1、蛋白质双向电泳及质谱蛋白质双向电泳及质谱技术技术大连理工大学refine蛋白质双向电泳技术蛋白质双向电泳技术双向电泳简介双向电泳简介l 2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术种蛋白质的技术。l 第一向第一向等点聚焦等点聚焦(IEF)pH梯度载体梯度载体 pIl 第二向第二向十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE)SDS作为变性剂和助溶剂作为变性剂和助溶剂 分子量分子量样品样品等点聚焦等点聚焦(第一向第一向)双向电泳的基本原理与流程示意双向电泳的基本原理与流程示意分子量分子量pH 梯度梯度(pI)SDS-PAGE两性电
2、解质两性电解质pH 9 -pH 3 +聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺第二向第二向双向电泳具体步骤双向电泳具体步骤 样品制备样品制备 缓冲液的配制缓冲液的配制 IPG条重泡涨及上样条重泡涨及上样 第一向：第一向：IEF IPG条平衡条平衡 平衡缓冲液平衡缓冲液(还原还原)平衡缓冲液平衡缓冲液(巯烷基化巯烷基化)第二向：第二向：SDS-PAGE 胶条染色胶条染色 成像及图像分析成像及图像分析为什么要进行样品制备为什么要进行样品制备l 目前双向电泳一般只能分辨到目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质个蛋白质点点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。万种以上
3、。l 待研究样本待研究样本(如临床样本如临床样本)常是各种细胞和组织混常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。？1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少 尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）。白）。避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白完全去除样品中的核酸和某
4、些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。检测性。通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。2 最大限度减少样品的损失最大限度减少样品的损失 低温保存样品低温保存样品(一般需低于一般需低于-86)尽量缩短处理时间尽量缩短处理时间 除盐，省略不必要的过程除盐，省略不必要的过程 保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。样品制备原则样品制备原则样品制备流程及注意事项样品制备流程及注意事项溶解溶解预处理预处理
5、(清洗等清洗等)破碎破碎沉淀沉淀按溶解度分级按溶解度分级富集富集除杂除杂样品的破碎样品的破碎l原则最小限度的减少蛋白水解和其它形式原则最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解的蛋白降解l样品的来源样品的来源l易碎的细胞易碎的细胞l坚硬的组织坚硬的组织l植物细胞植物细胞l真菌真菌方法方法温和温和剧烈剧烈温和破碎法温和破碎法 渗透压冲击渗透压冲击(培养的细胞培养的细胞)低渗液中的悬浮细胞低渗液中的悬浮细胞 反复冻融法反复冻融法(细菌细菌)液氮冷冻液氮冷冻 去污剂降解去污剂降解(酵母、霉菌酵母、霉菌)降解缓冲液降解缓冲液(含尿素和去污剂含尿素和去污剂)SDS(应在应在IEF前去除前去除)酶降解酶降
6、解(植物、细菌、真菌植物、细菌、真菌)溶菌酶溶菌酶(细菌细菌)纤维素酶，果胶酶纤维素酶，果胶酶(植物植物)溶壁酶溶壁酶(酵母酵母)剧烈破碎法剧烈破碎法 超声破碎超声破碎(细胞悬浮液细胞悬浮液)需以冰冷却避免过热需以冰冷却避免过热 弗式细胞压碎器弗式细胞压碎器(French pressure cell，带壁微生物，带壁微生物 细胞在剪切力作用下破碎细胞在剪切力作用下破碎 研磨研磨(固体组织，微生物固体组织，微生物)液氮中将固体组织磨成细粉末液氮中将固体组织磨成细粉末 样品研磨器样品研磨器(用于少量样品的处理用于少量样品的处理)用于精确样品用于精确样品 珠磨法珠磨法(胞悬液，微生物胞悬液，微生物)
7、通过磨珠研磨破坏细胞壁通过磨珠研磨破坏细胞壁 作用作用 去除杂质去除杂质 浓缩样品浓缩样品 抑制蛋白酶活性抑制蛋白酶活性 关键关键-可溶性可溶性 获得可以重新溶解的蛋白获得可以重新溶解的蛋白 常用方法常用方法 硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀 TCA沉淀沉淀 丙酮沉淀丙酮沉淀 TCA/丙酮沉淀丙酮沉淀 醋酸铵醋酸铵/甲醇甲醇/苯酚抽提苯酚抽提样品的沉淀样品的沉淀 对于疏水性特别强的蛋白对于疏水性特别强的蛋白如膜蛋白如膜蛋白 硫脲硫脲 SDS 新型两性表面活性剂新型两性表面活性剂(如磺如磺基甜菜碱基甜菜碱)样品中杂质的去除样品中杂质的去除 去除原则去除原则 尽量不丢失蛋白尽量不丢失蛋白 减少蛋白的修饰减少蛋
