1、红细胞渗透脆性试验 与羊血白细胞染色药学药学2班班 陈旭宇陈旭宇 李佳朋李佳朋讲解内容实验概述实验概述预实验情况预实验情况正式实验情况正式实验情况创新实验创新实验实验概述 一、实验目的1、观察不同浓度的低渗盐溶液对红细胞的影响，加深理解细胞外液晶体渗透压相对稳定对维持细胞正常形态与功能的重要意义。2、掌握白细胞染色的方法，理解瑞氏染液的作用。二、实验原理红细胞渗透脆性实验开始出现溶血现象的低渗盐溶液浓度为该血液红细胞的最小抵抗力开始出现完全溶血时的低渗盐溶液的浓度则为该红细胞的最大抵抗力器材及药品：小试管、试管架、微量移液管（1000uL与200uL两种规格）显微镜、载物玻璃片、170mmol
2、/L NaCl溶液实验对象：抗凝羊血 （抗凝血剂为柠檬酸钠）预实验情况预实验情况 预实验目的：1、观察不同浓度的低渗盐溶液对红细胞的影响，加深理解细胞外 液晶体渗透压相对稳定对维持细胞正常形态与功能的重要意义 2、熟练白细胞染色的操作，理解瑞氏染液、吉姆萨染色的作用 3、查阅相关文献，加深对实验的理解，掌握更全面信息 4、总结实验的一些注意事项和操作技巧，预知实验可能出现的问题，做好应对措施 5、清楚实验的大致结果，给同学们作为参考染色原理：血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染
3、紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；预习探究一：由于开始的两次实验，我们都习惯先将羊血存于冰箱中保存，然后取出再在室温下实验。考虑到正式实验当天，我们会使用刚取回的羊血（未经冰箱冷却实验）进行试验。考虑到这些温度和时间上的差异，我们有必要进行模拟实验，来探究正式实验环境下的合理范围。试管号试管号试液试液1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010170mmol/LNaCl170mmol/LNaCl（mlml）1.41.41.31.31.21.21.11.11.01.00.90.90.80.80.70.70.60.60.50.5蒸馏水（蒸馏水（mlml）0.60.60.70.70.8
4、0.80.90.91.01.01.11.11.21.21.31.31.41.41.51.5NaClNaCl浓度（浓度（mmolmmol/L/L）1201201121121041049595868678786969606052524343表表1 1：各种低渗盐溶液的制备：各种低渗盐溶液的制备实验温实验温度度/离体时间离体时间/h/h最大抵抗力组最大抵抗力组别别最大抵抗力浓最大抵抗力浓度（度（mmol/lmmol/l）最小抵抗力组最小抵抗力组别别最小抵抗力浓最小抵抗力浓度（度（mmol/lmmol/l）18181 17 769695 5868619193 37 769694 4959522225
5、56 678783 310410420208 85 586863 3104104191912124 495953 3104104171724243 3104104表2：第一次取血红细胞渗透脆性实验结果 表3：第二次取血红细胞渗透脆性实验结果 实验温实验温度度/离体时间离体时间/h/h最大抵抗力最大抵抗力组别组别最大抵抗力浓最大抵抗力浓度（度（mmol/lmmol/l）最小抵抗力最小抵抗力组别组别最小抵抗力最小抵抗力浓度（浓度（mmol/lmmol/l）17171 17 769695 5868620203 36 678784 4959522225 56 678783 310410421218 8
6、5 586863 3104104171712124 495953 3104104151524243 3104104 表4：第三次取血红细胞渗透脆性实验结果 实验温实验温度度/离体时间离体时间/h/h最大抵抗力最大抵抗力组别组别最大抵抗力浓最大抵抗力浓度（度（mmol/lmmol/l）最小抵抗力最小抵抗力组别组别最小抵抗力最小抵抗力浓度（浓度（mmol/lmmol/l）19191 17 786865 5868621213 36 678784 4959525255 56 678784 4959523238 85 586863 3104104212112125 586863 310410420202
