1、流式细胞术分析技术及应用流式细胞术分析技术及应用 王万党王万党2015.08.15中山市小榄人民医院检验科中山市小榄人民医院检验科流式细胞术：流式细胞术：Flow Flow cytometrycytometry1930年，Caspersson 和Thorell开始致力于细胞的计数1934年，Moldaven 试图用光电仪 记录流过一根毛细管的细胞1949 年 Wallace Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法的专利流式细胞的发展史流式细胞的发展史1953年，Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器2-4 color cytometer 10-2
2、0 color cytometer sorter high-end res1953，Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形 1967，发展了一种液流束、照明光轴、检测系统三者垂直的流式细胞仪1969，Van Dilla Fulwyler 发明第一台荧光检测细胞计1975，Kohler 和Milstein 提出单克隆抗体技术流式细胞仪流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单克隆抗体技术为一体量，计算机，细胞荧光化学，单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。的高科技细胞分析仪。流式细胞
3、术流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快利用流式细胞仪对处于快速流动的单个细胞速流动的单个细胞/生物颗粒进行多参数、快速（每秒生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。以上）的技术。流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理液流系统液流系统 流动室流动室 液流驱动系统液流驱动系统光学系统光学系统 激光光源激光光源 光收集系统光收集系统电子系统电子系统 光电转换光电转换 数据处理系统数据处理系统细胞分选系统细胞分选系统液流系统：流动室、液流驱动系统液流系统：流动室、液流驱动系
4、统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。进样孔进样孔鞘液鞘液激光束激光束荧光信号荧光信号FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱为了保证液流是稳液，一般限制液流速度10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。激光光源：气冷式氩离子激光器激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长分色反光镜：反射长/短波长，通过短短波长，通过短/长波长长波长光束成形器：两十字交叉
5、放置的透镜光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通滤片：长通、短通、带通光电倍增管：光电倍增管：FS,SSFS,SS（散射光（散射光），），FL1,FL2,FL3,FL4FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）（荧光）光学系统光学系统Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1(FITC)575BP FL2(PE
6、)620BP FL3(ECD)675BP FL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流式细胞仪光路图流式细胞仪光路图氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以633nm较强。前向散射光信号前向散射光信号细胞大小细胞大小 侧向散射光信号侧向散射光信号细胞内颗粒细胞内颗粒 散射光信号散射光信号外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图用荧光标记抗体抗体特异性地结合细 胞上对应的抗原表达该抗原的细胞被标记上荧光；抗原表达多的细胞荧光强度强阳性细胞百分比或浓度靶蛋白浓度荧光信号荧光
7、信号 FL1 FITC FL2 PE FL3-PC7荧光的产生荧光的产生荧光素种类荧光素种类FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色异硫氰酸荧光素）：绿色 530nmGFP(绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白)：绿色：绿色 PE（藻红蛋白）：橙黄色（藻红蛋白）：橙黄色 575nmPerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色675nmPI(碘化丙啶）：橙红色碘化丙啶）：橙红色 620nmAPC(别藻兰蛋白）：红色别藻兰蛋白）：红色 660nm荧光产生过程荧光产生过程滤光片：滤光片：Optical Filters460 500 540460 500 540460 500 540长通短通带
