1、流式细胞学在血液病流式细胞学在血液病中的临床中的临床应应用（基础篇）用（基础篇）吴雨洁吴雨洁江苏省人民医院江苏省人民医院2014.10.292014.10.29网络课堂网络课堂 流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念=流式细胞术流式细胞术是一项集激光技术、流体力学技术、光电测是一项集激光技术、流体力学技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技技术。技术为一体的新型高科技技术。=快速、准确、客观，多参数，可同时对特定群体快速、准确、客观，多参数，可同时对特定群体加以分选。加以分选。=研究对象为生物颗粒，
2、如各种细胞、微生物及人研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等。工合成微球等。=研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。加以定量。是当代最先进的细胞定量分析技术是当代最先进的细胞定量分析技术=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=微量残留白血病细胞检查微量残留白血病细胞检查=阵发性睡眠性血红蛋白尿阵发性睡眠性血红蛋白尿=多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤=干细胞计数干细胞计数=肿瘤细胞的周期和倍体分析肿瘤细胞的周期和倍体分析=网织红细胞和网织血小板计数网织红细胞和网织血小板计数=免疫状态监测免疫状态监测=血小板功能及相关疾病
3、血小板功能及相关疾病=HLA-B27HLA-B27流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用标本来源：标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他血清或各类体液样本。血清或各类体液样本。肝素肝素抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为4872小时；小时；EDTA抗凝标本，存放时限只有抗凝标本，存放时限只有12 24小时，因为髓细胞小时，因为髓细胞在此条件下会裂解；在此条件下会裂解；直方图直方图 散点图散点图二维等高图二维等高图密度图密度图常见的几种流式细胞图常见的几种流式细胞图 设设 门门02004006008
4、001000Side Scatter淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群一：白血病免疫分型白血病诊断依赖于多种检测方法白血病诊断依赖于多种检测方法样本形态学流式细胞术细胞遗传学/FISH分子生物学 基础和金标准 必需 重要急性白血病免疫分型的价值急性白血病免疫分型的价值 区分淋系、髓系白血病 区分淋系白血病中的T、B-ALL 鉴定混合细胞性白血病的类型：T-M、B-M、T-B、T-B-M 治疗过程中监测MRD，评价疗效 提示某些遗传学异常：CD19+AML-t(8;21)；CD13+CD33+B-ALL-t(9;22)提示预后：CD56等阳性的AML患者预后不良 CD15阳性的AML患者CR率高正常造血细
5、胞各系列抗原表达的演进正常造血细胞各系列抗原表达的演进不不 管管 是是 在在 胚胚 胎胎 期期 、老、老 年年 期期 、还、还 是是 化化 疗疗 以以 后，正后，正 常常 造造 血血 细细 胞胞 抗抗 原原 组组 合合 的的 表表 达达 模模 式式 都都 不不 改改 变。变。造血细胞抗原组合的表达模型能够用于鉴别恶性克隆造血细胞抗原组合的表达模型能够用于鉴别恶性克隆!白血病克隆与正常细胞之白血病克隆与正常细胞之间抗原表达不同间抗原表达不同-白血病白血病相关相关的的免疫表型免疫表型（LAIP）免疫分型常用的抗体 干祖细胞 CD34、TDT、CD117、CD38、HLA-DR、AML CD33、C
6、D13、CD11b、CD15、CD64、CD14、MPO怀疑M6加做CD71、GPA怀疑M7加做CD61、CD41、CD42 B-ALL CD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、cCD22/CD79a T-ALLCD10、CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、CD1a、cCD3 NK细胞CD16、CD56、CD57 浆细胞CD38、CD138、c、c、CD19、CD56根据骨髓细胞根据骨髓细胞CD45/SSC CD45/SSC 图中分布情况图中分布情况设门圈定各类细胞设门圈定各类细胞R1 R1 门为成熟淋巴细胞门为成熟淋巴细胞R2 R2 门为正常单核细胞位置门为正常单核细
