1、结核分枝杆菌与实验室生物安全广东检验检疫技术中心BSL-3实验室师永霞一、实验室感染典型案例二、结核杆菌的生物安全防护三、生物安全柜的安全使用四、意外事故处理3一、实验室感染典型案例1.中国CDC SARS感染事件说明：事件说明：200420044 4月，安徽、北京北京发现新的SARSSARS病，其中两名CDC实验室人员。事件原因：事件原因：采用未经论证确实有效的SARS灭活方法；在不符合防护要求之实验室内操作SARS。42.新加坡 SARS感染事件说明：事件说明：20038月23日某国立大学博士研究生从事西尼罗研究，感染SARS病患检体；事件原因：事件原因：实验室安全程序不当，同一时间进行不
2、同活性病毒研究，造成其交叉感染；对于人员生物安全教育训练不足，人员对所有病原体警觉性够，无自我监测症状观念。5 3.台湾SARS感染事件说明：事件说明：2003年12月，某研究所研究人员感染SARS。为清理运输舱内溢出物，仅作一般消毒，穿戴一般防护装备，将头与躯干伸入运输舱中清理。事件原因：事件原因：未使用适当除污程序；未使用合适消毒剂；未报告所有溢出意外。4.结核杆菌感染1事件说明：事件说明：1952年，细菌学家两年从事B族结核杆菌工作；血清1:160稀释度下凝集，无典型症状；1955年，右手红色伤口（丘疹），右腋下轻微痛感（结节）；创伤物质培养处B族结核杆菌；事件原因：事件原因：防护措施不
3、到位；个人防护装备不全；实验人员安全意识不强。5.结核杆菌感染2事件说明：事件说明：戴一次性乳胶手套在安全柜准备操作鉴定结核分枝杆菌；操作时，左手桡骨背侧被安全柜的前窗边缘划伤，皮肤上有小的擦伤；停止工作，70%酒精清洗伤口；3周后，出现局部红肿，有无痛的硬结；在伤口处取标本进行培养，6周后培养阳性；限制性片段多态性分析，与操作的结核杆菌一致；事件原因：事件原因：意外事故皮肤损伤；虽抗结核治疗，但证实实验室感染；意外事故感染预案做好评估、处理和监测。8实验室生物安全：指实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受的损害，符合相关法规、标准等对实验
4、室生物安全责任的要求。实验室获得性感染：人类感染病原微生物源自于实验室或实验室相关活动，不论其表现为有症状或无症状，都属于实验室获得性感染。二、结核杆菌的生物安全防护9实验室生物风险管理要素10设施设备设施设备标准操作程序标准操作程序个人防护装备个人防护装备管理管理实验室生物安全控制要素防护屏障（一）设施设备和个人防护装备 一级防护屏障 实验室的生物安全柜和个人防护装备等构成的防护屏障。二级防护屏障 实验室的设施结构和通风系统等构成的防护屏障。12一级防护屏障u生物安全柜是最重要的安全设备，形成最主要的防护屏障；u为消除或减少人员暴露于有害生物材料所配备其他安全设备（如离心机负压罩等）；u必须
5、给实验室工作人员配备必要的个体防护用品：手套、口罩、鞋套、面罩、正压服等。13各类口罩：需做个体适配性试验 医用外科口罩 杯罩式随弃口罩 折叠式随弃口罩 个体安全防护措施14手套穿脱:戴前检漏、盖住衣袖 15脱隔离衣程序脱隔离衣程序 手部表面消毒后由内向外翻卷脱去外层手套 注意退出胳膊时让隔离衣内面朝外向中间覆盖，两手持领、将隔离衣清洁面在外向内翻卷，投入污物袋中。16二级防护屏障二级防护屏障u选址与平面布局；u围护结构；u送、排风系统；u消毒、灭菌设备；u污水处理设备；u尸体处理设备；u其他安全装置。17BSL-2 BSL-2 结构设计常规要求结构设计常规要求 实验室有实验室有带锁带锁的门；
