吸水的凝胶，如葡聚糖凝胶、加入具一定孔径微孔能吸水的凝胶，如葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺方式：直接加入或在半透膜外吸收方式：直接加入或在半透膜外吸收（5 5）多聚物吸水法）多聚物吸水法PEGPEG、PVPPVP、CMCCMC等具强大吸水力，可在半透膜等具强大吸水力，可在半透膜外吸收外吸收（6 6）减压蒸馏（真空旋转浓缩）减压蒸馏（真空旋转浓缩）2.4 2.4 沉淀技术沉淀技术2.4.1 2.4.1 概念和分类概念和分类概念概念 溶液中溶质由液相变成固相析出的过程溶液
24、中溶质由液相变成固相析出的过程本质本质 通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在液相中的溶通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在液相中的溶解度，增加了固相中的分配率解度，增加了固相中的分配率作用作用 分离、澄清、浓缩、保存分离、澄清、浓缩、保存沉淀方法分类沉淀方法分类盐析盐析有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀等电点沉淀等电点沉淀其他沉淀技术其他沉淀技术 非离子聚合物沉淀非离子聚合物沉淀 生成盐复合物生成盐复合物 选择性变性选择性变性 亲和沉淀亲和沉淀2.4.2 2.4.2 盐析盐析2.4.2.1 2.4.2.1 原理原理“盐溶盐溶”低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水
25、活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其溶解度增大。作用力，使其溶解度增大。“盐析盐析”中性盐浓度增加至一定值时，水分子定中性盐浓度增加至一定值时，水分子定向排列，活度大大减少，蛋白质表面电荷被中和，向排列，活度大大减少，蛋白质表面电荷被中和，水膜被破坏，从而聚集沉淀。水膜被破坏，从而聚集沉淀。影响盐析的因素影响盐析的因素盐离子种类和浓度盐离子种类和浓度生物分子种类和浓度生物分子种类和浓度pHpH值值温度温度2.4.2.2 2.4.2.2 公式和讨论公式和讨论纯蛋白质有盐析经验公式：纯蛋白质有盐析经验公式：Log S=Log S=k kS SI I
26、 S S蛋白质溶解度（蛋白质溶解度（g/Lg/L）；）；I=0I=0时时logSlogS，取决于，取决于PrPr的性质，温度，的性质，温度，pHpH；k kS S盐析常数，取决于加入盐的性质及盐析常数，取决于加入盐的性质及PrPr性质；性质；I I盐浓度（盐浓度（mol/Lmol/L）（通常不太用离子强度，高盐浓度下不易计算）（通常不太用离子强度，高盐浓度下不易计算）I单纯单纯PrPr的盐析的盐析1 1k kS S I I的变化（的变化（k kS S盐析盐析）盐、盐、PrPr一定，一定，k kS S值一定，值一定，I I 增加则增加则S S减小减小 2 2降低降低（盐析盐析）与与PrPr、温度
27、、温度、pHpH有关有关upHpH：在：在PrPr的的pIpI时其溶解度较小时其溶解度较小u温度：在保证温度：在保证PrPr不变性的条件下，温度升高不变性的条件下，温度升高 下下降利于盐析降利于盐析u在不改变在不改变I I的情况下改变的情况下改变pHpH或温度将或温度将PrPr沉淀沉淀3 3原始浓度原始浓度P PP P小则盐析所需小则盐析所需I I高，高，P P大则盐析所需大则盐析所需I I低低 *对混合对混合PrPr的盐析，的盐析，P P大，会发生严重共沉作用，大，会发生严重共沉作用，一般控制浓度为一般控制浓度为2.53%2.53%混合混合PrPr的盐析的盐析1 1合适盐析范围的选择合适盐析
28、范围的选择 不同不同PrPr盐析峰有重叠，须权衡纯度和回收率盐析峰有重叠，须权衡纯度和回收率2 2改变原始浓度改变原始浓度 一种蛋白质在不同浓度下的沉淀曲线会变化一种蛋白质在不同浓度下的沉淀曲线会变化3 3二次盐析二次盐析 在原盐浓度下二次盐析，可除去易溶杂质，但不在原盐浓度下二次盐析，可除去易溶杂质，但不能除去难溶杂质能除去难溶杂质二次盐析除去易溶物二次盐析除去易溶物2.4.2.3 2.4.2.3 盐析操作要点盐析操作要点（1 1）盐的种类及选择）盐的种类及选择可使用的中性盐有：可使用的中性盐有：(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4 Na Na2 2SOSO4 4 MgSO MgSO4