7、4243 3104104结论：1、血红细胞离体时间越长渗透脆脆性越大；2、实验室内同一天内的温度变化在 1528范围内，对实验结果影 响不明显。3、羊血不经冰箱储存冷却，在实验室温度环境下，离体35h,预计实验结果为：最小抵抗力浓度：95104mmol/L最大抵抗力浓度：6978mmol/L实验操作总结：（供以后实验同学们参考）a.溶液用前应现配，以免水分蒸发，改变离子浓度。b.溶血的结果判断，应首先在室温下静置一个小时湖再观察结果，先从高浓度观察，上层初现透明红色为开始溶血管，溶液透明深红色、管底红细胞完全消失者为完全溶血。如不易判断可低速离心1分钟后观察。c.器材必须清洁干燥，避免引起其他
8、异物影响所致溶血。d.红细胞脆性实验中，可以先向每个试管中加氯化钠然后再加蒸馏水，加的时候还有个小技巧，以氯化钠为例，先将几个大于1000uL的试管中都加上1000uL的氯化钠，然后再按900,800到100uL递减的顺序依次加这样可以节省时间 e.血必须直接注入试剂中，不可沿着管壁。试验中我们直接用的滴管取血，可能试管中的血量有差距，建议后面用微量移液器定量取血排除观察溶血状况时，血量不同带来的影响 f.血液和盐溶液时不要用力震荡，静置及观察时不要移动试管。g.染色必须得等到血片干燥后进行，否则染不上色 h.血膜的冲洗时水流不能太急，防止将血膜冲掉，应用蒸馏水冲血片的上方，然后滑落下的水流冲
9、洗血膜实验2：细胞染色实验药品准备：缓冲液配制：1%KH2PO4+1%NaHPO4(20ml),加水至1000ml，置室温黑暗处，瓶口密封，防止霉菌污染。姆萨染液配制：药品：吉姆萨染料（粉末）0.5g、甲醇（AR）33ml、甘油（AR）33ml 方法：先将吉姆萨染料放入研钵中，逐渐到甘油研磨溶于甘油中，置于58水温箱内90-120min，然后加入甲醇，摇匀后放置数天，过滤后或不过滤即可使用。（此染液放置室温阴暗处，时间越长越好）(2）实验过程 开始时，一切从零开始，我们的血片制备很不合格，要么过厚，要么不均匀。在耿姝学姐手把手讲解之后，我们不耐其烦，连续联系制作了近30个血片，终于能够制作出厚
10、度适宜，效果成功的血涂片，并掌握了制片的技巧。联系生物实验一中白细胞计数时应用白细胞液破坏红细胞的经验，我们在染色之前对血液使用白细胞稀释液排除干扰，但是染色结果与不加白细胞染色液相比反而较差，影响染色效果。分析原因有可能是白细胞染色液引起了PH的改变，或产生液膜稀释了染液，最后否定了加白细胞稀释液进行染色的方案。经验总结推片经验：用移液枪头沾取羊血点置于载玻片上，呈米粒大小，将推玻片保持与载玻片约30度角，置于血滴正前方，稍往后移与血滴接触，即可见血液沿推片下缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳向后滑动，至血膜铺匀。图1 瑞氏染色法 图2 吉姆萨氏染色法 通过预实验总结出的各染色法染色效果：瑞氏染
11、色法：白细胞核、细胞浆层次分明，嗜中性白细胞浆中可见淡红色染色颗粒。吉姆萨氏染色法：白细胞核呈蓝色，层次清楚。瑞吉复合染色法：白细胞层次清晰，细胞浆中染色颗粒可见。正式实验 实验准备：我们在周三下午将PPT交与李老师征求修改意见，并在当天晚上修改完毕。于周四晚上，准备好实验所需各项仪器与药品，并写好板书。周五早上上课前取回羊血。实验过程：实验过程无迟到、旷课、早退现象，同学们热情度很高，认真实验。对同学的操作过程进行严格把关，使绝大多数同学的实验取得了预期的结果，其中章梦甜、陶倩组白细胞染色观察效果非常好，能观察到多个白细胞清晰镜像。白细胞染色出现问题主要为以下几点：1、血膜涂得过厚，造成观察
12、困难；2、对染液进行冲洗时不彻底，造成着色过深，出现一大片蓝的现象；3、冲洗过猛，观察不到白细胞。在老师和我们的帮助下，同学们很好解决了这些问题。掌握好染色时间、染液量和染液冲洗是关键不好，上图为典型的染液冲洗不好的结果实验报告批改情况 存在的问题与不足：漏写：有些同学实验仪器及药品未写全;或厂家未标注;实验室温度湿度等环境记录;实验原理未写或写的不全面。讨论：实验结果分析不到位；实验操作中的讨论过于宽泛；文献内容过多引用，缺乏自己的语言；一些讨论不够严谨，理论支持太少。创新：创新方面未结合实验室实际情况，有些不实用。有不少同学在报告中反映瑞士染色效果好于吉姆萨染色，这可能是由于正式实验中所使
