1、第九章第九章 有关微生物检测有关微生物检测(查查)的操作的操作二、细菌内毒素检查二、细菌内毒素检查 广州市医药中专学校广州市医药中专学校2005年年3月月凝胶凝胶 课件课件 总总 策划：策划：汪穗福汪穗福课件制作：课件制作：汪穗福、汪穗福、苏惠虹苏惠虹录像制作：李晓静录像制作：李晓静动画制作：白志明动画制作：白志明练习自测题制作：金丹练习自测题制作：金丹细菌内毒素检查技术细菌内毒素检查技术教学目的教学目的教学重点与难点教学重点与难点复习旧课复习旧课讲授新课讲授新课小结小结返回教学目的教学目的（一）认知领域方面（一）认知领域方面 1 1、了解细菌内毒素检查技术的发展、了解细菌内毒素检查技术的发展
2、状况状况 2 2、理解鲎试剂与细菌内毒素产生凝、理解鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理集反应的机理 3 3、懂得、懂得鲎试剂鲎试剂灵敏度复核的重要性、灵敏度复核的重要性、结果计算和结果判断结果计算和结果判断 4 4、学会灵敏度、学会灵敏度复核试验复核试验的的操作操作方法方法教学目的教学目的（二）（二）思想、素质教育方面：思想、素质教育方面：1.1.培养敬业爱业的职业道德与爱国精神，培养敬业爱业的职业道德与爱国精神，养成认真、负责、严谨、科学的学习和工养成认真、负责、严谨、科学的学习和工作态度作态度 2.懂得分析问题与解决问题的综合能力懂得分析问题与解决问题的综合能力返回教学重点与难点教学重点
3、与难点重点：重点：1.鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理机理2.复核试验的操作方法复核试验的操作方法难点：难点：1.复核试验的有关操作复核试验的有关操作2.结果计算和判断结果计算和判断返回复习旧课复习旧课、什么叫限度检查、什么叫限度检查?主要有主要有哪几种哪几种?、热原具有、热原具有-、-、-、-等性质等性质,通常可用通常可用-、-、-等等方法消除。方法消除。、热原家兔法检查结果判断、热原家兔法检查结果判断标准是标准是:返回讲授新课讲授新课细菌内毒素检查技术细菌内毒素检查技术细菌内毒素检查技术近细菌内毒素检查技术近2020多年来发展起来的一多年来发展起来的一门
4、新技术门新技术,它它系用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反系用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。否符合规定的一种方法。凝胶法凝胶法测定方法浊度法测定方法浊度法光度测定法光度测定法显色基质法显色基质法 中国药典中国药典规定：供试品检测时，可使用其中任何一规定：供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。以凝胶法结果为准。本节将详细介绍这两种方法的操作与有关原理。本节将详细介绍这两种方法的操作与有关原理
5、。一、一、内毒素与热原的关系内毒素与热原的关系 热原（热原（PylogenPylogen）指在临床上能使哺乳类动物产生热原反应的一类物质。细菌内毒素（细菌内毒素（EndotoXin）是G性细菌细胞壁的组成成分产物，当其死亡或菌体裂解时才释放出的一类具有多种生物活性的毒性物质，其化学结构是脂多糖（LPS）。具有耐热性强，能引起机体产生致热反应的特点。热原热原内毒素内毒素 药检的范畴药检的范畴,无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。热原。二、发展简况二、发展简况1.1.国外细菌内毒素检查的简况国外细菌内毒素检查的简况2.2.中国的研究应用概况中国的研究应用概
6、况:3.内毒素和鲎试剂反应的机理内毒素和鲎试剂反应的机理:4.鲎试剂灵敏度鲎试剂灵敏度5.5.细菌内毒素限值细菌内毒素限值():6.MVD 供试品的最大有效稀释倍数供试品的最大有效稀释倍数:7 7供试品溶液的制备供试品溶液的制备8.8.鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验材料材料1.1.历史回顾历史回顾 1942年年美国药典美国药典首先收载兔法检测热原首先收载兔法检测热原。1956年年,美国美国Bang发现发现鲎鲎注入注入G-菌引起血凝。菌引起血凝。1968年，美国年，美国Liven与与Bang创立了鲎试验方法创立了鲎试验方法 1973年，美国提取变形细胞溶解物制成鲎试剂，创年，美国提取变