8、白的修饰 杂质的主要种类杂质的主要种类 DNA/RNA 脂质脂质 多糖盐多糖盐 离子去污剂离子去污剂 其他固体杂质其他固体杂质DNA/RNA的去除的去除 样品中含核酸的不利影响样品中含核酸的不利影响 能被银染色法染色能被银染色法染色 在凝胶酸性部分产生水平条纹在凝胶酸性部分产生水平条纹 当样品到达当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀 去除方法去除方法 蛋白沉淀法蛋白沉淀法 DNase/RNase处理处理 超声超声(机械破坏机械破坏)、超高速离心、超高速离心 DNA/RNA抽提抽提(苯酚苯酚/氯仿氯仿)其他杂质的去除其他杂质的去除 脂质脂质 使蛋白质不易溶
9、解且会影响其分子量及使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI 丙酮沉淀丙酮沉淀 多糖多糖 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 TCA、硫酸铵或醋酸铵、硫酸铵或醋酸铵/甲苯甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高苯酚沉淀；超速离心和高pH 盐盐 使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生 透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮 离子去污剂离子去污剂 如如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦，使蛋白质带负电不能聚焦 丙酮沉淀；将含丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，Triton X-1
10、00，NP-40等的缓冲液中并使等的缓冲液中并使SDS终浓度终浓度0.25%固体杂质固体杂质 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 过滤过滤样品的溶解样品的溶解 2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一成功分离蛋白质的最关键因素之一 溶解的目标溶解的目标 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点
11、的强度会下降）溶解方法必须允许可能干扰溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除物质的去除 溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态增加样品溶解性的手段增加样品溶解性的手段变性剂变性剂 改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展 尿素、硫尿尿素、硫尿表面活性剂表面活性剂 溶解疏水基团溶解疏水基团 离子去污剂离子去污剂SDS、非离子去污剂、非离子去污剂Triton X-100和和NP-40、两性离子去污、两性离子去污剂剂CHAPS等等还原剂还原剂 使变性蛋白进一步伸展
12、溶解使变性蛋白进一步伸展溶解 含自由巯基的含自由巯基的DTT或或-巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯(TPB)起载体作用的两性电解质起载体作用的两性电解质 到达平衡位置形成到达平衡位置形成pH梯度，梯度，“运载运载”电流、电流、pH 捕获样品中少量盐分捕获样品中少量盐分 浓度应小于浓度应小于0.2（w/v，浓度过高会使，浓度过高会使IEF的速度降低的速度降低)样品液的准备样品液的准备标准液标准液：2g4%CHAPS定容至定容至50mLddH2O100uL 0.1%原液原液0.0002%溴酚蓝溴酚蓝见下表见下表0.2%两性电解质载体两性电解质载体385mg DTT或或
13、500uL 200mM TBP原液原液50mM DTT 或或2mM TBP24g 尿素加入尿素加入 25mL H2O8M 尿素尿素用量用量试剂试剂IPG 用两亲性电解液的组成用两亲性电解液的组成250 l 25 l20%8-10125 l12.5 l40%7-97-10250 l25 l40%5-85-8125 l12.5 l40%4-6250 l25 l40%3-53-6125 l12.5 l40%5-7125 l12.5 l40%4-64-7250 l25l40%3-103-10样品溶液样品溶液体积体积(/5ml)样品溶液样品溶液体积体积(/5ml)两亲性电两亲性电解液浓度解液浓度(w/v