6、的门；有有洗手洗手水槽；水槽；工作面易于清洁；工作面易于清洁；天棚不渗水；天棚不渗水；实验室台结实；实验室台结实；按照要求放置按照要求放置生物安全生物安全柜柜；适当的照明系统；适当的照明系统；眼睛冲洗眼睛冲洗装置；装置；实验室排除的气体不能实验室排除的气体不能循环到非实验区；循环到非实验区；窗户安装有纱窗。窗户安装有纱窗。18 生物安全柜生物安全柜 高压灭菌器高压灭菌器 洗眼装置洗眼装置BSL-2 BSL-2 设备条件设备条件 在BSL-1 设备条件上增加：实验室位置：与公共场所分隔开；通风:有方向性。19l实验室入口处贴上实验室入口处贴上生物生物安全标志安全标志，注明实验室生，注明实验室生物
7、安全级别，负责人姓名，物安全级别，负责人姓名，负责人姓名和电话，需要负责人姓名和电话，需要接种的免疫种类，进入实接种的免疫种类，进入实验室的特殊要求等；验室的特殊要求等；正在进行感染性试验时正在进行感染性试验时禁止禁止他人他人进入进入，或经负责，或经负责人同意后进行安全防护后人同意后进行安全防护后进入；进入；（二）实验室管理要素20工作人员接受必要的工作人员接受必要的免疫接种免疫接种，免疫耐受或正在，免疫耐受或正在进行免疫抑制剂治疗的病人须经同意方可进入工进行免疫抑制剂治疗的病人须经同意方可进入工作；必要时留作；必要时留本底血清本底血清；新员工必须接受新员工必须接受培训培训方可进入工作，老员工
8、必须方可进入工作，老员工必须接受接受再培训再培训；尽量尽量减少利器减少利器使用，严格按照规范操作；使用，严格按照规范操作；消毒物品需放在容器内运输、进行消毒物品需放在容器内运输、进行有效灭菌有效灭菌消毒消毒和和效果监测效果监测，交给有，交给有资质单位资质单位进行处理；进行处理；建立实验室感染建立实验室感染应急预案应急预案、意外事故报告意外事故报告、登记、登记制度；制度；实验室人员：实验室人员：注意注意潜在的危害潜在的危害；熟知熟知操作规操作规程，程，精通精通操作技术。操作技术。（三）标准操作程序人间传染的病原微生物名录：结核分枝杆菌危害程度第二类，高致病性病原微生物；少量细菌的分离培养、样品检
9、测和药敏实验在BSL-2实验室进行；大量细菌培养在BSL-3实验室，动物感染实验在ABSL-3实验室；无感染性材料的操作在BSL-1实验室。22 结核病传播途径可由呼吸道、消化道、皮肤等途径感染，但其主要传播途径是以空气为传播因子的呼吸道传染，而排菌的肺结核病人传染性更大，是传播感染的主要传染源。实验室感染以气溶胶形式的呼吸道感染和皮肤感染。23产生气溶胶的操作及预防 1.接种：应使用无弹力的铂丝接种环，结核菌接种后接种环火焰灭菌易崩散，酒精灯烧灼时要特别注意。l 2.混匀：吸管吸吹菌液时不要产生气泡，应沿容器壁排出。l 3.研磨：最 好使用组织研磨器，乳钵易产生气溶胶。25l 4.移液：吸管
10、上端的棉花松紧要适度，吸液时要从管底吸取，吹出时要轻缓，不要全部吹净，以免产生气泡，形成气溶胶。123l 5.开封和开启安瓿管：要避免压力和气流的急剧 变化。l 6.离心：离心管套底垫要完好，使用匹配的管、套、离心头，加盖。l 7.注射：做好个人防护，正确使用注射器，使用后不能套回。1234 8.容器和运送：采样管外旋盖，密闭；室内运送样本要避免滑落，移出室外要有坚实密闭的外包装。31三、生物安全柜的安全使用分级：分级：I I级级生物安全柜：保护工作人员和环境。生物安全柜：保护工作人员和环境。II II级级生物安全柜生物安全柜：保护工作人员、环境和样品。：保护工作人员、环境和样品。IIIIII
11、级级生物安全柜：采用手套箱更严格地保护工生物安全柜：采用手套箱更严格地保护工作人员、环境和样品。作人员、环境和样品。32II II级生物安全柜级生物安全柜可开启前窗；从前开口向内的气流用于保护人员；经HEPA过滤后向下送的层流，以保护样品；排出的气体采用HEPA过滤器过滤则用于保护环境；表面风速在75-100 fpm；适用于要求生物安全等级为1-3的工作。33II II级级生物安全柜的分类生物安全柜的分类 II级A1型生物安全柜：70%柜内循环，30%空气排出，工作窗口流速75fpm；II级A2型生物安全柜：70%柜内循环，30%空气排出（套管），工作窗口流速100fpm；II级B1型生物安全
