1、流式细胞术原理和应用流式细胞术原理和应用王秀莉2011.9.30一一 简简 介介流式细胞仪的特点流式细胞仪的特点=单个细胞或微粒分析=同时多参数分析=速度快：10000个细胞(微粒)/秒=统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况=分选感兴趣的细胞或微粒举例：细胞周期分布检测流路 (液流系统）流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml光路（光学系统）光源滤片电路（检测系统）光电倍增管PMT放大电路HV及GAIN 增益A/D转换统计（分析系统）计算机 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成
2、，并在石英玻光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为璃中央开一个孔径为430m180m的长方形孔，的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。液流系统流动室流动室Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath
3、fluid液流系统 激光光源：目前台式机激光光源：目前台式机FCM，大多采用，大多采用氩离子气体激光器。激光氩离子气体激光器。激光(laser)是是种种相干光源，相干光源，它能提供单波长、高强度及它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为每个细胞经过光照区的时间仅为1s左右，左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照的
4、强度有关，因此细胞需要足够的光照强度。强度。光学系统信信 号号 散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性 荧光信号 FL1 FL1 FITC FITC FL2 FL2 PE PE FL3 FL3 ECDECD FL4 FL4 PC5 PC5光学系统散射光信号 细胞大小及颗粒性FSSS光学系统光路 （滤片特性）LONG(700nm)550 Long Pass(650LP)650 Short Pass(600SP)SHORT(500nm)Pass Through Filters600/100 Band Pass(600/100)Transmitted 550 nm550-650 nm(6005
5、0)Wavelengths Blocked650 nm550 nm650 nmShort PassLong PassBand PassLONG(700nm)550 Long Pass(650LP)650 Short Pass(600SP)SHORT(500nm)Dichroic FiltersTransmitted 550 nmDiflected 90650 nm550 nm光学系统流式细胞仪光路图流式细胞仪光路图Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward Scatte
6、rDetectorSide ScatterDetector525BP FL1(FITC)575BP FL2(PE)620BP FL3(ECD)675BP FL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL光学系统电路 电压调节 光电倍增管光电倍增管 电压电压 voltsvolts 增益增益 GainGain 信号放大方式信号放大方式检测系统 电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。细胞DNA含量、RNA含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍，通常使用对数放大器。检测系统常用荧光染料介绍 F
7、ITC：绿色 525nm PE：橙黄色 575nm ECD：橙红色 610nm PECY5：深红色 675nm PerCP：深红色 675nm PECY7：深红色 755nm 7AAD：深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发光路补偿光路补偿FITCFITC/PEPE/ECDECD/PC5PC51.单参数一维直方图 纵坐标表示细胞数，横坐标表示相对荧光信号或散色光信号值，单位是道数。2.双参数二维点图显示来自同一细胞的两个参数与细胞数量间的关系。横、纵坐标分别表示两个参数的相对含量。通过分别计算两坐标所表示参数的阳性率来得到实验结果。3.等高线图
8、 4.密度图 白血病免疫分型白血病免疫分型 HLA-B27:强直性脊柱炎强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞网织红细胞 PNH诊断（诊断（CD55、CD59）血小板活化试验血小板活化试验1 流式细胞术的临床应用流式细胞术的临床应用 细胞大小细胞大小 细胞的颗粒度细胞的颗粒度 细胞表面分子：细胞表面分子：CD 系列系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡细胞功能检测：细胞周期、凋亡2 流式细胞术的科研应用流式细胞术的科研应用 荧光信号的定
9、量可以用 平均荧光强度（mean值），荧光信号面积（Area，A）来表示。1）蛋白表达的检测2）DNA AnalysisPIEthidium BromideAcridine OrangeDAPI(UV excitable)Hoechst 33342(viable,UV excitable)不能主动进入细胞，需要固定打孔488nm激发为脂溶性，主动进入细胞UV激发常用的常用的DNA 染料染料0 200 400 600 8001000CountCounts0 200 400 600 8001000PI Fluorescence0 75 150 225 300DNA Analysis3）Apopto
10、sis 检测检测A）DNA片断化检测片断化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50300kbp长的DNA大片段,或180200bp整数倍的寡核苷酸片段 B）Caspase-3活性的检测活性的检测 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。C）Annexin V Assay磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中,Annexin
11、-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合 Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡能够区分死亡与凋亡D）TUNEL 细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）五 实例细胞周期检测ABCDGFP融合基因的细胞周期检测蛋白表达的检测凋亡检测(Annexin V/PI双染）
