1、色层分离方法色层分离方法 ChromatographyChromatography层析的原理层析的原理“层析谱的本质是使一种液体均匀地层析谱的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。留了液体内的某些组分。”马丁（马丁（A.J.P.MartinA.J.P.Martin）（英）（英）层析分离法层析分离法n常用的层析技术有常用的层析技术有 (亲和层析、离子交换层析、亲和层析、离子交换层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳）凝胶排阻层析、凝胶电泳）n特点：特点：n（1 1）纯化倍数高纯化倍
2、数高n（2 2）操作规模小，放大困难操作规模小，放大困难n（3 3）最终产品纯化最终产品纯化n（4 4）适用于价格昂贵的产品适用于价格昂贵的产品色层分离法基本原理色层分离法基本原理色层分离法基本原理分子筛层析示意图分子筛层析示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：分配系数分配系数n在一定的温度下，溶质在两液相之间的平衡关系服在一定的温度下，溶质在两液相之间的平衡关系服从分配定律：从分配定律：n Kd=C1/C2K d为分配系数为分配系数nC1，C2为两液相中的溶质浓度。为两液相中的溶质浓度。n应用条件：温度一定应用条件：温度一定n 低浓度低浓度解离常数和分离解离常数和分离 因数因
3、数）mt-结合溶质分子的有效位子结合溶质分子的有效位子总浓度总浓度m-空余的有效结合位子空余的有效结合位子浓度浓度q-溶质在固相的溶质在固相的浓度浓度c-溶质在液相的溶质在液相的浓度浓度解离常数解离常数图图22-3恒定缓冲液条件下，色层分离的恒定缓冲液条件下，色层分离的拖尾现象拖尾现象的移动距离前缘在同一时间内溶剂溶质的移动距离移动速度流动相在层析系统中的溶质的移动速度)(fR sdmAKAV V积能进行分配的有效截面溶质移动距离Rf=sdmmAKAA阻滞因数阻滞因数Am流动相的平均截面积流动相的平均截面积 As-固定相的平均截面积固定相的平均截面积流动相的移动距离流动相的移动距离 V/Am洗
4、脱容积洗脱容积Ve在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相的体积通过的流动相的体积理论塔板理论塔板fr第第r块塔板上溶质的质量分数为：块塔板上溶质的质量分数为：rrnrEEErnrnf)1()11()!(!222)1/(2)1/()1/(21EnEEnEreEnEfrr n E/(E+1)时 r max n E/(E+1)最大浓度塔板最大浓度塔板r max n E/(E+1)E=22-16N越大，加入的溶剂越多，展开的时间越长色带下移越大，加入的溶剂越多，展开的时间越长色带下移高峰浓度减少、色带扩大高峰浓度减少、色带扩大常用层析介质常用层析介质氧化铝
5、：（活性氧化铝）它是一种多孔性、高分散度固体氧化铝：（活性氧化铝）它是一种多孔性、高分散度固体（1）有很大的比表面积，其微孔表面具有吸附性能。）有很大的比表面积，其微孔表面具有吸附性能。（2）分子式）分子式Al2O3简单，空间形态复杂，简单，空间形态复杂，8种以上的形态种以上的形态（3）同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径）同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径分布、比表分布、比表面积等存在差异面积等存在差异（4）吸附量与含水量关系很大）吸附量与含水量关系很大制备：由氢氧化铝加热脱水得到的。制备：由氢氧化铝加热脱水得到的。吸附基团：铝离子吸附基团：铝离子种类：种类：碱性：由氢氧化铝高温脱
6、水，用于碱性稳定的溶质碱性：由氢氧化铝高温脱水，用于碱性稳定的溶质 酸性：碱性氧化铝经盐酸洗涤，用于在酸性稳定的溶质酸性：碱性氧化铝经盐酸洗涤，用于在酸性稳定的溶质 中性：碱性氧化铝经水洗后活化制得中性：碱性氧化铝经水洗后活化制得应用：有机溶剂中分离天然成分应用：有机溶剂中分离天然成分硅硅 胶胶硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质（1）化学组成）化学组成SiO2.XH20，（2）属于无定形结构，基本结构质点为）属于无定形结构，基本结构质点为SiO四面体，相互堆四面体，相互堆积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。积形成硅胶的