13、用吉姆萨染液比较新的原因。在吉姆萨染液放置一个月后，染色效果有很大提高，在我组后期染色操作中发现，吉姆萨染色效果要优于瑞氏染液，因此总结到经验：吉姆萨染液最好提前一个月配置，暗处放置。创新实验1、进一步探究温度、离体时间对红细胞形态及渗透脆性 的影响；2、利用紫外分光光度计测不同地深盐溶液中的溶血度；3、探究白细胞染色片中的蓝紫色小颗粒聚集物来源4、改良白细胞染色方法一、探讨离体时间、温度对红细胞形态及渗透脆性的影响 红细胞渗透脆性受细胞膜结构、细胞膜流动性、以及红细胞几何特性及红细胞膜抗张强度等多个因素的影响，其中与红细胞表面面积和体积的比值有很大关系。通过批阅报告，我们发现大多数同学没有对
14、不同浓度低渗盐溶液中的血红细胞进行镜检,而且往届助教也没有进行形态变化的观察。1.2 方法:对三次取的羊血材料分别进行了相同的实验操作。取适量新鲜羊血（A液）分别置于4个洁净烧杯，标号A1.A2.A3.A4。实验过程中，各组羊血、低渗盐溶液、A滴入B、均匀、静置、观察各步骤均在各自的恒温环境中进行。表6 各种低渗盐溶液(B液）的制备试管号试液12345678910170mmol/LNaCl（mL）1.41.31.21.11.00.90.80.70.60.5蒸馏水（mL）0.60.70.80.91.01.11.21.31.41.5NaCl浓度 （mmol/L）120112104958678696
15、052431下羊血红细胞均出现表面凹凸不平，呈不规则球形。有萎缩趋势。红细胞变化明显，细胞膜结构变形严重，易发生溶血。联系生物化学知识，降低温度会抑制细胞各类酶的活性，如呼吸酶、转氨酶等。导致细胞生物活性降低。细胞膜通透性能改变，红细胞脆性增大。室温下羊血红细胞的变化比较明显，部分细胞形状变化严重，大多变瘪，甚至有镰刀状红细胞出现。可以推断在正中情况下检测出的红细胞脆性肯定与在体的规则球形红细胞的渗透脆性不同。38下保存的羊血红细胞变化情况不如25的明显，但是依然可以看出红细胞已经发生变形，表面凹凸不平，呈现不规则块状、椭圆状、三角状。51下保存的羊血红细胞发生严重的变形。大多数红细胞变瘪，呈
16、镰刀状或飞碟状。我们推测高温使血液蒸发失水，血液中离子等溶质浓度升高，渗透压增大，导致红细胞失水变瘪。在加入少量 51蒸馏水稀释后，部分细胞干瘪情况减轻，形状又恢复，但仍有许多飞碟状、镰刀状细胞。可见这种变化是多方面的，高温对红细胞的活性产生了不可逆的影响。表7.离体3h不同温度下的羊血红细胞脆性标号标号实验温度实验温度/最大抵抗力最大抵抗力组别组别最大抵抗力浓最大抵抗力浓度（度（mmolmmol/L/L）最小抵抗力最小抵抗力组别组别最小抵抗力浓度最小抵抗力浓度（mmolmmol/L/L）A1A11 16 678785 58686A2A225256 678784 49595A3A338386
17、678785 58686A4A451516 678785 58686 表8.离体5h不同温度下的羊血红细胞脆性标号标号实验温度实验温度/最大抵抗力最大抵抗力组别组别最大抵抗力浓最大抵抗力浓度（度（mmolmmol/L/L）最小抵抗力最小抵抗力组别组别最小抵抗力浓最小抵抗力浓度（度（mmolmmol/L/L）A1A11 16 678784 49595A2A225256 678784 49595A3A338386 678785 58686A4A451516 678785 58686 表9.离体12h不同温度下的羊血红细胞脆性标号标号实验温度实验温度/最大抵抗力最大抵抗力组别组别最大抵抗力浓最大抵抗
18、力浓度（度（mmolmmol/L/L）最小抵抗力最小抵抗力组别组别最小抵抗力浓最小抵抗力浓度（度（mmolmmol/L/L）A1A11 16 678784 49595A2A225256 678784 49595A3A338386 678785 58686A4A451516 678785 58686 表10.25 下探究更准确的最大最小抵抗力试管号试管号试液试液1 12 23 3 4 45 56 67 78 8170mmol/LNaC170mmol/LNaCl l（mlml）1.281.281.261.261.241.241.221.221.081.081.061.061.041.041.021
19、.02蒸馏水（蒸馏水（mlml）0.720.720.740.740.760.760.780.780.920.920.940.940.960.960.980.98NaClNaCl浓度（浓度（mmolmmol/L/L）1091091071071051051041049292909088888787实验结果 1、2、3、4、5、6管皆为上层透明红色，下层浑浊红7、8管为透明红色1.4得出结论：温度对红细胞的形态有影响，其中高温（51）对红细胞形态影响最大；相同温度下，红细胞的脆性随时间的增长而变大；相同时间下，1和51下红细胞脆性变大速度较室温和体温快，温度偏离体温程度越大，越容易使红细胞脆性增大；