29、4 NaClNaCl NaAcNaAc Na Na3 3POPO4 4 柠檬酸钠柠檬酸钠 等等以以(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4 Na Na2 2SOSO4 4最广泛，前者最受欢迎（原因？最广泛，前者最受欢迎（原因？缺陷？）缺陷？）蛋白质沉淀（盐析）效应增加阴离子：PO43,SO42,CH3COO,Cl,Br,NO3,ClO4,I,SCN阳离子：NH4+,Rb+,K+,Na+,Cs+,Li+,Mg2+,Ca2+,Ba2+蛋白质促溶（盐溶）效应增加 （2 2）盐析范围的确定）盐析范围的确定可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得（从回可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得（从回收率和
30、纯度考虑）收率和纯度考虑）（3 3）盐的加入方式）盐的加入方式固体：缓慢加，防泡沫，要平衡固体：缓慢加，防泡沫，要平衡液体（饱和盐溶液）：要求盐析范围小于液体（饱和盐溶液）：要求盐析范围小于50%50%饱和度饱和度 *盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加完后，应放置30min以上才可进行固-液分离确定盐析范围举例确定盐析范围举例试验组别饱和度范围酶沉淀(%)蛋白沉淀(%)纯化倍数ABC04040606080800454570700484865654623226904107515252232213238303525400.162.81.00.0950.192.40.130.293.00.3
31、8取小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围取小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围（4 4）PrPr的原始浓度的原始浓度太稀的蛋白质溶液，不仅消耗大量中性盐，对太稀的蛋白质溶液，不仅消耗大量中性盐，对PrPr回收也回收也有影响；高浓度可节约盐用量，但须适中，以避免共沉有影响；高浓度可节约盐用量，但须适中，以避免共沉（5 5）盐析操作的其他方法）盐析操作的其他方法透析盐析透析盐析 将将PrPr溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性变化，使于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性变化，使PrPr沉淀沉淀 特点反抽提法
32、（反抽提法（Back-ExtractionBack-Extraction）将包括要分离的将包括要分离的PrPr在内的多种在内的多种PrPr一起沉淀出来，一起沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物 特点（6 6）沉淀的再溶解）沉淀的再溶解将沉淀溶于下一步所需的缓冲液（将沉淀溶于下一步所需的缓冲液（1212倍）倍）2.4.2.4 2.4.2.4 脱盐脱盐透析透析 *容器尽可能大，低温、搅拌、常换液容器尽可能大，低温、搅拌、常换液 （旋转透析器、连续循环透析器）（旋转透析器、连续循环透析器）凝胶过滤层析凝胶过滤层析 此法脱盐时间短，效果好此法脱
33、盐时间短，效果好超滤超滤 膜分离技术根据所加操作压所用膜平均孔径的不同，膜分离技术根据所加操作压所用膜平均孔径的不同，可分为微滤、超滤、纳滤和反渗透。利用超滤法把大可分为微滤、超滤、纳滤和反渗透。利用超滤法把大分子中的小分子除去常用透滤模式。分子中的小分子除去常用透滤模式。水水2.4.3 2.4.3 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀2.4.3.1 2.4.3.1 基本原理基本原理 使溶液的介电常数大大降低，从而增加带电粒子自身使溶液的介电常数大大降低，从而增加带电粒子自身之间的作用力，易聚集沉淀；介之间的作用力，易聚集沉淀；介电常数与静电引力的电常数与静电引力的关系，可用库仑公式表示关系，可用库仑公式
34、表示:争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子，破坏水化层，争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子，破坏水化层，使分子易碰聚产生沉淀使分子易碰聚产生沉淀F=Q1Q2/2 2 有机溶剂水乙醇丙酮甲醇丙醇尿素（2.5mol/L）介电常数802422332384 相比较，有机溶剂脱水作用较静电作用占更主要的地位相比较，有机溶剂脱水作用较静电作用占更主要的地位 几种溶剂的介电常数几种溶剂的介电常数2.4.3.2 2.4.3.2 特点特点优点：优点：分辨能力比盐析高分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶即一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不