7、形细胞溶解物制成鲎试剂，创造了检测微量内毒素的检测技术。造了检测微量内毒素的检测技术。1980年美国药典年美国药典20版收载了版收载了细菌内毒素检查方细菌内毒素检查方法法，但未在任何品种要求进行该项检查。，但未在任何品种要求进行该项检查。1984年年USP(第第4增补本增补本)，修定了，修定了细菌内毒素检细菌内毒素检查方法查方法，规定了，规定了40种放射性药品和种放射性药品和5种注射用水以种注射用水以细菌内毒素检查法代替热原检查法。细菌内毒素检查法代替热原检查法。1991年年USPUSP22版第版第5增补版公布了增补版公布了185种药品用细菌内种药品用细菌内毒素检查。毒素检查。第第23版则达版
8、则达471多种多种,到到19991999年年24版高达版高达670余种余种,而用家兔热原检查仅有而用家兔热原检查仅有2 20多种。多种。2000年国际调和委员会使美国药典（年国际调和委员会使美国药典（USP）、欧洲药）、欧洲药典（典（EP）和日本药局方（）和日本药局方（JP）达成）达成BET的国际调和案的国际调和案，统一的统一的BET已收栽已收栽于于USPXX版版NF19的第二增补本中，的第二增补本中，并于并于2001年年1月月1日生效。日生效。随后随后USPXX、USPXX、USPXX均正式收栽。均正式收栽。1987年欧洲药典收载了年欧洲药典收载了细菌内毒素检查方法细菌内毒素检查方法，199
9、81998年收载品种已达年收载品种已达100100多种。多种。1989年英国药典（年英国药典（JPJP）收载了该法，到）收载了该法，到1997年有年有40余余种用该法检查，种用该法检查，20002000版收载了版收载了147147种。种。1991年日本药局方也收载了该法，年日本药局方也收载了该法，1414药局方也超过药局方也超过200200多种。多种。返回2.2.中国的研究应用概况中国的研究应用概况：19781978年我国药检系统开始年我国药检系统开始研究鲎试验法研究鲎试验法。19831983年，开始组织了鲎试验标准化的研究，确立了生物活性年，开始组织了鲎试验标准化的研究，确立了生物活性效价单
10、位效价单位(内毒素单位内毒素单位EU)EU)表示的我国内毒素参考标准品；确定表示的我国内毒素参考标准品；确定了以此标准品了以此标准品10 EU/Kg10 EU/Kg为静脉注射药品的致热阈值为静脉注射药品的致热阈值(K)(K)。19881988年药典委员会指导制定了年药典委员会指导制定了细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法和鲎试和鲎试剂标准，作为剂标准，作为4 4种剂型注射液热原检查初试方法，种剂型注射液热原检查初试方法，1010月在全国试月在全国试行。行。19911991年年9 9月转为正式部标准。月转为正式部标准。19951995年版中国药典年版中国药典收载，规定收载，规定细菌内素检查品种细菌内
11、素检查品种1313个。个。20002000年版年版中国药典中国药典 （二部）做（二部）做了修订，收载了了修订，收载了细菌内素检查法应用原则细菌内素检查法应用原则，检查品种，检查品种6969种。种。中国药典中国药典(2005(2005年版年版)再次做了重大修订再次做了重大修订,（一部）（二部）（一部）（二部）（三部）均（三部）均收载了收载了细菌内素检查法细菌内素检查法，增修订检查品种达，增修订检查品种达112112种，其中（二部）就收载检查品种种，其中（二部）就收载检查品种186186种；种；（三部）收载检查品（三部）收载检查品种种1919种。种。细菌内毒素检查法发展趋势细菌内毒素检查法发展趋势
12、1国家药典收载成为发展的必然趋势国家药典收载成为发展的必然趋势 2内毒素检查法取代热原检查成为必然的方法内毒素检查法取代热原检查成为必然的方法 3走向统一的细菌内毒素检查法走向统一的细菌内毒素检查法 USP、EP和JP自2001年实现了统一。4.应用的方法越来越多应用的方法越来越多(1)方法多样化方法多样化 （2）方法自动化）方法自动化 （3）方法微量化）方法微量化 5应用的范围越来越广应用的范围越来越广细菌内毒素检查法概念:本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规菌内毒素，以判断供试品中