12、柜：30%柜内循环，70%空气排出（套管）,工作窗口流速100fpm；II级B2型生物安全柜：100%空气排出室外（硬管）,工作窗口流速100fpm。34II II级级A2A2型生物安全柜型生物安全柜 从操作口向内气流的最小平均速度应保持100 ft/min（0.5 m/s）；经HEPA过滤器过滤的下送气流，是来自于同一个压力排风系统的下送气流和操作口向内气流的混合气体的一部分；经HEPA过滤器过滤后的空气可以排回实验室或通过排风罩排入环境。35II II级级A2A2型生物安全柜型生物安全柜Type A2 不带排风管路最小表面风速100 fpm满足生物安全等级1、2、3的要求不涉及放射性物质不
13、涉及挥发性有害化学品建议不应有明火36级级B2B2型生物安全柜（称为型生物安全柜（称为“全排型全排型”）从操作口向内气流的最小平均速度应保持100 ft/min（0.5 m/s）；经HEPA过滤器过滤的下送气流来自于实验室或室外的空气（亦即安全柜中排出的气体不再循环用作下送气流）；操作口向内气流和下送气流经HEPA过滤器过滤后全部排入大气，不再循环送入安全柜或送回实验室；所有污染的风道和压力排风系统均保持负压，或由直接排出的（不再循环经过工作区）负压风道和压力排风系统包围。37满足生物安全等级1、2、3的要求适用于放射性物质适用于放射性物质*适用于挥发性有害适用于挥发性有害化学品化学品*建议不
14、应有明火全排风适用于进行含有挥发性有毒化学物质适用于进行含有挥发性有毒化学物质和放射性核素的微生物学研究工作和放射性核素的微生物学研究工作 级级B2B2型生物安全柜型生物安全柜38l只有鼓风机开着和气流指示在安全的位置时，才能使用BSC；l如果BSC有一扇可开的玻璃面板，当工作时，它必须限制在 固定的位置和高度；生物安全柜使用注意事项生物安全柜使用注意事项39l操作前应将本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免双臂频繁穿过气幕破坏气流；l安全柜内不放与本次实验无关的物品。柜内物品摆放应做到清洁区、半污染区与污染区基本分开，操作过程中物品取用方便，且三区之间无交叉。物品应尽量靠后放置，但不得挡住气
15、道口，以免干扰气流正常流动；干净的物品被污染的区域废弃物托盘垃圾袋40l打开风机510分钟，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作。将双臂缓缓伸入安全柜内，至少静止1分钟，使柜内气流稳定后再进行操作；l操作时应按照从清洁区到污染区进行，以避免交叉污染。为防可能溅出的液滴，可在台面上铺一用消毒剂浸泡过的毛巾或纱布，但不能覆盖住安全柜格栅；l操作期间，严禁使用酒精灯等明火，以避免产生的热量产生气流，干扰柜内气流稳定；且明火可能损坏HEPA滤器；l工作时尽量减少背后人员走动以及快速开关房门，以防止安全柜内气流不稳定；l在实验操作时，不可打开玻璃视窗，应保证操作者脸部在工作窗口之上。在柜内操作时动作
16、应轻柔、舒缓，防止影响柜内气流。l工作结束之后，所有装置和容器在移出BSC之前应对其表面消毒。在进行这一操作的过程中BSC鼓风机应保持运转；lBSC中工作结束后进行清场消毒，完毕后至少应在五分钟内保持BSC鼓风机运转，同时打开紫外灯，照射10-15分钟。（在紫外灭菌时要关闭通风；紫外光对人体有损害，注意个人保护。）l安全柜应定期进行检测与保养，以保证其正常工作。工作中一旦发现安全柜工作异常，应立即停止工作，采取相应处理措施，并通知相关人员。（1.新II级生物安全柜放到指定位置后；2.II级生物安全柜被移动位置后；3.对II级生物安全柜进行检修后；4.II级生物安全柜更换高效过滤器后；5.II级
