1、珠海红树林海洋真菌代谢物抗肿瘤活性筛选珠海红树林海洋真菌代谢物抗肿瘤活性筛选答答 辩辩 人：吴水平人：吴水平指导老师：蔡小玲指导老师：蔡小玲 讲师讲师中山大学化学与化学工程学院第八届创新化学实验与研究基金项目结题答辩化学与化学工程学院海洋天然有机物研究室研究背景和意义研究背景和意义 海洋微生物天然产物是近年来寻找新药的海洋微生物天然产物是近年来寻找新药的国际研究热点，从海洋微生物的天然产物国际研究热点，从海洋微生物的天然产物中筛选具有活性的化合物成为先导化合物，中筛选具有活性的化合物成为先导化合物，具有重大的理论意义和应用价值。具有重大的理论意义和应用价值。红树林作为海洋与陆地植物圈的接合部，
2、红树林作为海洋与陆地植物圈的接合部，其伴生的微生物类群属海洋微生物，又具其伴生的微生物类群属海洋微生物，又具有植物内生微生物的特点，这也造就了红有植物内生微生物的特点，这也造就了红树林内生真菌具有独特的代谢途径和遗传树林内生真菌具有独特的代谢途径和遗传背景，因此对它们的代谢产物进行活性物背景，因此对它们的代谢产物进行活性物质的筛选研究可能会有可喜的发现质的筛选研究可能会有可喜的发现。研究出发点及创新之处研究出发点及创新之处 一般抗肿瘤药物长期使用后肿瘤细胞会出现一般抗肿瘤药物长期使用后肿瘤细胞会出现对它们的耐药性，而人拓扑异构酶对它们的耐药性，而人拓扑异构酶（hTopo）靶位药物在临床上不易出
3、现耐）靶位药物在临床上不易出现耐物性。物性。由于细胞代谢的特异性，分子水平上以由于细胞代谢的特异性，分子水平上以hTopo为靶位的体外筛选模型筛选得到的为靶位的体外筛选模型筛选得到的有效样品进入细胞后可能会被代谢转化成无有效样品进入细胞后可能会被代谢转化成无活性的产物。同时在分子水平和细胞水平上活性的产物。同时在分子水平和细胞水平上进行抗肿瘤药物活性筛选，综合两者的筛选进行抗肿瘤药物活性筛选，综合两者的筛选结果，会得出更为有效可靠的结果。结果，会得出更为有效可靠的结果。实验思路实验思路从珠海红树林植物组织及根部泥从珠海红树林植物组织及根部泥样中分离出新的海洋真菌菌株样中分离出新的海洋真菌菌株。
4、通过以人通过以人DNA拓扑异构拓扑异构酶酶为靶位点的抗肿瘤药为靶位点的抗肿瘤药物筛选模型进行真菌代谢物筛选模型进行真菌代谢物抗肿瘤活性初筛物抗肿瘤活性初筛。用用 MTT法测试真菌代谢法测试真菌代谢物对受试肿瘤细胞的细物对受试肿瘤细胞的细胞毒性胞毒性。从真菌培养液中获取中等极性的从真菌培养液中获取中等极性的真菌代谢粗提物真菌代谢粗提物确定以人确定以人DNA拓扑异构酶拓扑异构酶为靶为靶位点的抗肿瘤活性菌株位点的抗肿瘤活性菌株 一共分离出红树林海洋真菌209株，具体情况见下表。海桑海桑阔苞菊阔苞菊卤蕨卤蕨木榄木榄秋茄秋茄桐花树桐花树无瓣海桑无瓣海桑银叶树银叶树合计合计根部泥根部泥718420根根72
5、9119茎茎163355112348皮皮257367351叶叶852833938花花1113果果85184430合计合计71920271637623209表表1 按树种、部位分离菌株数目统计按树种、部位分离菌株数目统计 代谢物对代谢物对hTopo抑制活性筛选抑制活性筛选 获取海洋真菌代谢粗提物获取海洋真菌代谢粗提物终止反应，用终止反应，用1琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，染色后，genegenius全自动凝胶成像分析系统分析测试结果全自动凝胶成像分析系统分析测试结果 制备超螺旋质粒制备超螺旋质粒DNA、hTopo在共在共20L hTopo样品反应体系中，加有样品反应体系中，加有4L