13、细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。定的一种方法。细细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。规定外，以凝胶法结果为准。细菌内毒素的量用内毒素单细菌内毒素的量用内毒素单位（位（EU）表示。）表示。细菌内毒素的化学结构和生物活性细菌内毒素的化学结构和生物活性 到目前为止，我们知道：细菌内毒素（Endotxin）是革
14、兰氏阴性细菌（GNB）细胞壁结构中的脂多糖（LPS）成分，具有多种生物活性。细菌内毒素作为G菌细胞壁外表层结构的一部分脂多糖（lipopolysacch aride,LPS）主要是由多糖O抗原，核心多糖和类脂A(Lipid A)三部分组成。见图所示：类脂A位于最多层。多糖抗原向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，具有特异性，核心多糖分为内核心及外核心，外核心由数种已糖，包括葡萄糖，半乳糖，乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖及特殊的KDO(3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖)。KDO以不耐酸的酮糖键与类脂A的氨基葡萄糖连接。所有G-菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖为单位。通过焦磷酸酯键
15、组成的一种独特的糖脂化合物细菌内毒素致病机理细菌内毒素致病机理 细菌内毒素与热原的关系细菌内毒素与热原的关系 热原（Pyrogen）是泛指在临床上能使哺乳动物体温升高的物质。热原与细菌内毒素的关系，热原不仅是内毒素，但在药检的范畴，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就控制热原。返回3.内毒素和鲎试剂的反应机理内毒素和鲎试剂的反应机理:以简式表示如下：以简式表示如下：内毒素内毒素 C C因子因子活化因子活化因子 旁路旁路 -或或 因子因子活化因子活化因子 -葡聚糖葡聚糖 凝固酶原凝固酶原凝固酶凝固酶 活化因子活化因子因子因子 （激活）（激活）凝固蛋白原凝固蛋白原 凝固蛋白
16、凝固蛋白 （酶解）（酶解）交联酶交联酶(聚合聚合)凝胶凝胶凝胶凝胶如图所示该反应出现凝胶为阳性；若无出现或凝胶脱落则为阴性返回4.4.鲎试剂灵敏度鲎试剂灵敏度(以以表示表示)是指在细菌内毒素检查的条件下(规定条件下)能检测出内毒素标准溶液或供品溶能检测出内毒素标准溶液或供品溶液中的液中的最低内毒素浓度最低内毒素浓度。(即能与鲎试剂发即能与鲎试剂发生阳性反应的最低浓度生阳性反应的最低浓度)。以。以EU/ml表示。表示。如如=0.5EU/ml；0.25EU/ml等等。返回5.细菌内毒素限值细菌内毒素限值():指哺乳动物指哺乳动物(或人或人)对药品中细菌内毒对药品中细菌内毒素所能耐受的不致于引起热原
17、反应的某素所能耐受的不致于引起热原反应的某定量限值的量单位称之。定量限值的量单位称之。为保证用药安全。给每一种药物规定为保证用药安全。给每一种药物规定了相应的限值了相应的限值,用用L表示。只要低于该限表示。只要低于该限值值,按规定给药途径用药就是安全的。按规定给药途径用药就是安全的。在进行检查时在进行检查时,首先要知道该品种的首先要知道该品种的L值值。确定药品品种确定药品品种L值的方法值的方法:.在药典正文中查出在药典正文中查出:各国药典规定作细菌内毒素检查项的品种，都各国药典规定作细菌内毒素检查项的品种，都可在药典正文中查到相应的可在药典正文中查到相应的L值。如值。如中国药典中国药典（200
18、5年版）（二年版）（二部）规定了部）规定了186种注射剂的种注射剂的L值值,（三部）规定了（三部）规定了19种注射种注射剂的剂的L值值;USPXXIV版规定了版规定了670种注射剂的种注射剂的L值。值。.根据人的最大用药剂量根据人的最大用药剂量计算而得计算而得:按公式按公式L=K/M确定。确定。式中式中L：供试品的细菌内毒素限值，以：供试品的细菌内毒素限值，以EUml,EUmg或或EUu表表示；示；K：按规定的给药途径，：按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时接受额定最大内毒素人体每公斤体重每小时接受额定最大内毒素剂量，以剂量，以Eu（kgh）。一般注射剂：）。一般注射剂：K=5EU/（kgh