14、)两亲性电两亲性电解液范围解液范围IPG 胶胶pH 范围范围样品制备注意事项样品制备注意事项 蛋白质水解蛋白质水解 低温低温 Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质 蛋白抑制剂蛋白抑制剂 特殊样品的制备特殊样品的制备 低丰度蛋白的分离低丰度蛋白的分离 预分级预分级 窄窄pH胶胶(2个个pH单位单位)强碱性蛋白强碱性蛋白(如核糖体如核糖体)的处理的处理 预处理富集预处理富集 特殊特殊pH梯度的梯度的IPG胶条（如胶条（如pH312、4-12或或10-12）进行等电聚焦）进行等电聚焦 极端分子量蛋白的处理极端分子量蛋白的处理 小于小于8kD 对流混合，产生绒毛状或模糊
15、的带对流混合，产生绒毛状或模糊的带 大于大于200kD的蛋白，变性为多肽的蛋白，变性为多肽梯度器梯度器塑料支持膜塑料支持膜固定固定pH梯度梯度(Immobilized pH Gradient,IPG)胶条的制备胶条的制备ACBFED酸碱 pH 3pH 10固定固定pH 梯度梯度(IPG)示意图示意图聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶CH2=CH-C-NH-ROCOO-丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体酸缓冲基团：酸缓冲基团：碱缓冲基团：碱缓冲基团：NH3+R 宽宽pH梯度及窄梯度及窄pH梯度梯度 宽宽pH梯度用于：梯度用于：全部蛋白全部蛋白(确定感兴趣蛋白确定感兴趣蛋白的大致位置的大致位置)窄窄pH梯度用于：
16、梯度用于：提高分辨率提高分辨率 增加载样能力以检测、分析增加载样能力以检测、分析更多蛋白更多蛋白IPG 胶的重泡涨及上样胶的重泡涨及上样2-DE 样品样品重泡涨溶液重泡涨溶液重泡涨溶液：重泡涨溶液：8M 尿素尿素2%NP-40 或或 CHAPS2%IPG缓冲液缓冲液(两亲性电解液两亲性电解液)0.28%DTT微量微量 溴酚蓝溴酚蓝IPG 胶条支架胶条支架IPG 胶条胶条 定位定位泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内胶条内蛋白载样量蛋白载样量IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：胶条对蛋白载样量的影响因素：待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋
17、白的丰度待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度样品的复杂度样品的复杂度 复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。IPG胶条的胶条的pH范围范围 预试验确定预试验确定 先宽后窄先宽后窄 先线性后非线性先线性后非线性 先短后长先短后长第一向：等点聚焦第一向：等点聚焦1.放置电极垫放置电极垫(?)2.200 V 维持维持 1.5h3.500 V 维持维持 1.5h 4.1000 V 梯度上升梯度上升 150
18、0vh 5.8000 V 梯度上升梯度上升(?)36000vh时间时间电压电压支架盖支架盖IPG 胶条胶条电极电极电极垫电极垫IPG 胶条的平衡胶条的平衡 平衡液平衡液 6 M 尿素和尿素和30%甘油甘油 减少电内渗减少电内渗 第一步平衡第一步平衡 加加DTT 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态使变性的非烷基化蛋白处于还原状态 第二步平衡第二步平衡 加碘乙酰胺加碘乙酰胺 使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化 使被分离的使被分离的蛋白质与蛋白质与SDS完整结合完整结合第二向第二向:SDS-PAGE SDS 平衡平衡 SDS-PAGESDS 平衡液
19、平衡液50 mM Tris-HCl6 M 尿素尿素30%丙三醇丙三醇2%SDS微量微量 溴酚蓝溴酚蓝SDSSDS-PAGESDS-PAGE向电泳缓冲液中加向电泳缓冲液中加 0.5%的琼脂糖的琼脂糖SDS-PAGE标记纸片标记纸片IPG 胶条胶条 胶体考马斯亮蓝染色胶体考马斯亮蓝染色 灵敏度为灵敏度为30100ng，线性范围是，线性范围是20倍倍 可实现可实现PAGE的无背景染色的无背景染色 会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果 胺基黑染色胺基黑染色 转印至聚偏二氟乙烯（转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色）上的蛋白质的染色 转印至硝酸纤维素膜上