7、骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。（3）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。硅胶的分类硅胶的分类（常以孔径大小来分），（常以孔径大小来分），(1)特细孔硅胶特细孔硅胶(0.8nm以下以下)。(2)细孔硅胶（细孔硅胶（1.52.0nm)(3)中孔硅胶中孔硅胶(4.0一一5.0nm)(4)粗孔硅胶粗孔硅胶(10.nm以上以上)应用：吸附层析剂与分配层析应用：吸附层析剂与分配层析剂剂优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，用于天然产物分离，用于天然产物分离，可用在水溶液中或有机溶剂中可用在水溶液
8、中或有机溶剂中 琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构a 琼脂糖结构琼脂糖结构 b 亲水性凝胶结构亲水性凝胶结构 溴化氰活化与配基偶联化学反应式溴化氰活化与配基偶联化学反应式 图图22-6环氧氯丙烷活化反应式环氧氯丙烷活化反应式 环氧基的氨化及偶联配基反应 活化方法（活化方法（3 3）nC 对甲苯磺酰氯活化对甲苯磺酰氯活化 n（1）用于活化含羟基基质、将羟基转化为磺酰）用于活化含羟基基质、将羟基转化为磺酰 基、在配基偶联后容易脱落、不引入电荷。基、在配基偶联后容易脱落、不引入电荷。n（2）配基与羟基间形成稳定化学键。）配基与羟基间形成稳定化学键。n（3）活化操
9、作需在无水丙酮环境中进行，偶联）活化操作需在无水丙酮环境中进行，偶联 配基根据情况、既可在有机相中进行、亦可在配基根据情况、既可在有机相中进行、亦可在 水相中进行。水相中进行。对甲苯磺酰氯活化反应式对甲苯磺酰氯活化反应式手臂（手臂（spacer)作用：减少亲和作用空间位阻 连接：通过化学反应与活化基团连接 手臂化合物：乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2 已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 6-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH 环氧氯丙烷 1、4 丁二醇缩水甘油醚D 残余电荷的掩蔽残余电荷的掩蔽目的：目的：防止产生非特异性吸
10、附防止产生非特异性吸附原理：原理：通过化学反应消除基团上的电荷通过化学反应消除基团上的电荷方法：方法：（1）自发水解）自发水解（2）氨基：醋酸酐）氨基：醋酸酐（3）羧基：水溶性碳二亚胺）羧基：水溶性碳二亚胺NH2CCOOOCH3CH3+H2ONH-O-C-CH3OCH3OCOH+手臂氨末端的掩蔽手臂氨末端的掩蔽 残留羧基掩蔽反应残留羧基掩蔽反应 E E 活化基团与配基密度测定活化基团与配基密度测定n方法：方法：n（1 1）氨基或羧基可用酸碱滴定。）氨基或羧基可用酸碱滴定。n（2 2）有紫外吸收特征的、可用紫外分光法测定。）有紫外吸收特征的、可用紫外分光法测定。n（3 3）通过测定反应余液中配基
11、残留量推算（偶）通过测定反应余液中配基残留量推算（偶 联率较高的情况）联率较高的情况）n（4 4）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定F F 亲和介质吸附容量测定亲和介质吸附容量测定 方法：方法：（1）流出曲线法：流出曲线法：流出液中目标蛋白浓度达到进流出液中目标蛋白浓度达到进 口浓度的口浓度的90%（2）Langmiur 吸附等温线法吸附等温线法*K.CCqqdm 层析装置与操作层析装置与操作n装置装置 1 普通普通 2 高级高级n柱操作柱操作n（1）装柱：均匀，无气泡）装柱：均匀，无气泡n（2）平衡（）平衡（equilibrium)：缓冲液：缓冲液,p