6、反应反应缓冲液，缓冲液，0.5g负超螺旋负超螺旋pBR322、1U的的hTopo及及0.5L测试样品。同时做空白对照，阴性对照、阳性测试样品。同时做空白对照，阴性对照、阳性对照以及对照以及DMSO溶剂对照。溶剂对照。37反应30分钟木榄木榄从左到右依次为：从左到右依次为：ZH45、ZH15、ZH50、ZH51、ZH68、ZH164、ZH58、阴性对照、阴性对照、ZH44、阳性对照、阳性对照、DMSO对照、空白对照对照、空白对照卤蕨卤蕨从左到右依次为：从左到右依次为：ZH71、ZH55、ZH30、ZH218、ZH154、ZH11、阴性、阴性对照、阳性对照、对照、阳性对照、DMSO对照、空白对照对
7、照、空白对照桐花树桐花树从左到右依次为：从左到右依次为：ZH63、ZH64、ZH93、ZH2、ZH65、ZH97、ZH81、ZH135、ZH208、ZH209、ZH10、ZH14、阴性对照、阳性对照、阴性对照、阳性对照、DMSO对照、空白对照对照、空白对照海桑海桑从左到右依次为：阴性对照、阳性对照、从左到右依次为：阴性对照、阳性对照、DMSO对照、空白对对照、空白对照、照、ZH116、ZH117、ZH173、ZH61、ZH87、ZH88、ZH91、ZH178、ZH57、ZH4、ZH62、ZH111、ZH222、ZH75阔苞菊阔苞菊从左到右依次为：阴性对照、阳从左到右依次为：阴性对照、阳性对照、
8、性对照、DMSO对照、空白对照、对照、空白对照、ZH79、ZH177无瓣海桑无瓣海桑从左到右依次为：阴性对照、阳性对照、从左到右依次为：阴性对照、阳性对照、DMSO对照、空白对照、对照、空白对照、ZH80、ZH131秋茄秋茄从左到右依次为：阴性对照、从左到右依次为：阴性对照、阳性对照、阳性对照、DMSO对照、空白对照对照、空白对照、ZH9、ZH82、ZH83、ZH151银叶树银叶树从左到右依次为：阴性对照、阳性对照从左到右依次为：阴性对照、阳性对照、DMSO对照、空白对照、对照、空白对照、ZH73、ZH74、ZH228、ZH34、ZH72、ZH182统计结果 筛选出ZH116、ZH178、ZH
9、71、ZH11、ZH154、ZH55、ZH30、ZH15、ZH50、ZH45、ZH44、ZH58、ZH151、ZH93、ZH34、ZH228、ZH74、ZH182和ZH72共19株海洋真菌的代谢物有较强的hTopo抑制作用；另外有ZH61、ZH88、ZH79、ZH218、ZH68、ZH82、ZH83、ZH64、ZH10、ZH135、ZH209、ZH81和ZH164共13株菌的代谢物也对hTopo有一定的抑制活性；剩余22株菌的代谢物要么没有抑制活性，要么抑制作用太弱。收集对数生长期的受试靶细胞，接种于96 孔板，每孔190L（约1104个细胞/孔），24小时 后加入不同梯度浓度药物10L，每一
10、浓度3个重复孔。同时设置调零孔、对照孔。培养68小时后加入MTT 10L（浓度为5mg/mL）。继续培养 4小时后弃上清，每孔加入DMSO 100L后用酶联免疫检测仪测定492nm处吸光度 OD 值，以药物浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制抑制曲线。对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度。体外肿瘤细胞毒性实验（体外肿瘤细胞毒性实验（MTT法）法）细胞毒实验结果表表2 筛选样品对筛选样品对KBv200的的IC50菌株编号IC50（g/mL）菌株编号IC50（g/mL）ZH1127 ZH6812 ZH111205 ZH7111ZH11611ZH7231 ZH11724ZH73456 Z