7、胞位置R3 R3 门正常粒细胞位置门正常粒细胞位置R4 R4 门为幼稚淋巴细胞出现位置门为幼稚淋巴细胞出现位置R5 R5 门为有核红细胞或细胞碎片位置门为有核红细胞或细胞碎片位置R6 R6 门为幼稚髓细胞出现位置门为幼稚髓细胞出现位置白血病细胞通常会在白血病细胞通常会在R4 R6 R4 R6 两门位置两门位置处出现处出现正常成人骨髓样本正常成人骨髓样本-CD45-CD45设门设门100101102103104CD45 PerCPAML-M1AML-M2AML-M3结论：结论：ANLL,ANLL,建议结合染色体和分子生物学和形态学诊断建议结合染色体和分子生物学和形态学诊断M3M3。R1R2 结论
8、：结论：ANLLANLL，伴单核细胞分化，免疫表型符合，伴单核细胞分化，免疫表型符合M4M4。100101102103104CD45 PerCP100101102103104CD45 PerCP结论：结论：ANLLANLL，伴单核细胞分化，免疫表型符合，伴单核细胞分化，免疫表型符合M5M5。结论：结论：ANLLANLL，建议结合形态学以确诊，建议结合形态学以确诊M6M6。R1R2R3R4AML-M7100101102103104CD45 PerCPB-ALLT-ALL 100101102103104CD45 PerCPEGIL Scoring System For BAL(2points)Sc
9、oreB-lymphoidT-lymphoidMyeloid2CD79aCD3MPOcCD22Anti-TCRa/bAnti-TCRg/d1CD19CD2CD117CD20CD5CD13CD10CD8CD33CD10CD650.5TdTTdTCD14CD7/1aCD15/64Requirements for assigning more than one lineage to a single blast population Myeloid lineage Myeloperoxidase(flow cytometry,immunohistochemistry or cytochemistry
10、)or Monocytic differentiation(at least 2 of the following:NSE,CD11c,CD14,CD64,)T lineage Cytoplasmic CD3(flow cytometry with antibodies to CD3 epsilon chain;immunohistochemistry using polyclonal anti-CD3 antibody zeta chain,which is not T-cell specific)or Surface CD3(rare in mixed phenotype acute le
11、ukemia)B lineage Strong CD19 with at least 1 of the following strongly expressed:CD79a,cytoplasmic CD22,CD10 or Weak CD19 with at least 2 of the following strongly expressed:CD79a,cytoplasmic CD22,CD10MPAL(mixed phenotype acute leukemia)WHO 2008CD19+CD22+CD10-CD15+(B-lineage ALL)B-negative,CD64+CD14
12、+/-CD33+(MonocyticLeukemia)Two Leukemic PopulationsMonoblastsLymphoblasts结论：急性混合细胞白结论：急性混合细胞白血病血病(AM-LL)(AM-LL)二二.白血病微小残留病灶白血病微小残留病灶（MRDMRD）目的：目的：判断预后，指导个体化分层治疗，预测复发B-ALL:多数表达CD34、CD38dim、TDT、CD19、CD10str、CD20,这些标志的任意组合CD34/CD22、CD34/CD20、TDT/CD10等，也可加上某些异常标志如 CD13、CD33、CD15即可将ALL细胞与正常骨髓和外周血细胞分开（608