12、H,盐浓度盐浓度n（3）上样）上样(loading)：蛋白浓度，：蛋白浓度，pH,盐浓度，缓冲液盐浓度，缓冲液n（4）洗涤）洗涤(washing)：pH,盐浓度，洗涤剂，缓冲液盐浓度，洗涤剂，缓冲液n（5）洗脱）洗脱(elution)：条件与吸附相反：条件与吸附相反n（6）清洗）清洗(cleaning)：弱酸，弱碱，蛋白质变性剂（尿：弱酸，弱碱，蛋白质变性剂（尿 素，盐酸胍，硫氰酸盐素，盐酸胍，硫氰酸盐n（7）再生：与平衡条件相同）再生：与平衡条件相同柱层析分离法的有关装置柱层析分离法的有关装置 Pharmacia KTA 层析系统层析系统 Pharmacia KTA 层析系统层析系统 装装
13、置置n泵泵n混合器混合器n层析柱层析柱n检测器检测器n记录仪记录仪n分部收集器分部收集器装柱装柱n调糊：调糊：50%50%（缓冲液介质）（缓冲液介质）n一次连续加入悬胶液一次连续加入悬胶液n打开出口阀：层析剂沉降打开出口阀：层析剂沉降n排除空气排除空气n检查均匀检查均匀度度上样上样n样品处理：样品处理：n(1(1）溶解）溶解nA A 调整浓度调整浓度nB B 盐盐nC pH C pH n(2)(2)过滤：除去不溶物过滤：除去不溶物n流速：流速：根据样品浓度与吸附速度而定根据样品浓度与吸附速度而定n上样量：上样量：80%80%吸附容量吸附容量淋洗（去除残留在介质中的杂质）淋洗（去除残留在介质中的
14、杂质）n盐浓度盐浓度npH pH n表面活性剂（表面活性剂（0.1-0.5%)0.1-0.5%)n淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定n防止产物丢失又要除去杂质防止产物丢失又要除去杂质洗脱方法洗脱方法n按操作方式按操作方式na a 恒定洗脱恒定洗脱 (isocratic elution)(isocratic elution)nb b 分步洗脱分步洗脱 (stage elution)(stage elution)c c 梯度洗脱梯度洗脱 (gradient elution)(gradient elution)按洗脱机理按洗脱机理专一性洗脱（专一性洗脱（specif
15、ic elutionspecific elution）非专一性洗脱（非专一性洗脱（nonspecific elutionnonspecific elution）添加剂：乙二醇添加剂：乙二醇,NaCNS,NaCNS 、脲素、盐酸胍、脲素、盐酸胍 洗脱体积：洗脱体积：5 5倍床体积倍床体积Elution(ml)Protein(mg/ml)NaCl(mol/L)00.20.40.60.800.20.40.60.8104080120160200240Na ClProtein恒定洗脱恒定洗脱 Volume(ml)Protein(mg/ml)NaCl(mol/L)00.10.20.30.400.20.40
16、.60.804080120160200240NaClProtein分分 步步 洗洗 脱脱 Volume(ml)Protein（mg/ml)NaCl(mol/L)00.10.20.30.40.50.600.10.20.30.40.50.60.704080120160200240ProteinNaCl(c)梯度洗脱思思 考考 题题 1 理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高度，洗脱体积，分辨率。度，洗脱体积，分辨率。2 不同的层析分类方法各有何意义？不同的层析分类方法各有何意义？3常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？常用的层
17、析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？4 亲和层析的机理是什么？亲和层析的机理是什么？5 配基偶联后残留电荷对分离有何影响？配基偶联后残留电荷对分离有何影响？如何消除？如何消除？6 小分子配基为何需插入手臂？小分子配基为何需插入手臂？7 层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？第二十二章第二十二章 色层分离法色层分离法（第二讲）（第二讲）柱层析分离法的有关装置柱层析分离法的有关装置 装装 置置 泵泵 混合器混合器 层析柱层析柱 检测器检测器 记录仪记录仪 分部收集器分部收集器装柱装柱 调糊：调糊：50%50%（缓冲液介质）（缓冲液介质）一次连续加入悬胶