19、）；放射性）；放射性药品注射：药品注射：K=2.5EU/（kg.h）；鞘内用注射剂：）；鞘内用注射剂：K=0.2Eu/（kg.h）。）。M：为人体每公斤体重每小时最大用药剂量，：为人体每公斤体重每小时最大用药剂量，以以ml（kg.h）,mg/(kg.h)或或u（kg.h）表示，中国人均体重按）表示，中国人均体重按60kg计算。计算。按按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需要说明理由。况做必要调整，但需要说明理由。如：如：18-AA L值的确定值的确定:每小时人的公斤体重最大注射剂量是每小时人的
20、公斤体重最大注射剂量是10ml10ml(大输大输液一般是液一般是10ml10ml),L=5 5/ml10mlml =.EU/ml 返回6.MVD 供试品的最大有效稀释倍数供试品的最大有效稀释倍数:(MVD)按下式计算：MVDC L式中式中 L 为细菌内毒素的限值。为细菌内毒素的限值。C 为供试品溶液的浓度或供试品复溶为供试品溶液的浓度或供试品复溶后所得溶液的浓度，后所得溶液的浓度，抗生素样品浓度应以活性成分计。抗生素样品浓度应以活性成分计。其中当其中当L以以EU/ml表示时表示时,C为为1.0 ml/ml，当当L以以EU/mg或或EU/u表示时，表示时，C为为1.0 mg/ml或或u/ml。返
21、回7 7供试品溶液的制备供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.08.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。返回8.8.鲎试剂灵敏度复核试验材料鲎试剂灵敏度复核试验材料（1）鲎试剂。鲎试剂。（2）细菌内毒素检查用水细菌内毒素检查用水(BET)。（3）细菌内毒素工作标准品。细菌内毒素工作标准品。（4）旋涡混合器旋涡混
22、合器和和371怛温器或细菌内毒素测定仪。怛温器或细菌内毒素测定仪。（5）稀释容器稀释容器(大口径试管大口径试管,小三角瓶小三角瓶,小磨口瓶小磨口瓶,抗生素瓶抗生素瓶或安瓿或安瓿（6）移液器材移液器材(0.5、1、2 2、5ml)。（7）1075 mm试管或复溶后的试管或复溶后的0.1 ml支规格的鲎支规格的鲎试剂原安瓿试剂原安瓿5支。支。（8）试管架或试管浮板。试管架或试管浮板。（9）其他用具其他用具:酒精灯酒精灯,消毒酒精棉球、剪刀、砂轮、镊消毒酒精棉球、剪刀、砂轮、镊子、封口胶布、油性笔、标记纸。子、封口胶布、油性笔、标记纸。返回细菌内毒素检查仪细菌内毒素检查仪(凝胶法）凝胶法）旋涡混合器
23、返回TAL40型试管恒温仪 灵敏度复核试验灵敏度复核试验介绍有关概念及结果判断介绍有关概念及结果判断灵敏度复核试验的具体步骤灵敏度复核试验的具体步骤 (一一)稀释标准内毒素稀释标准内毒素 (二二)灵敏度复核操作灵敏度复核操作 (三三)灵敏度复核实验数据的处理灵敏度复核实验数据的处理鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验 鲎试剂的灵敏度定义鲎试剂的灵敏度定义为:在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示表示。灵敏度复核的目的灵敏度复核的目的:中国药典规定当使用新批号的
24、鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。除了这个要求外，进行复核的日的更重要的是对检测者的操作、环境条件、试剂、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠，结果可信。复核的方法复核的方法:根据鲎试剂标示值根据鲎试剂标示值()用水用水(BET)溶解溶解旋涡混合旋涡混合15 min，机理机理分别分别制成制成(2.0、0.5 和和0.25等等)4个浓度的标准母液个浓度的标准母液溶化溶化鲎试剂鲎试剂(16)管管(每管每管0.ml水水+相应相应的内毒素溶液的内毒素溶液)做做2管阴性对照管阴性对照(0.2ml水水)371怛温反应怛温反应1 1观察结果。观察结果。
25、旋涡混合动画示意图返回结果判断结果判断:如标准溶液最大浓度2.0 的4管均为阳性，最低浓度0.25的4管均为阴性，阴性对照(NC)均为阴性，可按下式计算鲎试剂灵敏度测定值(c)。X c lg-1 4 式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。当c在0.52.0(包括0.5和2.0)时，方可用于细菌内毒素检查，并以为该批鲎试剂的灵敏度。返回灵敏度复核试验的具体步骤灵敏度复核试验的具体步骤(一一)稀释标准内毒素稀释标准内毒素 步骤如下:（符号E20表示浓度为20EU/ml的内毒素溶液，其余类推）：0 0.4mlE20 混合30秒1.6m