13、0%）。T-ALL:TDT结合T细胞表面标志如CD5或CD3，加上cCD3(90%).AML:CD34、CD56、CD15在内的多种组合，表达TDT、CD13、CD33与散射光及抗原密度，可确定残留的AML细胞（7080%）LEUKEMIA LEUKEMIA AT DIAGNOSISAT DIAGNOSISNORMALNORMALDAY290.039%100101102103104CD45 PerCP100101102103104CD45 PerCP2013.4.21,原始细胞占79.2%2013.5.18，MRD:1.09%CD19/CD33/CD10/CD20 三三.成熟淋巴细胞增殖成熟淋
14、巴细胞增殖性疾病性疾病v慢性淋巴细胞白血病慢性淋巴细胞白血病v幼稚淋巴细胞白血病幼稚淋巴细胞白血病v毛细胞白血病毛细胞白血病v脾边缘区淋巴瘤脾边缘区淋巴瘤v大颗粒淋巴细胞白血病大颗粒淋巴细胞白血病v皮肤皮肤T T细胞淋巴瘤相关白血病细胞淋巴瘤相关白血病 循环淋巴细胞增殖性疾病循环淋巴细胞增殖性疾病这类疾病必须有流式细胞术的辅助诊断！这类疾病必须有流式细胞术的辅助诊断！正常淋巴细胞淋巴细胞增殖性疾病(克隆扩增)TB NKor or 确定克隆来源！确定克隆来源！lB-LPD:B淋巴细胞出现轻链的单一抑制性表达；lT/NK-CLPD:由于缺乏单克隆的标记物，通过FCM诊断成为难点。正常正常单克隆单克
15、隆双克隆双克隆单克隆单克隆CD20+细胞CD19CD19+淋巴细胞增多的鉴别诊断淋巴细胞增多的鉴别诊断Dighiero G,Hamblin TJ.Lancet,2008,371(March 22),1017B-LPD(lymphoproliferative disease)R1结论：结论：CLL/SLL.CLL/SLL.结论：慢性结论：慢性B B淋巴细胞增殖性疾病，建议进一步淋巴细胞增殖性疾病，建议进一步FISHFISH检检测测t(11;14)t(11;14)以确诊以确诊MCL.MCL.R1R1结论：免疫表型符合结论：免疫表型符合HCL,HCL,建议结合形建议结合形态学和临床明确诊断。态学和临
16、床明确诊断。R1R2R3R4R4R51 1、前驱、前驱T T淋巴母细胞白血病淋巴母细胞白血病/淋巴瘤（淋巴瘤（T-ALL/T-LBLT-ALL/T-LBL）2 2、母细胞性、母细胞性NKNK细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤3 3、慢性前淋巴细胞白血病、慢性前淋巴细胞白血病/淋巴瘤（淋巴瘤（T-CLL/T-PLLT-CLL/T-PLL）4 4、颗粒淋巴细胞白血病（、颗粒淋巴细胞白血病（T-LGLT-LGL）5 5、侵袭性、侵袭性NKNK细胞白血病（细胞白血病（ANKCLANKCL）6 6、成人、成人T T细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤/白血病（白血病（ATCL/LATCL/L）7 7、节外、节外NK/TNK/T细胞淋
17、巴瘤，鼻型（细胞淋巴瘤，鼻型（NK/TCLNK/TCL）8 8、肠病型、肠病型T T细胞淋巴瘤（细胞淋巴瘤（ITCLITCL）9 9、肝脾、肝脾TT细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤1010、皮下、皮下脂膜脂膜样样T T细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤1111、菌样霉菌病、菌样霉菌病/赛塞里赛塞里(SezarySezary)综合征综合征(MF/SS)(MF/SS)1212、间变性大细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL),T(ALCL),T和非和非T T非非B B细胞细胞,原发性皮肤型原发性皮肤型1313、周围、周围T T细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤(PTL)(PTL)1414、血管免疫母细胞、血管免疫母细胞T T细胞淋巴瘤