18、液一次连续加入悬胶液 打开出口阀：层析剂沉降打开出口阀：层析剂沉降 排除空气排除空气 检查均匀检查均匀度度上样上样 样品处理：样品处理：(1(1）溶解）溶解 A A 调整浓度调整浓度 B B 盐盐 C pH C pH (2)(2)过滤：除去不溶物过滤：除去不溶物 流速：流速：根据样品浓度与吸附速度而定根据样品浓度与吸附速度而定 上样量：上样量：80%80%吸附容量吸附容量淋洗（去除残留在介质中的杂质）淋洗（去除残留在介质中的杂质）盐浓度盐浓度 pH pH 表面活性剂（表面活性剂（0.1-0.5%)0.1-0.5%)淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定 防止产物丢
19、失又要除去杂质防止产物丢失又要除去杂质洗脱方法洗脱方法 按操作方式按操作方式 a a 恒定洗脱恒定洗脱 (isocratic elution)(isocratic elution)b b 分步洗脱分步洗脱 (stage elution)(stage elution)c c 梯度洗脱梯度洗脱 (gradient elution)(gradient elution)按洗脱机理按洗脱机理专一性洗脱（专一性洗脱（specific elutionspecific elution）非专一性洗脱（非专一性洗脱（nonspecific elutionnonspecific elution）添加剂：乙二醇添加剂
20、：乙二醇,NaCNS,NaCNS 、脲素、盐酸胍、脲素、盐酸胍 洗脱体积：洗脱体积：5 5倍床体积倍床体积Elution(ml)Protein(mg/ml)NaCl(mol/L)00.20.40.60.800.20.40.60.8104080120160200240Na ClProtein恒定洗脱恒定洗脱 Volume(ml)Protein(mg/ml)NaCl(mol/L)00.10.20.30.400.20.40.60.804080120160200240NaClProtein分分 步步 洗洗 脱脱 Volume(ml)Protein（mg/ml)NaCl(mol/L)00.10.20.3
21、0.40.50.600.10.20.30.40.50.60.704080120160200240ProteinNaCl(c)梯度洗脱清洗与再生清洗与再生 弱酸：弱酸：HAC 碱：氨水碱：氨水 促溶剂：促溶剂：1-3M KCNS、6-8 M 尿素、尿素、6 M盐酸胍盐酸胍 极性溶剂：极性溶剂：20%乙醇乙醇 表面活性剂：吐温表面活性剂：吐温-80 缓冲液平衡缓冲液平衡无机吸附剂无机吸附剂 羟基磷灰石羟基磷灰石(hydroxyapatite、Ca10(PO4)6(OH)2（1）纯化蛋白质的无机介质。）纯化蛋白质的无机介质。（2）廉价，易于大规模应用，）廉价，易于大规模应用，（3）使用后易于清洁）使
22、用后易于清洁 吸附机理与规律吸附机理与规律：偶极离子作用而不是离子交换作用偶极离子作用而不是离子交换作用(1)每一个正电荷区周围都有负电荷区，反之亦然每一个正电荷区周围都有负电荷区，反之亦然。（2）蛋白质在中性）蛋白质在中性pH范围具有最大的形成毗邻正负离范围具有最大的形成毗邻正负离子的可能性。子的可能性。电性作用是它吸附蛋白质的重要原因电性作用是它吸附蛋白质的重要原因羟基磷灰石羟基磷灰石(HydroxyIapatite，简称，简称HAP)是一种结晶状无机盐，属六方晶系，存在于自然界中，是一种结晶状无机盐，属六方晶系，存在于自然界中，与生物体有很好的相容性，也是目前分离各类生物分子最与生物体有
23、很好的相容性，也是目前分离各类生物分子最常用的液相色谱介质之一在分离过程中，待分离分子以常用的液相色谱介质之一在分离过程中，待分离分子以多种方式吸附于多种方式吸附于HAP晶体表面，即分子以不同的局部面向晶体表面，即分子以不同的局部面向HAP晶体表面，并以不同方向排列根据统计力学定律，晶体表面，并以不同方向排列根据统计力学定律，在这些不同的吸附配置之间遵从在这些不同的吸附配置之间遵从Boltzmann分布，且能量最分布，且能量最稳定状态配置的几率最高，酸性分子稳定状态配置的几率最高，酸性分子(pI7)主要吸附于主要吸附于c位点，碱性分子位点，碱性分子(pI7)主要吸附于主要吸附于P位点位点 由于
24、由于HAP晶面晶面具有规则的立体化学结构，可以分辨被吸附分子表面上原具有规则的立体化学结构，可以分辨被吸附分子表面上原子几何排列的微小差别子几何排列的微小差别因此，因此，HAP在在DNA、核苷酸、多肽以及多种蛋白质的分离中得到、核苷酸、多肽以及多种蛋白质的分离中得到广泛的应用广泛的应用蛋白质在无机盐表面的偶极作用蛋白质在无机盐表面的偶极作用工艺条件工艺条件 吸附：吸附：(1)pH在在69之间吸附最有可能发生之间吸附最有可能发生（2）低浓度缓冲液离子（通常是磷酸盐）低浓度缓冲液离子（通常是磷酸盐）（3）低盐浓度）低盐浓度 洗脱：洗脱：（1）增加缓冲液浓度）增加缓冲液浓度（2）高盐浓度中进行）高盐