20、保存环境的温度对红细胞的形态有很大影响。实验2、红细胞在不同浓度低渗氯化钠溶液中溶血率的测定 2.1概述：传统的测定方法采用目测观察其溶血情况,需要静置一小时后观察,观察过程中不能晃动。此法仅能观察到溶血的大致情况,不能量化红细胞破裂的程度。本试验采用分光光度法精确测定红细胞在低渗氯化钠溶液中的溶血情况。进一步了解血红蛋白的脆性。2.3实验步骤 2.3.1配制不同浓度低渗氯化钠溶液 取口径相同、清洁干净的小试管做好编号,制成不同浓度的低渗盐溶液,每管总量为3.0mL，第11管为蒸馏水,具体配制情况见如下表所示：试管号试管号试液试液1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101
21、1111212170mmol/LNaC170mmol/LNaCl l（mlml）2.12.11.951.951.81.81.651.651.51.51.351.351.21.21.051.050.90.90.750.752.72.70 0蒸馏水（蒸馏水（mlml）0.90.91.051.051.21.21.351.351.51.51.651.651.81.81.951.952.12.12.272.270.30.33.03.0NaClNaCl浓度浓度（mmolmmol/L/L）12012011211210410495958686787869696060525243431941940 02.3.2
22、 最大吸收波长测定取12管加入0.1 mL血液,轻轻颠倒混匀5 min,3 000 r/min离心10 min,取上清液至比色皿中,以11管(生理盐水）为空白对照,754N紫外可见分光光度计上扫描,测得其最大吸收波长为590nm.2.3.3 红细胞在不同浓度低渗氯化钠溶液中溶血率的测定依次向12支试管内各加0.1ml血液,轻轻颠倒混匀5min置入干燥离心管中以3000r/min 离心10min,取上清在分光光度计590nm波长处检测。用11管生理盐水的上清调零,测其他每管吸光度。以12管测出的吸光度作最大溶血的吸光度,分别计算出1-10支管的溶血率。溶血率=（样品吸光度/最大溶血吸光度）100
23、%。表12 不同浓度低渗氯化钠溶液对红细胞渗透脆性的影响 试管试管标号标号NaClNaCl溶液浓度（溶液浓度（mmolmmol/L/L）ODOD值值溶血率（溶血率（%）目测法目测法1 11201200.0790.0799.59.5-2 21121120.0820.0829.89.8-3 31041040.2070.20724.824.8-4 495950.3120.31237.337.3+5 586860.6240.62474.674.6+6 678780.660.6678.978.9+7 769690.7380.73888.388.3+8 860600.7540.75490.290.2+9
24、952520.7670.76791.791.7+101043430.7950.79595.195.1+11111941940 00 012120 00.8360.836100100+(注：注：-表示不溶血表示不溶血,+表示部分溶血表示部分溶血,+,+表示完全溶血表示完全溶血)探究究竟对人体血液的影响，不应该想当然的在血液中直接加入酒精，而应该分析究竟在人体的代谢产物，进入血液的代谢产物是什么。酒精进入体内后在乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的作用下逐步氧化成乙酸,其中间代谢产物乙醛对机体的毒性作用最大。2.4.22.4.2酒精、葡萄糖对红细胞渗透脆性的影响酒精、葡萄糖对红细胞渗透脆
25、性的影响 酒精代谢过程：乙醇乙醛乙酸 乙醇乙醛 2CH3CH2OH+O2 2 CH3CHO+2H2O 乙醛乙酸 2CH3CHO+O2 2CH3COOH 探究1：取血方法同上,依次向14支试管内各加0.1mL血液后,用加样器再分别加入0.790g/mL无水乙醛5uL。来模拟人在大量饮酒后代谢在血液中乙醛浓度对血红细胞脆性影响。探究2：取血方法同上,依次向14支试管内各加0.1mL血液后,用加样器再分别加入0.05g/mL葡萄糖溶液10UL。来模拟人在大量摄入糖活着患有糖尿病后血液中高糖浓度对血红细胞脆性影响。拓展探究表表13 13 乙醛对红细胞渗透脆性的影响乙醛对红细胞渗透脆性的影响 试管标试管