35、用脱盐，过滤比较容易析不用脱盐，过滤比较容易缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性变性失活失活，操作需在，操作需在低温下低温下进行进行2.4.3.3 2.4.3.3 沉淀条件沉淀条件温度温度 生物大分子在有机溶剂中对温度敏感，易变性，且有生物大分子在有机溶剂中对温度敏感，易变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应机溶剂与水混合时产生放热反应有机溶剂必须有机溶剂必须预先冷至较低温度预先冷至较低温度，一般在，一般在00以下，操以下，操作时要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢，并作时要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢，并不断搅拌不断搅拌以免局部浓度过
36、大以免局部浓度过大温度越低，得到的生物活性物质越多，而且可以减少温度越低，得到的生物活性物质越多，而且可以减少有机溶剂的挥发有机溶剂的挥发温差分级沉淀温差分级沉淀pHpH尽可能选择样品尽可能选择样品溶解度最低的溶解度最低的pHpH，通常是选在等电点，通常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力附近，以提高该沉析的分辨能力要选择在样品稳定的要选择在样品稳定的pHpH范围内，少数生物分子在等电范围内，少数生物分子在等电点附近不稳定，影响其活性点附近不稳定，影响其活性尽量避免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的尽量避免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的发生发生样品样品浓度浓度 样品浓度低时增加
37、有机溶剂投入量和损耗，降低了溶样品浓度低时增加有机溶剂投入量和损耗，降低了溶质回收率，易产生稀释变性，但共沉的作用小，有利质回收率，易产生稀释变性，但共沉的作用小，有利于提高分离效果于提高分离效果对于高浓度的生物样品，节省了有机溶剂，减少了变对于高浓度的生物样品，节省了有机溶剂，减少了变性的危险，但共沉作用大，分离效果下降性的危险，但共沉作用大，分离效果下降蛋白质蛋白质0.530.53，黏多糖，黏多糖1212离子强度离子强度在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小，物质在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小，物质不能沉析时，补加少量电解质即可解决不能沉析时，补加少量电解质即可解决离子强度达一
38、定程度时离子强度达一定程度时(0.1(0.10.2 mol/L0.2 mol/L以上以上)，会增加，会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度，需大量的有机溶蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度，需大量的有机溶剂来沉析，并可能使部分盐在加入有机溶剂后析出剂来沉析，并可能使部分盐在加入有机溶剂后析出一般离子强度在一般离子强度在0.05 mol/L0.05 mol/L或稍低为好，既能使沉析迅或稍低为好，既能使沉析迅速形成，又能对蛋白质或酶起一定的保护作用，防止速形成，又能对蛋白质或酶起一定的保护作用，防止变性变性多价阳离子的影响多价阳离子的影响某些金属离子具有助沉作用，某些金属离子具有助沉作用，蛋白质蛋白质与
39、与ZnZn2+2+、CaCa2+2+等等形成复合物形成复合物，使蛋白质在水和有机使蛋白质在水和有机溶溶液中的溶解度大液中的溶解度大大降低大降低而不影响生物活性，有利于沉析形成，并降低而不影响生物活性，有利于沉析形成，并降低有机溶剂的耗量有机溶剂的耗量0.0050.02 mol/L0.0050.02 mol/L的的ZnZn2+2+可使有机溶剂用量减少可使有机溶剂用量减少l/3l/3至至1/21/2使用时要避免会与这些金属离子形成难溶盐的阴离子使用时要避免会与这些金属离子形成难溶盐的阴离子(如磷酸根如磷酸根)的存在的存在有机溶剂的选择有机溶剂的选择 常用乙醇、丙酮、甲醇常用乙醇、丙酮、甲醇 溶剂用