20、的蛋白质的染色转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色 银染银染 可减少胶内蛋白质产量可减少胶内蛋白质产量 对某些种类的蛋白质染色效果差对某些种类的蛋白质染色效果差 对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响染色方法染色方法银染色银染色50%甲醇甲醇25%乙酸乙酸4hddH2O 洗洗3次次30min/次次0.004%DTT 溶液溶液30min0.1%AgNO330minddH2O30 sec3%Na2CO30.0185%甲醛甲醛2.3M 柠檬酸柠檬酸5%乙酸乙酸25%甲醇甲醇 负染负染 主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用 能专门
21、提高能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率胶上蛋白质的回收率 速度快（速度快（515min）且能保持蛋白质的生物活性）且能保持蛋白质的生物活性 不能用于膜上染色不能用于膜上染色 适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析 胶体扩散染料胶体扩散染料 主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等 高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质膜上的蛋白质 灵敏度与灵敏度与PAGE胶内的银染类似胶内的银染类似 不用于胶内染色不用于胶内染色染色方法染色方法 有机荧光团染料有
22、机荧光团染料 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用，包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用，其典型代表是已经商品化的其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧等荧光染料光染料 可对可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约胶内蛋白质进行一步染色，约3060min完成完成 灵敏度为灵敏度为210ng其线性范围为其线性范围为3个数量级个数量级 在在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质测序来鉴定蛋白质 金属螯合染
23、料金属螯合染料 与现代蛋白质组学研究相兼容的与现代蛋白质组学研究相兼容的 专门与常用微量化学表征过程兼容专门与常用微量化学表征过程兼容 不包含戊二醛、甲醛或不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合染色方法染色方法凝胶的图像处理分析凝胶的图像处理分析典型流程典型流程 凝胶图像的扫描凝胶图像的扫描 图像加工图像加工 斑点检测和定量斑点检测和定量 凝胶配比凝胶配比
24、 数据分析数据分析 数据呈递和解释数据呈递和解释 2-DE数据库的建立数据库的建立2-DE 分离的可溶性 E.coli 蛋白目前双向电泳需解决的问题目前双向电泳需解决的问题 样品的制备及溶解样品的制备及溶解 不溶性蛋白不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白膜蛋白及核内蛋白)难分离蛋白难分离蛋白(如毛发及皮肤中的蛋白如毛发及皮肤中的蛋白)载样量的提高载样量的提高 初步分离初步分离 低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白 定量分析定量分析 灵敏度及可重复性灵敏度及可重复性对于双向电泳的建议对于双向电泳的建议 首先采用宽首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采范围的胶
25、条，确定蛋白的分布范围，通常采用用pH3-10的胶条的胶条 如果如果pH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条 加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率 采用窄采用窄pH范围的胶条，提高某范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率范围蛋白的分辨率 第二向采用梯度胶进行分离第二向采用梯度胶进行分离 去除高丰度蛋白，进行蛋白的分级处理，富集低丰度蛋白去除高丰度蛋白，进行蛋白的分级处理，富集低丰度蛋白蛋白质质谱技术蛋白质质谱技术质谱基础质谱基础样品样品离子源离子源质量分析器质量分析器离子检测器离子检测器固体固体液体液体蒸汽