25、浓度中进行（3）盐可以采）盐可以采 用恒定或梯度形式应用。用恒定或梯度形式应用。紫球藻紫球藻B藻红蛋白的分离藻红蛋白的分离纯化纯化 紫球藻（紫球藻（Porphyridium cruentum)的藻的藻红蛋白粗提物经硫酸铵沉淀及透析后，红蛋白粗提物经硫酸铵沉淀及透析后，分别用分别用羟基磷灰石羟基磷灰石（HA）和）和Sephadex G-100两种方法柱层析两种方法柱层析，均可分离纯化，均可分离纯化出出B藻红蛋白（藻红蛋白（BPE），纯度），纯度（A545nm/A280nm)分别为分别为492和和378，两种方法纯化后的，两种方法纯化后的BPE在聚在聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳时均得到一条带，丙烯酰胺梯
26、度凝胶电泳时均得到一条带，BPE的最大吸收峰在的最大吸收峰在545nm，其室温，其室温荧光发射峰为荧光发射峰为5745nm。藻红蛋白藻红蛋白 可作为荧光探针，用于免疫荧光检测、可作为荧光探针，用于免疫荧光检测、荧光显微、组织化学等方面。荧光显微、组织化学等方面。藻胆蛋白还是理想的天然色素，可应用藻胆蛋白还是理想的天然色素，可应用于食品、化妆品工业于食品、化妆品工业 研究发现从螺旋藻研究发现从螺旋藻中提取的藻蓝蛋白具有直接调节和激活中提取的藻蓝蛋白具有直接调节和激活免疫反免疫反 应的生理活性。应的生理活性。吸附：吸附：1mmolL,PH 6.8 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 预平衡预平衡(1.8cm4c
27、m)层析柱层析柱 上样量上样量:2mL 洗脱：磷酸盐缓冲液洗脱：磷酸盐缓冲液1、5、50、l00、200mmolL，PH 6.8，+0.1MOL/L NaCl溶液溶液 洗脱速度洗脱速度:18mL/h 分步收集洗脱液分步收集洗脱液(每管约每管约4mL)紫球藻紫球藻B藻红蛋白的分离藻红蛋白的分离纯化纯化 B藻红蛋白的洗脱曲线藻红蛋白的洗脱曲线体积排阻层析体积排阻层析 Size Exclusion Chromatography凝胶渗透层析凝胶渗透层析 Gel Permeation Chromatography凝胶排阻层析凝胶排阻层析 Gel Exclusion Chromatography凝胶过滤凝
28、胶过滤 Gel Filtration分子筛层析分子筛层析 Gel Chromatography22.9凝胶层析法凝胶层析法凝胶层析的用途凝胶层析的用途 应用对象应用对象主要是大分子物料，特别主要是大分子物料，特别是蛋白质混合物。是蛋白质混合物。主要优点主要优点相对成本低、操作简便，相对成本低、操作简便，具有相对较大规模操作的能力。具有相对较大规模操作的能力。其它用途其它用途脱盐，生物大分子按分子脱盐，生物大分子按分子大小分级分离以及分子量测定等。大小分级分离以及分子量测定等。特性参数特性参数 排阻极限排阻极限(exclusion limit)分级范围分级范围(Fractionation ran
29、ge)吸水量（吸水量（water regains）凝胶粒径凝胶粒径(凝胶颗粒大小凝胶颗粒大小)床体积（床体积（bed volume）空隙体积（空隙体积（void volume）排阻极限排阻极限不能进入到凝胶网络内部的最小分子不能进入到凝胶网络内部的最小分子的相对分子量，称为排阻极限。这时的相对分子量，称为排阻极限。这时的洗脱体积就等于孔隙体积的洗脱体积就等于孔隙体积V0。譬如譬如Sephadax G50的排阻极限是的排阻极限是30kD。分级范围分级范围能为凝胶阻滞、并且相互之间能为凝胶阻滞、并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分可以得到分离的溶质的相对分子量范围。子量范围。譬如：譬如：Seph