8、通 光收集系统：光电倍增管（光收集系统：光电倍增管（PMTPMT）荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光一般由光电倍增管（PMT）检测。细胞分选系统细胞分选系统激发光激发光+-电极板电极板单细胞收集管单细胞收集管数据显示数据显示荧光检测器荧光检测器 流式细胞仪的细胞分选器通过喷嘴射出的液柱被分流式细胞仪的细胞分选器通过喷嘴射出的液柱被分割成一连串的割成一连串的小水滴小水滴，然后由充电电路对选定细胞液，然后由充电电路对选定细胞液滴滴充电充电，带电液滴携带细胞通过静，带电液滴携带细胞通过静电场电场而发生而发生偏转偏转，落入收集器中。落入收集器中。数据分析数据分析Positive cellNeg
9、ative Cell CD4 PECD4 PEAbsolute Counts-Cells per m mLPositive CellAbsolute Count BeadsNegative CellCD4 PECD4 PE流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用免疫状态监测免疫状态监测 淋巴细胞亚群/树突状细胞及其他免疫细胞检测血液病血液病 白血病及淋巴瘤免疫分型及微小残留（MRD）检测 血小板检测及网织红细胞和网织血小板计数/PNH检测自身免疫病自身免疫病 HLA-B27检测感染性疾病感染性疾病 CD64检测移植免疫移植免疫肿瘤肿瘤细胞因子检测细胞因子检测免疫状态监测免疫状态监测淋巴细胞亚群
10、淋巴细胞亚群活化的活化的T淋巴细胞淋巴细胞抗原特异性免疫细胞抗原特异性免疫细胞调控性调控性T细胞细胞树突状细胞树突状细胞先天免疫细胞先天免疫细胞淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为B B淋巴细胞（淋巴细胞（CD19+CD19+），），与体液免疫有关与体液免疫有关T T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+CD3+），），与细胞免疫有关与细胞免疫有关总总T T和总和总B B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病病 NKNK细胞（细胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+），），行使免疫监控功能行使免疫监控
11、功能，能够能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据根据CD4CD4、CD8CD8表达，表达，T T淋巴细胞又分为淋巴细胞又分为T T辅助辅助/诱导细胞（诱导细胞（CD3+CD4+CD3+CD4+）T T抑制抑制/细胞毒性细胞（细胞毒性细胞（CD3+CD8+CD3+CD8+）Th/Ts Th/Ts 评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免
12、受到急性可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHDGVHD的攻击的攻击 Th/TsTh/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLESLE）Th/TsTh/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群T淋巴细胞淋巴细胞(CD3+)名名 称称功功 能能辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫 CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反
13、应/杀伤异源细胞 CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高 CD3+CD4-CD8-有调节功能的T细胞,其表达/T细胞受体(TCR/)CD45RA+CD45RO-幼稚的/静止的T淋巴细胞 当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低 CD45RA-CD45RO+记忆性T淋巴细胞 病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T细胞,感染时升高 感染时升高淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群活化
14、活化T淋巴细胞淋巴细胞名名 称称功功 能能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差CD19+CD23+活化的B细胞过敏患者中升高 CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞 自身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高 CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆 淋巴细
15、胞亚群数量检查意义淋巴细胞亚群数量检查意义疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低严重降低 增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活动性肝炎、肝硬化降低正常或增高降低降低肿瘤降低降低增高降低降低非特异性的先天免疫细胞细胞细胞:占外周血占外周血T细胞的细胞的10以下，非抗原依赖型免疫细以下，非抗原依赖型免疫细胞，在传染病、肿瘤病人外周血数量增加，表达胞，在传染病、肿瘤病人外周血数量增加，表达CD3量较普通量较普通T细胞多细胞多NK细胞：占外周血淋巴细胞细胞：占外周血淋巴细胞825，传染病和肿瘤病人数，传染病和肿瘤病人数量偏低。量偏低。NK细胞可以根据细胞可