18、细胞淋巴瘤(AITCL)(AITCL)1515、间变性大细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL),T(ALCL),T和非和非T T非非B B细胞细胞,原发性全身型原发性全身型WHO2008成熟成熟T/NKT/NK细胞肿瘤细胞肿瘤淋巴增殖性疾病分类免疫表型特征1.1.光散射信号的异常：光散射信号的异常：FSFS R1R22.2.抗原丢失抗原丢失75成熟肿瘤T细胞会丢失正常抗原CD7是最易发生丢失的抗原CD2和CD5也是经常发生丢失的抗原3.3.抗原表达异常：抗原表达异常：如：伴如：伴CD10CD104.4.抗原表达强度异常：抗原表达强度异常：R1正常：正常：CD4/CD8=1.5-2.5:1C
19、D4/CD8=1.5-2.5:1肿瘤细胞出现肿瘤细胞出现CD4CD4或或CD8CD8某一个群体的限制性表达模式：某一个群体的限制性表达模式：CD4+,CD8-CD4+,CD8-CD4-,CD8+CD4-,CD8+CD4+CD8+CD4+CD8+CD4-CD8-CD4-CD8-多见5.5.细胞群体数量的异常增加以及抗原细胞群体数量的异常增加以及抗原的限制性表达：的限制性表达：R2常见常见T-CLPDT-CLPD免疫表型免疫表型 T-幼稚淋巴细胞白血病(T-PLL）通常CD4+or CD4+CD8+,PB:55%幼淋细胞R1R2杭杭XX,XX,女女/60,/60,结果：异常淋巴细胞结果：异常淋巴细
20、胞占占47.4%47.4%，表达表达 CD3-cCD3+CD4+CD8+CD5-CD3-cCD3+CD4+CD8+CD5-占比例占比例47.4%47.4%，表型符合表型符合T-PLL.T-PLL.血管免疫母细胞淋巴瘤(AITCL):CD4+CD2+CD5+CD10+CD26-,CD7-,CD3-常见常见T-CLPDT-CLPD免疫表型免疫表型Total Events:10000Region%GatedR182.35R246.43R2R1患者，丁患者，丁XX,XX,男男/59/59 淋巴结淋巴结骨髓骨髓结论:异常T淋巴细胞占78%,抗原表达异常(CD3-CD4+CD7-CD10+CD2+CD5+
21、),提示T-CLPD外周T细胞淋巴瘤（PTCL）骨髓侵犯:CD4+,多数CD7-and/orCD5-R1R2R3R4R4常见常见T-CLPDT-CLPD免疫表型免疫表型成人成人T T细胞淋巴瘤（细胞淋巴瘤（ATLLATLL）:CD4+CD2+,其他T系抗原可有缺失 部分伴有髓系抗原表达：CD13，CD33，CD15 外周血：多形核淋巴细胞 确诊：HTLV-1基因阳性 常见常见T-CLPDT-CLPD免疫表型免疫表型 T-LGL CD4+or CD8+，伴有NK抗原表达CD16+，CD57+，部分CD56+形态学：大颗粒淋巴细胞R1常见常见T-CLPDT-CLPD免疫表型免疫表型TCRVTCRV
22、限制性表达限制性表达1.包含24种抗体，两种荧光素，识别70V亚家族；2.在诊断和MRD监测中的作用R1R2R1R2STRUCTURE OF T CELL RECEPTORBecause TCR is a part of CD3 complex,vbeta analysis cannot be used for surface CD3-negative T cells.部分病例运用免疫标记物难以将恶性成熟T淋巴细胞从正常T淋巴细胞中精确鉴别(反应性或克隆性)。原因：1.肿瘤细胞被反应性T细胞掩盖 2.CD8+占优势群体还见于：V感染(AIDS,EBV)，BMT后 临床特点对诊断更为重要！临床特
23、点对诊断更为重要！流式诊断流式诊断NKNK细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤典型：CD2+,CD16+,CD56+,CD122+,CD3-没有特征性抗体区分肿瘤和反应性NK细胞：数量以及FSKIR：KIRs、CD94/NKG2；均一性表达KIR同种型 四四.阵发性睡眠性血红阵发性睡眠性血红蛋白尿蛋白尿阵发性睡眠性血红蛋白尿症（阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNHPNH）补体介导的血管内溶血为特征的获得性造血干细胞克隆性疾病补体调节蛋白补体调节蛋白CD55CD55、CD59CD59、CD16CD16、CD24CD24、CD14CD14、FlaerFlaer等等样本收集：样本收集：优先选择外周血，不推荐骨髓抗凝剂:
24、EDTA、肝素RBC最多可存放至7天WBC必须在48小时内检测（粒细胞上的抗原表达和散射会随着时间而改变）CCSCCS指南推荐对指南推荐对 2 2种细胞系进行检测种细胞系进行检测 标本类型 抗凝剂标本储存常规检测：常规检测：敏感度1%，获取5000个目的细胞高敏检测：高敏检测：敏感度0.01%，获取250，000个目的细胞中性粒细胞：中性粒细胞：必做红细胞：红细胞：中性粒细胞检出PNH克隆时必做，或全部标本都做，但单独检测不推荐单核细胞：单核细胞：可提供稳定的结果淋巴细胞：不推荐细胞获取目的细胞抗体的选择仅检测CD55/CD59-不推荐 敏感性：5-10%(Sutherland and al,
25、Cytometry Part B 72B:167-177)Flaer-组成高特异性的 PNH Panel 红细胞分析：红细胞分析：优点优点：与 WBC相比，RBC检测能更好地鉴别II型细胞。缺点：缺点：输血和溶血会造成PNH克隆大小检测值偏低。单检测红细胞不能充分评估单检测红细胞不能充分评估PNHPNHI型：正常红细胞II型：CD59部分缺失的PNH克隆III型：CD59完全缺失的PNH克隆同个患者的红细胞和粒细胞检测结果粒细胞PNH克隆：54.5%红细胞PNH克隆：6.1%溶血/输血对PNH克隆大小的影响红细胞分析红细胞分析-抗体选择和分析抗体选择和分析 CD59优于CD55CD59在红细胞
26、上的表达水平远高于CD55 结果分析：PNH细胞比较多时，适合使用直方图异常细胞数少时，适合使用散点图同一个患者，CD59能区分出II型和III型细胞，CD55则不能红细胞PNH克隆很少时，适合散点图分析中性粒细胞和单核细胞都可以检测。不适宜采用淋巴细胞白细胞分析白细胞分析-检测PNH克隆最好的方法 CD59最早用于检测粒系PNH克隆的标记物 FLAER-能和WBC上所有的GPI锚连蛋白特异性结合：当前当前成为最佳标记物成为最佳标记物 CD14是表达在单核细胞上的GPI锚连蛋白，用于检测单核细胞的PNH克隆。CD24是表达在粒细胞上的GPI锚连蛋白，用于检测粒细胞的PNH克隆。白细胞分析白细胞
27、分析-检测PNH克隆最好的方法什么是什么是FLAER?FLAER(FLuorescent AERolysin），荧光标记的嗜水气单胞菌溶素，它不是单克隆抗体，而是灭活的细菌蛋白质，能和WBC上所有的GPI锚连蛋白特异性结合。FLAERCD24FLAERCD14ICCS PNH指南:WBC检测的组合Colors细胞细胞类型类型1234563 colorGFLAERCD24CD153 colorMFLAERCD14CD334 colorGFLAERCD24CD15CD454 colorMFLAERCD14CD33CD454 colorG+MFLAERCD24CD14CD335 colorG/MFL
28、AERCD24CD14CD15/CD33CD455 colorG+MFLAERCD24CD14CD15CD336 colorG+MFLAERCD24CD14CD15CD33CD45Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry.Borowitz MJ,Craig FE,DiGiuseppe JA,Illingworth AJ,Rosse W,Sutherland DR,Wittwer CT,Rich
29、ards SJ.Cytometry Part B 2010100101102103104CD45 PerCPflaer.009粒细胞PNH克隆大小 89.5%单核细胞PNH克隆大小 87.2%1例患者的粒和单核细胞FLAER散点图 五五.多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤 浆浆细胞细胞为为CD138CD138+CD38CD38+，通常使通常使用用CD138CD138和和或或CD38CD38设门，另外，正常浆细胞的表面标记为设门，另外，正常浆细胞的表面标记为CD19CD19+CD56CD56-，而多发性骨髓瘤细胞通常而多发性骨髓瘤细胞通常为为CD19CD19-CD56CD56+、cIgcIg克隆性克隆性表达。表达。02004006008001000FSC-Height100101102103104CD138 FITC100101102103104Anti-Kappa FITC1 1例多发性骨髓瘤免疫表型例多发性骨髓瘤免疫表型1例例PB采集物采集物CD34计数（计数（ISHAGE方案）方案）6.6.造血干细胞造血干细胞CD34CD34检测检测-血液病治疗及移植国际联合会(ISHAGEISHAGE方案方案)1.流式在血液病的诊断及MRD监测中具有高度敏感性和特异性;2.强调多个群体分析的重要性；3.流式应以临床为基础，与病理、形态、遗传学、分子生物学等诊断技术相互补充，综合分析。总结与展望