11、H13115 ZH7422 ZH16425 ZH7511ZH3427 ZH79100ZH5161 ZH8022 ZH5538 ZH8142 ZH5723 ZH8211ZH6118 ZH83133 ZH6224 ZH8732 ZH6334 ZH9119 ZH6411ZH9331 ZH6523 表表3 筛选样品对筛选样品对MDA-MB435的的IC50（g/mL）菌株编号IC50（g/mL）菌株编号IC50（g/mL）ZH251ZH13511ZH436ZH15111ZH938ZH15411ZH1065ZH17315ZH1427ZH17711ZH1511ZH17849ZH3011ZH18266ZH4
12、411ZH208205ZH4598ZH209201ZH5052ZH21848ZH5811ZH22256ZH8811ZH22811ZH9711一共筛选得16株有强烈肿瘤细胞毒作用的海洋真菌。l19株代谢物对株代谢物对hTopo有较强抑制作用的海洋真菌中，有较强抑制作用的海洋真菌中，有有ZH228、ZH116、ZH151、ZH58、ZH30、ZH44、ZH71、ZH15、ZH154共共9株真菌的代谢物能强烈抑制肿株真菌的代谢物能强烈抑制肿瘤细胞的生长。据此可以确定这瘤细胞的生长。据此可以确定这9株真菌的代谢物中含有株真菌的代谢物中含有以以hTopo为靶位点的强效抗肿瘤化合物，其中以为靶位点的强效抗
13、肿瘤化合物，其中以ZH228、ZH116、ZH151、ZH58四株真菌的作用效果最四株真菌的作用效果最好，应该作为优先研究的对象。好，应该作为优先研究的对象。l另外的另外的10株对株对hTopo有较强抑制作用的海洋真菌尽管有较强抑制作用的海洋真菌尽管在肿瘤细胞毒试验也有一定的抑制效果，但不是太强，在肿瘤细胞毒试验也有一定的抑制效果，但不是太强，可能跟其活性化合物的稳定性差有关，进入细胞后被代可能跟其活性化合物的稳定性差有关，进入细胞后被代谢成低活性的化合物，抑制效果也相应下降，研究价值谢成低活性的化合物，抑制效果也相应下降，研究价值不大。不大。结论结论1l16株具有较强细胞毒作用的真菌中，除了
14、株具有较强细胞毒作用的真菌中，除了9株对株对hTopo有强烈抑制作用外，剩下的有强烈抑制作用外，剩下的7株真菌中，株真菌中，ZH64、ZH82、ZH88、ZH135对对hTopo只有一般的只有一般的抑制作用，但却能强烈抑制肿瘤细胞，可能是体外以抑制作用，但却能强烈抑制肿瘤细胞，可能是体外以DNA拓扑异构酶拓扑异构酶为靶位点的抗肿瘤药物筛选模型与为靶位点的抗肿瘤药物筛选模型与细胞内环境有一定差别，此四株菌也有一定的研究前细胞内环境有一定差别，此四株菌也有一定的研究前景。景。l最后剩下最后剩下ZH75、ZH97、ZH177三株菌，没有三株菌，没有hTopo抑制活性，但却能强烈抑制肿瘤细胞生长，估计
15、其靶抑制活性，但却能强烈抑制肿瘤细胞生长，估计其靶位点另有所在，也可对进一步研究，以期发现新的抗位点另有所在，也可对进一步研究，以期发现新的抗肿瘤药物的靶点。肿瘤药物的靶点。结论结论2lhTopo细胞外筛选方法适于高通量筛选，且细胞外筛选方法适于高通量筛选，且筛到的化合物靶位明确，利于进一步深入研究。筛到的化合物靶位明确，利于进一步深入研究。虽然细胞外筛选与细胞内实验存在一些系统差虽然细胞外筛选与细胞内实验存在一些系统差别，但别，但 19个个hTopo抑制剂中有抑制剂中有9个具有较强个具有较强的抑制肿瘤细胞生长的能力，占总数的的抑制肿瘤细胞生长的能力，占总数的47.4，表明应用表明应用hTopo细胞外筛选模型可提高筛选细胞外筛选模型可提高筛选效率。效率。结论结论3衷心感谢中山大学化学与化学工程学院衷心感谢中山大学化学与化学工程学院的创新化学实验与研究基金项目在实验的创新化学实验与研究基金项目在实验条件及经费上所给予的大力支持！条件及经费上所给予的大力支持！