26、蒸汽形成离子形成离子(带电分子带电分子)电离电离质量分选质量分选(过滤过滤)检测检测根据根据m/z分选离子分选离子数据处理数据处理质谱质谱检测离子检测离子基本步骤基本步骤:1.样品离子化样品离子化 2.根据质量根据质量(m/z)不同分离离子不同分离离子3.检测每种质量离子的数目检测每种质量离子的数目 4.收集、处理数据得到质谱图收集、处理数据得到质谱图 质谱的评价指标质谱的评价指标 质量范围质量范围 速度速度 灵敏度灵敏度 分辨率分辨率 精确度精确度+自由漂移区自由漂移区检测器检测器基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)样品探针样品探针激光
27、激光335 nmm/z相对强度相对强度MH+MH+MH+特点：特点：灵敏度高灵敏度高准确度高准确度高分辨率高分辨率高质量范围广质量范围广图谱简明图谱简明速度快速度快ESI四级杆质量分析器四级杆质量分析器碰撞室碰撞室反射器反射器MCP检测器检测器碰撞气体碰撞气体串联质谱法串联质谱法(MS/MS)ESI-Q-TOF 质谱仪质谱仪步骤：步骤：1 1质量分析质量分析 2 2碰撞碰撞(离子裂解离子裂解)3 3质量分析质量分析TOF质量分析器质量分析器 强的抗背景干扰能力强的抗背景干扰能力 极高的检测灵敏度和准确极高的检测灵敏度和准确度度 可用来分析复杂混合物中的蛋白质可用来分析复杂混合物中的蛋白质 丰富
28、的检测信息丰富的检测信息，高通量鉴别蛋白质高通量鉴别蛋白质串联质谱的优点串联质谱的优点1、鉴定和注释蛋白质的路线鉴定和注释蛋白质的路线 通过肽质谱指纹图（通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配）和数据库搜寻匹配 通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴定定 鸟枪法蛋白质组学鸟枪法蛋白质组学 1234.5396 783.9147 375.2561多肽多肽 已测得质已测得质 谱数据或理论谱数据或理论 质谱质谱 数据数据MALDI-TOF检测的多肽指纹检测的多肽指纹 胰酶消化胰酶消化凝胶凝胶蛋白质蛋白质数据库
29、数据库?123比较比较:?是否相同是否相同?质谱质谱3235.2256 肽质谱指纹图在数据库中匹配肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因不成功的可能原因 样品量太少，样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质量不好。搜寻的数据质量不好。2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获质，所获PMF图实际上是两个以上蛋白质的图实际上是两个以上蛋白质的混合图。混合图。操作中角蛋白或其他蛋白质的污染操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载未有记载 所用胰
30、蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多段多 未知的新蛋白质未知的新蛋白质 数据库规模太小数据库规模太小 续：续：氨基酸序列氨基酸序列VLDPNTVFAL蛋白质数据库蛋白质数据库？查询？查询串联质谱图串联质谱图从头测序从头测序输入输入输出输出序列片段序列片段PNT串联质谱鉴定多肽的计量方法串联质谱鉴定多肽的计量方法组织切片或印片原位质谱分析技术组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换回旋共振质谱（傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS）表面增强激光解吸表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（电离飞
31、行时间质谱（SELDI-TOF-MS）联合技术精确鉴定蛋白质联合技术精确鉴定蛋白质 2、基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略、基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略 原理：原理：对于具有相同离子化能力的蛋对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽，可以通过比较质谱峰的白质或多肽，可以通过比较质谱峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。的相对量。3、基于质谱的蛋白质相互作用研究方法、基于质谱的蛋白质相互作用研究方法 靶蛋白制备靶蛋白制备 蛋白质复合体的纯化蛋白质复合体的纯化 蛋白质蛋白质复合体复合体的质谱鉴定的质谱鉴定 基本步骤：基本步骤：(1)亲和层析耦联质谱技术亲和