40、量溶剂用量V=V0（S2S1）/（100S2）分级沉淀分级沉淀 2.4.4 2.4.4 等电点沉淀等电点沉淀2.4.4.1 2.4.4.1 原理原理等电点等电点(pIpI)是两性物质在其质点的净电荷为零时介质是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的的pHpH值，溶质值，溶质净电荷为零净电荷为零，分子间排斥电位降低，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低质的溶解度最低调节两性生化物质溶液的调节两性生化物质溶液的pHpH值，以达到某一生化物值，以达到某一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析出而实现分离的质的等电点，使
41、其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术技术称为等电点沉析技术2.4.4.2 2.4.4.2 注意事项注意事项等电点的改变等电点的改变目的物的稳定性目的物的稳定性盐溶作用盐溶作用pHpH的调节的调节2.4.4.3 2.4.4.3 应用应用在生化产品的分离纯化过程中，常利用两性物质如氨在生化产品的分离纯化过程中，常利用两性物质如氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等具有不同的等电点基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等具有不同的等电点的特性来进行产品的分离纯化的特性来进行产品的分离纯化等电点沉淀只适用于水化程度不大，在等电点时溶解等电点沉淀只适用于水化程度不大，在等电点时溶解度很低的物质度很低的物
42、质，如四环素等在等电点，如四环素等在等电点(pH=5.4)(pH=5.4)附近，附近，难溶于水，能产生沉析；疏水性较大的蛋白质（如酪难溶于水，能产生沉析；疏水性较大的蛋白质（如酪蛋白）蛋白）可以与其他沉淀方法结合使用可以与其他沉淀方法结合使用2.4.5 2.4.5 其他沉淀技术其他沉淀技术2.4.5.1 2.4.5.1 非离子多聚物沉淀法非离子多聚物沉淀法沉淀机理沉淀机理 基于体积不相溶性，即聚乙二醇（基于体积不相溶性，即聚乙二醇（PEGPEG）类型的分子）类型的分子从溶剂空间中排斥蛋白质，排斥体积与从溶剂空间中排斥蛋白质，排斥体积与PEGPEG分子大小分子大小的平方根有关，与被分离物质无关的
43、平方根有关，与被分离物质无关常用的非离子型聚合物有常用的非离子型聚合物有PEGPEG和和PVPPVP，PEGPEG按分子量按分子量大小常用的有大小常用的有PEG 2000PEG 2000、PEG 4000PEG 4000以及以及PEG 6000PEG 6000PEGPEG具有螺旋状的结构，亲水性强，有很广范围的分具有螺旋状的结构，亲水性强，有很广范围的分子量，结构式：子量，结构式：HO-(CHHO-(CH2 2-CH-CH2 2-O)-O)n n-H-H 低相对分子质量的聚合物无毒，所以在一些临床产品低相对分子质量的聚合物无毒，所以在一些临床产品的下游加工过程中被优先选用的下游加工过程中被优先
44、选用影响因素影响因素 PEGPEG及其他非离子多聚物的沉淀效果除与本身的浓度、及其他非离子多聚物的沉淀效果除与本身的浓度、分子大小有关外，还受离子强度、分子大小有关外，还受离子强度、pHpH和温度等因素的和温度等因素的影响影响2.4.5.2 2.4.5.2 选择性变性沉淀选择性变性沉淀热变性沉淀（适用于对热稳定的物质，注意防止目的热变性沉淀（适用于对热稳定的物质，注意防止目的物被酶降解）物被酶降解）pHpH变性沉淀（明确目的物酸碱稳定性，注意控制温度）变性沉淀（明确目的物酸碱稳定性，注意控制温度）有机溶剂变性沉淀有机溶剂变性沉淀2.4.5.3 2.4.5.3 生成盐类复合物沉淀生成盐类复合物沉
45、淀金属复合盐法金属复合盐法有机酸复合盐法有机酸复合盐法2.4.5.4 2.4.5.4 亲和沉淀亲和沉淀2.4.6 2.4.6 应用实例应用实例2.4.6.1 2.4.6.1 硫酸铵分级盐析分离血清中主要蛋白质硫酸铵分级盐析分离血清中主要蛋白质材料材料u新鲜动物血浆或血清（无溶血现象）：新鲜动物血浆或血清（无溶血现象）：100ml100mlu离心机、大烧杯（离心机、大烧杯（500ml500ml）、烧杯（）、烧杯（250ml250ml）u高精度高精度pHpH试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等upH7.2pH7.2饱和硫酸铵溶液饱和硫酸铵溶液u0.2mol/L pH7.