17、生物安全柜定期常规现场检测，每年一次。）123456789101112结核杆菌适宜的消毒灭菌措施l湿热：6030分钟、7010分钟、805分钟和901分钟，煮沸与高压灭菌；l紫外：101mg/ml菌悬液、液层厚度3mm，用10W紫外线灯在距离 0.5m处持续照射3分钟，在距离1m处持续照射 10分钟，经培养无细菌生长。但紫外线穿透力弱，难以透入固体物质内部和液体深层，因此紫外线通常用于空气和物体表面消毒。l乙醇：直接接触70%75%乙醇530分钟可被杀死，因此可用于皮肤消毒。但由于乙醇能凝固蛋白，使痰表面形成一层把菌体包裹起来的膜，短时间内不能杀死细菌，故乙醇不能用于痰的消毒。“84”消毒液：
18、0.5%“84”消毒液15分钟可杀死结核分枝杆菌培养物，但对痰液中的结核分枝杆菌几乎无消毒效果。苯酚：2%苯酚 5分钟、5%苯酚1分钟能杀死结核分枝杆菌培养物。5%苯酚与痰液等量混合，24小时才能杀死结核分枝杆菌。煤酚皂：0.5%煤酚皂60分钟，1%煤酚皂45分钟，2%煤酚皂10分钟，5%煤酚皂5分钟，即能杀死结核分枝杆菌培养物。5%10%煤酚皂等量混入痰标本，12小时可杀灭结核分枝杆菌。结核杆菌适宜的消毒灭菌措施四、意外事故处理意外事故生物性化学性物理性天然灾害火 灾感染性生物材料、传染病病人样本强酸、强碱等噪音、辐射等水灾、地震等48 溢出溢出（生物安全柜内溢出、实验室内溢出）（生物安全柜
19、内溢出、实验室内溢出）离心过程离心过程离心管破裂离心管破裂（密闭性和非密闭性离心桶）（密闭性和非密闭性离心桶）生物安全柜生物安全柜电力中断电力中断 皮肤、粘膜污染皮肤、粘膜污染 针刺、割伤针刺、割伤生物性意外类型生物性意外类型49（一）处理程序（一）处理程序1.1.实验室内溢出实验室内溢出/溢洒溢洒 大量液体形成不规则水渍；部分飞溅；小部分形成空气播散的气溶胶颗粒。大的气溶胶颗粒很快就会沉降，但较小的气溶胶颗粒则会在空气中停留较长时间，并可经通风系统离开溢洒区域。当发生液体溢洒时，应考虑有气溶胶产生。50（1 1）准备溢洒处理工具包）准备溢洒处理工具包明确标示出溢洒处理工具包的存放地点。基础的
20、溢洒处理工具包通常包括：对感染性物质有效的消毒灭菌液，消毒灭菌液需要按使用要求定期配制；消毒灭菌液盛放容器；镊子或钳子、一次性刷子、可高压的扫帚和簸箕，或其他处理锐器的装置；足够的布巾、纸巾或其他适宜的吸收材料；51用于盛放感染性溢洒物以及清理物品的专用收集袋或容器；橡胶手套；面部防护装备，如面罩、护目镜、一次性口罩等；溢洒处理警示标识，如“禁止进入”、“生物危险”等；其他专用的工具。52（2 2）撤离房间）撤离房间 发生生物危险物质溢洒时，立即通知房间内的无关人员迅速离开，在撤离房间的过程中注意防护气溶胶。关门并张贴“禁止进入”、“溢洒处理”的警告标识，至少30 min后方可进入现场处理溢洒
21、物。撤离人员按照离开实验室的程序脱去个体防护装备，用适当的消毒灭菌剂和水清洗所暴露皮肤。如果同时发生了针刺或扎伤，可以用消毒灭菌剂和水清洗受伤区域，挤压伤处周围以促使血往伤口外流；如果发生了黏膜暴露，至少用水冲洗暴露区域15 min。立即通知实验室主管人员。必要时，由实验室主管人员安排专人清除溢洒物。53【理解要点理解要点】当现场判断溢洒事件不会进一步产生严重后果时，相关人员（包括现场人员和可能受影响的其他区域人员）迅速撤离是避免人员进一步暴露的首要措施。当现场判断溢洒事件可能会进一步发展时，须在具备个体防护的条件下，先进行必要的现场处理，然后再按程序撤离。撤离现场时要做好现场保护（如关门、张