32、层析耦联质谱技术 基本原理：基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或合的蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白）鉴定靶蛋白的结合蛋白。的结合蛋白。得到足够多的保持生物活性的重组得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵（靶蛋
33、白作为诱饵（baitbait）获得足够量、纯度高的与诱饵相互获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质作用的蛋白质 利用含靶蛋白的融合蛋白获得利用含靶蛋白的融合蛋白获得相互作用蛋白质相互作用蛋白质 谷胱甘肽谷胱甘肽S转移酶（转移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白）融合蛋白 蛋白蛋白A融合蛋白融合蛋白主要优点主要优点 灵敏度高：高浓度靶蛋白灵敏度高：高浓度靶蛋白 候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等 检测多亚基蛋白质之间的相互作用检测多亚基蛋白质之间的相互作用 (2)免疫共沉淀耦联质谱技术免疫共沉淀耦联质谱技术 原理：原理：以细胞
34、内源性靶蛋白为诱饵以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化靶蛋白免纯化靶蛋白免疫复合物疫复合物，凝胶电泳分离后凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。白的结合蛋白。研究鼻咽癌细胞系中的研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白相互作用蛋白 抗抗p53抗体与抗体与HNE1和和HNE2总蛋白进行免疫共总蛋白进行免疫共沉淀沉淀 SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物分离免疫沉淀复合物 切取切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（联质谱
35、（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的）分析，得到相应的肽序列标签肽序列标签 搜索数据库搜索数据库 特特 点点 生理条件下蛋白质之间的相互作用生理条件下蛋白质之间的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用 局局 限限 性性A.灵敏性不高灵敏性不高 B.假阳性假阳性C.受免疫球蛋白的干扰较大受免疫球蛋白的干扰较大 Biacore基于基于表面等离子共振表面等离子共振(SPR)进行生物大进行生物大分子相互作用分析分子相互作用分析(BIA)质谱质谱(MALDI-TOF-MS或或LC-ESI-MS/MS)鉴定鉴
36、定Biacore芯片上配体所捕获的生物分子芯片上配体所捕获的生物分子(3)生物传感器耦联质谱技术生物传感器耦联质谱技术 组组 成成 Biacore的基本工作原理的基本工作原理 当生物大分子结合（如蛋白质相互作用）当生物大分子结合（如蛋白质相互作用）时会引起作用表面时会引起作用表面(芯片芯片)折射率的变化，这折射率的变化，这种光信号可被光感受器接受并转换成电信号种光信号可被光感受器接受并转换成电信号传送到计算机，再由计算机还原为模拟的生传送到计算机，再由计算机还原为模拟的生物信号。物信号。(4)串联亲和纯化耦联质谱技术串联亲和纯化耦联质谱技术 基本原理：基本原理：在靶蛋白一端或中部嵌入蛋白在靶蛋
37、白一端或中部嵌入蛋白质标记（质标记（TAP Tag），经过特异性的两步），经过特异性的两步亲和纯化，在生理条件下与靶蛋白相互作亲和纯化，在生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质便可洗脱下来，然后用质谱技用的蛋白质便可洗脱下来，然后用质谱技术对得到的蛋白质复合体进行鉴定。术对得到的蛋白质复合体进行鉴定。主要流程主要流程 双重分子标签构建到靶蛋白双重分子标签构建到靶蛋白表达融合蛋白表达融合蛋白 制备细胞裂解液制备细胞裂解液 IgG柱纯化柱纯化 TEV蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体 耦联钙调素的亲和柱纯化耦联钙调素的亲和柱纯化 洗脱洗脱 含含EGTA的洗脱液洗脱的洗脱液洗脱 质谱鉴定结合蛋白质质谱鉴定结合蛋白质 续：续：特特 点点 获得生理条件下与靶蛋白相互作用获得生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质的蛋白质 鉴定出在空间上非直接物理相互作鉴定出在空间上非直接物理相互作用的蛋白质用的蛋白质 适用于大规模蛋白质相互作用研究适用于大规模蛋白质相互作用研究