30、adax G50的分级范的分级范围为围为1.5kD30kD。吸水量吸水量(溶胀率溶胀率)干凝胶颗粒在使用前要用水溶液进干凝胶颗粒在使用前要用水溶液进行溶胀处理，行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数称为溶胀率吸收的水分的百分数称为溶胀率，即：即：如：如：Sephadax G50的溶胀率为的溶胀率为500 30。干凝胶重量干凝胶重量溶胀处理后平衡干重溶胀率100凝胶粒径（颗粒大小）凝胶粒径（颗粒大小）凝胶一般为球形，其粒径大小对凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。一般粒径越分离度有重要影响。一般粒径越小，小，HETP越小。越小。软凝胶粒径较大，大分布，一般软
31、凝胶粒径较大，大分布，一般为为50150 m(100200目目)。硬。硬凝胶粒径较小，一般为凝胶粒径较小，一般为550 m。床体积床体积1克干凝胶溶胀后所占有的体积。克干凝胶溶胀后所占有的体积。由此可以估算装满一定体积的层析由此可以估算装满一定体积的层析柱所需的干燥凝胶量。柱所需的干燥凝胶量。譬如，譬如，Sephadax G50的床体积为的床体积为911cm3/g。表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间。表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间。可利用平均分子量为二百万的可溶性蓝可利用平均分子量为二百万的可溶性蓝色葡聚糖来测出。色葡聚糖来测出。空隙体积空隙体积材料及性能要求材料及性能要求作为层析柱最主要成分
32、就是柱内的填作为层析柱最主要成分就是柱内的填料，它对柱的大小和分离效果有明显料，它对柱的大小和分离效果有明显的影响。衡量填料的重要因素量：的影响。衡量填料的重要因素量：化学惰性化学惰性 稳定性稳定性 刚性刚性 孔的大小孔的大小 孔径的分布孔径的分布 化学惰性化学惰性理想的填料对理想的填料对所要分离的物质所要分离的物质是化学惰性的。是化学惰性的。填料应该是亲水性的，疏水表面就有可能出现填料应该是亲水性的，疏水表面就有可能出现蛋白质不可逆变性。蛋白质不可逆变性。填料的表面不带电荷，电荷会产生静电效益，填料的表面不带电荷，电荷会产生静电效益，会减少或增加了它通过柱的速率，影响分子大会减少或增加了它通
33、过柱的速率，影响分子大小的作用关系。使用高带电的填料，会使蛋白小的作用关系。使用高带电的填料，会使蛋白质出现不可逆吸附。质出现不可逆吸附。稳定性稳定性层析剂的稳定性在于：层析剂的稳定性在于：不溶于所处理溶液；不溶于所处理溶液；在所操作的在所操作的pH及温度范围内稳及温度范围内稳定；定；在一些溶剂、盐类或菌种中不在一些溶剂、盐类或菌种中不会降阶；会降阶；刚性刚性 层析剂一般可被分为二类：层析剂一般可被分为二类：可压缩性担体和可压缩性担体和不可压缩性不可压缩性担体。担体。可压缩性担体可压缩性担体：床层的流速先随压力的增：床层的流速先随压力的增加而增加，在经过一个最大值后，就开始下降。加而增加，在经
34、过一个最大值后，就开始下降。流速的限制会造成较长的分离时间，降低产量。流速的限制会造成较长的分离时间，降低产量。不可压缩性担体不可压缩性担体：无上述压力与流速的限：无上述压力与流速的限制，粒子的尺寸也不会产生严重的影响。制，粒子的尺寸也不会产生严重的影响。可压缩担体柱的流速与压差的关可压缩担体柱的流速与压差的关系系uf p孔径分布孔径分布 孔径分布由被处理对象来确定：孔径分布由被处理对象来确定：用于脱盐的层析，要求孔径非常小；用于脱盐的层析，要求孔径非常小；对于蛋白质之间的分离，则要求孔径对于蛋白质之间的分离，则要求孔径与被分离的蛋白质比较接近。与被分离的蛋白质比较接近。严格地符合这些要求有一
35、定困难，有时严格地符合这些要求有一定困难，有时需要折衷。需要折衷。思思 考考 题题 1 理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高度，洗脱体积，分辨率。理论塔板高度，洗脱体积，分辨率。2 不同的层析分类方法各有何意义？不同的层析分类方法各有何意义？3常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？的分离？4 亲和层析的机理是什么？亲和层析的机理是什么？5 配基偶联后残留电荷对分离有何影响？配基偶联后残留电荷对分离有何影响？如何消除？如何消除？6 小分子配基为何需插入手臂？小分子配基为何需插入手臂？7 层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？