26、l水 0.9mlE2.0E2.0 混合30秒 0.9ml0.9ml E1.0 混合30秒0.9ml1.8ml E0.25 混合30秒1.8mlE0.125【注意事项】稀释过程每一步骤所用的移液器具不能交叉混用！1.8ml E0.5 混合30秒1.8ml(二二)灵敏度复核操作灵敏度复核操作 使用=0.5EU/ml 的鲎试剂进行复核。取鲎试剂先消毒处理、断开瓶颈部后、放入反应板孔中如下图排列：（NC表示阴性对照）2 1.0 E0.5 E0.25（EU/l）1.0 0.5 0.25 0.125 NC 1 鲎 2 试 3 o剂 4 先加：然后再加：0.1 ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 相应
27、的标准内毒素 E0。5 E0。25保温371 h，然后观察结果0.ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.2ml 水复溶鲎试剂 水 +水 +水 +水 +水 实验结果判断：实验结果判断：将将试管缓慢翻转“180”，若管内凝若管内凝胶显示坚实不变形为阳性，胶显示坚实不变形为阳性，记录为记录为“”（阳性）（阳性）；若无凝胶出现，或虽有凝胶；若无凝胶出现，或虽有凝胶但不能保持完整，从管壁滑脱，均判为但不能保持完整，从管壁滑脱，均判为阴性，记录为阴性，记录为“”（阴性）（阴性）。实验结果判断实验结果判断(三三)灵敏度复核实验数据的处理灵敏度复核实验数据的处理 按下式计算鲎试剂灵敏度复核值（c）：X
28、c Lg 式中X为反应终点内毒素浓度的对数值。【计算举例】反应结果如下表：【计算举例】反应结果如下表：(EU/ml)1.0 0.5 0.25 0.125 NC 反应终点 l 十 十 十 一 一 2 十 十 一 一 一 3 十 十 一 一 一 4 十 十 一 一 一 0.25 0.5 0.5 0.5 -0.602-0.301-0.301-0.301注：凡只要各中的任何一管出现了+，该反应值对应的值即为该反应浓度的反应终点值。根据以下方式计算根据以下方式计算c：X cg (-0.602)+(-0.301)+(-0.301)+(-0.301)g Lg 1(-0.376)042Eul 即灵敏度复核值0
29、.42EUml。由于0.52，本批鲎试剂的灵敏度标示值正确，应按标示值=0.5EUml使用。若复核的结果不是内毒素标准溶液最大浓度（2.0）的4管全阳性，最小浓度(0.25)4管全阴性，本批鲎试剂不能使用，须查找原因。可能是灵敏度标示不准确，或是内毒素效价标本不准确，或是操作不当的原因导致,应重试。若复核时阴性对照()均为阳性,试验无效,应重试。判判 断断鲎试剂灵敏度复核试验录像播放鲎试剂灵敏度复核试验录像播放返回小结与练习小结与练习将以下代号和相应的中文联系在一起。将以下代号和相应的中文联系在一起。BETBET：细菌内毒素检查细菌内毒素检查TALTAL：美洲鲎试剂美洲鲎试剂LALLAL：中国
30、鲎试剂中国鲎试剂RSERSE：内毒素工作标准品内毒素工作标准品CSECSE：内毒素参考标准品内毒素参考标准品 ：供试品的细菌内毒素限值供试品的细菌内毒素限值 M M 鲎试剂灵敏度（鲎试剂灵敏度（EU/mlEU/ml）K K：按规定的给药途经，人体每公斤体重按规定的给药途经，人体每公斤体重 每小时最大可接受的内毒素剂量每小时最大可接受的内毒素剂量 L L：人用药物每公斤体重每小时最大剂量人用药物每公斤体重每小时最大剂量是非题是非题:(:(指出错误的地方和改正错题指出错误的地方和改正错题)1.鲎试剂的灵敏度是指在细菌内毒素检查条件下,鲎试剂能与水溶液中的细菌内毒素产生阴性反应的最低内毒素浓度。（）2.鲎试剂灵敏度是以表示。（）3.MVD是指样品的最大有效浓度。（）4.L值是表示药品的细菌内毒素含量值。（）5.凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.05 EU/ml的灭菌注射用水。光度法测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。（）6.细菌内毒素的量是用内毒素单位（EU）来表示。（）返回鲎鲎返回我国药检系统研究鲎试验法我国药检系统研究鲎试验法返回19951995年版中国药年版中国药返回 20002000年版年版中国药典中国药典将试管缓慢翻转180 返回