16、以根据NKR的不同而分类，丙型肝炎的发的不同而分类，丙型肝炎的发生和预后可能与生和预后可能与NK细胞的表型相关细胞的表型相关树突状细胞（树突状细胞（DC）：分布在淋巴组织和外周血，机体主要的）：分布在淋巴组织和外周血，机体主要的抗原提呈细胞抗原提呈细胞Treg细胞：调节性细胞：调节性T细胞，自身免疫性疾病的发生关系密切细胞，自身免疫性疾病的发生关系密切血液学中的应用血液学中的应用1）白血病和淋巴瘤的免疫分型）白血病和淋巴瘤的免疫分型2）微小残留（）微小残留（MRD）检测）检测3）CD34+造血干造血干/祖细胞的检测祖细胞的检测4）活化血小板及网织血小板的检测）活化血小板及网织血小板的检测5）阵
17、发性睡眠性血红蛋白尿症（）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）6）网织红细胞计数）网织红细胞计数流式细胞的免疫分型流式细胞的免疫分型是白血病分型的重要指标是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合标准，形态学和免疫表型结合适合于白血病的分型诊断，但不适合用于适合于白血病的分型诊断，但不适合用于确诊是不是白血病。确诊是不是白血病。Minimal residual diseases(MRD)诊断白血病主要标志：B-ALL:CD34,HLA-DR,CD19,CD10+/-,cCD79aT-ALL:CD34,CD38,CD7,CD2+/-,CD5+/-,cCD3AML:CD34,CD117
18、,CD33,CD13,cMPOM3:CD34-,HLA-DR-M2:CD19+:t(8,21)M4/M5:CD14+M6:GlyA+,CD71+M7:IIb/IIIa(CD41,CD61)+M4M5M6M7T-ALLB-ALLM2M3微小残留（微小残留（MRDMRD）检测）检测白血病微小残留是指患者经过治疗取得完全缓解（CR）后体内残留的微量白血病细胞。白血病微小残留病是白血病复发的主要根源。检测MRD可早期预测白血病复发的可能性、判断疗效、研究白血病发生发展的特征。2）CD34+造血干造血干/祖细胞的检测。主要用于干细胞移植祖细胞的检测。主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。及基因治疗方面
19、的检测。3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞性疾病，）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现活化的血小板增多如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如果出现网织血小板增多，则。而血小板减少的患者，如果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的原因为血小板破坏过多所致。说明血小板减少的原因为血小板破坏过多所致。CD41a是特异的血小板表面标记CD61是特异的泛血小板表面标记PAC-1为早期血小板活化指标CD62p为血小板活化的后期指标CD41-CD61复合物检测可提示血小板无力症CD41a-CD42b复合物检测可提示巨大血小板血
20、症临床意义：1、评估患者血小板活化能力2、检测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成3、辅助诊断血小板活化相关的疾病:血小板无力症、巨大血小板综合症、肝素诱导的血小板减少症、血栓4、鉴别细菌感染和病毒感染性疾病4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）发病机制为X染色体上的PIG-A基因发生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞或WBC上出现CD55或/和CD59表达下降，且患者体内的红细胞呈现不均一性，可诊断为PNH。5
21、）网织红细胞计数）网织红细胞计数A：正常人，B-D均为PNH患者HLA-B27检测检测 HLA-B27是在有核细胞上表达的I型MHC分子，在淋巴细胞表面尤为丰富 强直性脊柱炎，HLA-B27阳性率达90%，其表达与强直性脊椎炎高度相关。CD64检测检测 CD64主要表达与巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞表面，中性粒细胞表面几乎不表达，当机体患感染性疾病时，中性粒细胞表面CD64表达迅速升高。CD64用于感染性疾病的早期诊断，区分感染和活动性的自身免疫性疾病，监测抗菌药物疗效并预测术后感染，鉴别细菌感染和病毒感染 可溶性蛋白检测可溶性蛋白检测CBA（Cytometric Beads Array）采
22、用的是夹心免疫分析方法，捕捉抗体包被在微球上采用的是夹心免疫分析方法，捕捉抗体包被在微球上微球微球:直径直径4.4 4.4 和和5.5 m 5.5 m 的两种聚乙烯小球的两种聚乙烯小球 抗体通过羧基与微球连接抗体通过羧基与微球连接检测不同指标的微球其内部荧光或大小不同检测不同指标的微球其内部荧光或大小不同ELISAELISA的原理的原理.ABCDEFGHI1 2 3 4 5 6 7 8 9FL4-H or Red-AFL3-H or NIR-A从单一小体积样本中得到多项检测结果对所有的检测项目，只需要制备一个标准混合物来绘制标准曲线避免人为造成的酶联放大的假阳性信号产生用更少的时间和精力，却得到大量的结果B7H4慢病毒转染实验慢病毒转染实验293T A549 ，B7H4 及 GFP转染，荧光表达较慢，大约第4天的时候出现绿色荧光