22、贴警示标识等）；如果可能，应按正常程序脱去个体防护装备，并应注意在脱去个体防护装备时不应造成人员暴露。54（3 3）溢洒区域的处理）溢洒区域的处理 准备清理工具和物品，在穿着适当的个体防护装备（如：鞋、防护服、口罩、双层手套、护目镜、呼吸保护装置等）后进入实验室。需要两人共同处理溢洒物，必要时，还需配备一名现场指导人员。判断污染程度，用消毒灭菌剂浸湿的纸巾（或其他吸收材料）覆盖溢洒物，小心从外围向中心倾倒适当量的消毒灭菌剂，使其与溢洒物混合并作用一定的时间。应注意按消毒灭菌剂的说明确定使用浓度和作用时间。55到作用时间后，小心将吸收了溢洒物的纸巾（或其他吸收材料）连同溢洒物收集到专用的收集袋或
23、容器中，并反复用新的纸巾（或其他吸收材料）将剩余物质吸净。破碎的玻璃或其他锐器要用镊子或钳子处理。用清洁剂或消毒灭菌剂清洁被污染的表面。所处理的溢洒物以及处理工具（包括收集锐器的镊子等）全部置于专用的收集袋或容器中并封好。用消毒灭菌剂擦拭可能被污染的区域。按程序脱去个体防护装备，将暴露部位向内折，置于专用的收集袋或容器中并封好。按程序洗手。按程序处理清除溢洒物过程中形成的所有废物。562.2.生物安全柜内溢洒生物安全柜内溢洒 处理溢洒物时不要将头伸入安全柜内，也不要将脸直接面对前操作口，而应处于前视面板的后方。选择消毒灭菌剂时需要考虑其对生物安全柜的腐蚀性。如果溢洒的量不足1 ml时，可直接用
24、消毒灭菌剂浸湿的纸巾（或其他材料）擦拭。57如溢洒量大或容器破碎，建议如下操作：使生物安全柜保持开启状态；在溢洒物上覆盖浸有消毒灭菌剂的吸收材料，作用一定时间以发挥消毒灭菌作用；在安全柜内对所戴手套消毒灭菌后，脱下手套。如果防护服已被污染，脱掉所污染的防护服后，用适当的消毒灭菌剂清洗暴露部位；穿好适当的个体防护装备，如双层手套、防护服、护目镜和呼吸保护装置等；58小心将吸收了溢洒物的纸巾（或其他吸收材料）连同溢洒物收集到专用的收集袋或容器中，并反复用新的纸巾（或其他吸收材料）将剩余物质吸净；破碎的玻璃或其他锐器要用镊子或钳子处理；用消毒灭菌剂擦拭或喷洒安全柜内壁、工作表面以及前视窗的内侧；作用
25、一定时间后，用洁净水擦干净消毒灭菌剂；593.离心机内离心管破裂离心机内离心管破裂60【理解要点理解要点】离心机时很可能会发生离心管破碎，产生大量气溶胶。实验室应尽可能使用配备密封吊桶、转子的生物安全型离心机。离心机不得放入级生物安全柜中使用。应优先选用非玻璃材质的离心管，在使用前要检查离心管是否有腐蚀或细微裂痕，应弃用不安全的离心管。在离心危险物质时应使用有盖的离心管。须在生物安全柜内操作（加样、取样等）感染性样本，离心结束后，打开离心机盖前要先等候至少5 min。使用后，应检查内部转子部位的腔壁是否被污染或弄脏，如污染明显，应重新评估离心操作规程。4.生物安全柜电力中断生物安全柜电力中断
26、立即停止操作，避免产生气溶胶；离开实验室；防止其他人员进入实验室；电力恢复30分钟后，进行消毒除污。5.皮肤和粘膜污染皮肤和粘膜污染 眼睛：以干净清水、生理盐水或无菌清洗液清洗15分钟；嘴巴、鼻子及皮肤伤口：以清水冲洗15分钟。6.针刺、割伤针刺、割伤 轻轻将血从伤口挤出；以肥皂或清水冲洗受伤部位；63（二）评估与报告（二）评估与报告 对事故处理过程和效果进行评估，必要时对实验室进行彻底的消毒灭菌处理和对暴露人员进行医学评估。按程序记录相关过程和报告。报告中要包括事故发生的详细过程、原因分析、影响范围、后果评估、采取的措施、所采取措施有效性的追踪、预防类似事件发生的建议及改进措施等内容。事故报告（包括采取的任何措施）应提交实验室管理层和安全委员会评审。所有事故报告应形成书面文件并存档。紧急联系电话；事故报告程序。