46、20.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液（的磷酸盐缓冲液（PBSPBS）清蛋白与球蛋白的分离清蛋白与球蛋白的分离取取100ml100ml血浆或血清置于血浆或血清置于500ml500ml烧杯中，加烧杯中，加PBS PBS 100ml100ml搅拌搅拌10min10min在搅拌下慢慢滴加在搅拌下慢慢滴加200ml pH7.2200ml pH7.2饱和硫酸铵溶液饱和硫酸铵溶液加完饱和硫酸铵溶液后继续搅拌加完饱和硫酸铵溶液后继续搅拌2030 min2030 min以充分沉以充分沉淀球蛋白淀球蛋白离心（离心（3500r/min3500r/min）20min20min，转移上清液（主要含清，转移上清液
47、（主要含清蛋白），沉淀中含有各种球蛋白蛋白），沉淀中含有各种球蛋白各种球蛋白的分离各种球蛋白的分离用用100ml PBS100ml PBS溶解上述沉淀中的各种球蛋白，并转移至溶解上述沉淀中的各种球蛋白，并转移至250ml250ml烧杯中搅拌烧杯中搅拌15min15min在搅拌下慢慢滴加在搅拌下慢慢滴加25ml25ml饱和硫酸铵溶液，饱和度达饱和硫酸铵溶液，饱和度达20%20%离心（离心（3500r/min3500r/min）20min20min，沉淀含少量纤维蛋白质，取，沉淀含少量纤维蛋白质，取上清液上清液上清液在搅拌下，慢慢滴加上清液在搅拌下，慢慢滴加1825ml1825ml饱和硫酸铵溶液，
48、饱和硫酸铵溶液，饱和度达饱和度达3033%3033%离心（离心（3500r/min3500r/min）20min20min得上清液（主要含得上清液（主要含-球蛋白和球蛋白和-球蛋白）和沉淀（主要含球蛋白）和沉淀（主要含-球蛋白和少量球蛋白和少量-球蛋白）球蛋白）取上一步的沉淀溶于取上一步的沉淀溶于PBSPBS中使体积达中使体积达100ml100ml并转移至并转移至250ml250ml烧杯中搅拌烧杯中搅拌15min15min在搅拌下，慢慢滴加在搅拌下，慢慢滴加4350ml4350ml饱和硫酸铵溶液，约达饱和硫酸铵溶液，约达3033%3033%饱和度饱和度离心（离心（3500r/min3500r/
49、min）20min20min得上清液（含得上清液（含-球蛋白）和球蛋白）和沉淀（主要含沉淀（主要含-球蛋白）球蛋白）取步骤取步骤5 5中上清液在搅拌下，慢慢滴加中上清液在搅拌下，慢慢滴加3540ml3540ml饱和硫饱和硫酸铵溶液，饱和度约达酸铵溶液，饱和度约达45%45%离心（离心（3500r/min3500r/min）20min20min得上清液（主要为得上清液（主要为-球蛋白）球蛋白）和沉淀（主要为和沉淀（主要为-球蛋白）球蛋白）2.4.6.2 2.4.6.2 乙醇沉淀法提取柑橘皮中的果胶乙醇沉淀法提取柑橘皮中的果胶材料材料新鲜柑橘皮新鲜柑橘皮50g50g正磷酸、正磷酸、0.2mol/L
50、0.2mol/L盐酸、焦磷酸钠（又称磷酸四钠）盐酸、焦磷酸钠（又称磷酸四钠）组织捣碎机、大烧杯（组织捣碎机、大烧杯（500mL500mL）、磁力搅拌器、）、磁力搅拌器、恒温水浴锅、搪瓷桶、酸度计、不锈钢锅恒温水浴锅、搪瓷桶、酸度计、不锈钢锅提取液分离提取液分离 将提取液加入将提取液加入1 1的硅藻土作助滤剂，然后送入板框压的硅藻土作助滤剂，然后送入板框压滤机，过滤后得无色透明的果胶稀溶液，滤渣弃去滤机，过滤后得无色透明的果胶稀溶液，滤渣弃去浓缩浓缩 将过滤收集的滤液置于真空浓缩装置中，于将过滤收集的滤液置于真空浓缩装置中，于7575温度温度下浓缩，直至浓缩到果胶浓度为下浓缩，直至浓缩到果胶浓度