26、标号号NaClNaCl溶液浓度（溶液浓度（mmolmmol/L/L）ODOD值值溶血率（溶血率（%）1 11201200.0630.0637.27.22 21121120.0780.0788.88.83 31041040.1250.12514.414.44 495950.2510.25128.928.95 586860.5890.58967.867.86 678780.6740.67477.677.67 769690.7690.76986.386.38 860600.7820.78288.688.69 952520.7910.79190.290.2101043430.8070.80792.99
27、2.92.4.22.4.2酒精、葡萄糖对红细胞渗透脆性的影响酒精、葡萄糖对红细胞渗透脆性的影响 表表13 13 乙醛对红细胞渗透脆性的影响乙醛对红细胞渗透脆性的影响 试管标试管标号号NaClNaCl溶液浓度（溶液浓度（mmolmmol/L/L）ODOD值值溶血率（溶血率（%）1 11201200.0630.0637.27.22 21121120.0780.0788.88.83 31041040.1250.12514.414.44 495950.2510.25128.928.95 586860.5890.58967.867.86 678780.6740.67477.677.67 769690.7
28、690.76986.386.38 860600.7820.78288.688.69 952520.7910.79190.290.2101043430.8070.80792.992.9表14 葡萄糖对红细胞渗透脆性的影响 试管试管标号标号NaClNaCl溶液浓度（溶液浓度（mmolmmol/L/L）ODOD值值溶血率（溶血率（%）1 11201200.0750.0758.48.42 21121120.0780.0788.68.63 31041040.0810.0819.19.14 495950.1960.19621.921.95 586860.3310.33161.861.86 678780.6
29、410.64171.871.87 769690.6890.68979.179.18 860600.7760.77681.981.99 952520.790.7983.583.52.4.3 结果分析在加入乙醛之后羊血红细胞对低渗盐溶液抵抗力略增高，红细胞脆性减小。78mmol-118mmol的NaCl溶液内红细胞的溶血率比不加乙醛前降低5-12个百分点,溶血程度降低明显,说明红细胞破裂明显减少。我们查阅相关资料，发现红细胞脆性下降的原因可能是乙醇分解后产生的乙醛浓度不断增加对红细胞膜的固化修饰所致4。此外，随着血液中乙醛逐渐被分解,其对红细胞的修饰作用解除,红细胞膜结构和功能恢复正常;而且乙醇代
30、谢的产物-乙酸浓度比例不断上升可能会使红细膜性增高,这两种作用的协调将使得红细胞脆性逐步恢复正常。参考文献：4 郭希超,陈晓刚,陈瑜，等.急性酒精中毒后红细胞膜脆性检查.临床检验杂志.2001,19(3):186-188.由于实验室条件限制，我们有设计了一组加葡萄糖的实验，但做过之后思考发现，5%的葡萄糖溶液也常作为血浆等渗液使用。通常注射制剂的血浆等渗液的调配很重要，应用NaCl当量法,葡萄糖的NaCl当量为0.185。加入葡萄糖，从某一角度讲相当于提高了NaCl低渗夜的浓度，无疑会产生红细胞脆性减小的结果。不过可以大幅度提高葡萄糖浓度，来探究高糖环境对红细胞脆性的影响。有资料显示6，高浓度
31、葡萄糖会诱导的红细胞磷脂酰丝氨酸暴露、渗透脆性增高和膜脂质过氧化损伤。参考文献：5 崔福德.药剂学（第五版）.北京：人民卫生出版社.2007，9：455-4576 权国波,韩颖,杨超,等.海藻糖抑制高浓度葡萄糖诱导的红细胞磷脂酰丝氨酸暴露、渗透脆性增高和膜脂质过氧化损伤的研究.中国实验血液学杂志 2008;16(6):1442-1446在加样中,我们改用微量加样器加样,加样准确消除了浓度误差对实验结果的影响。通过其溶血度变化从而证明用分光分度法可以用于临床初步筛选对红细胞膜稳定的药品以及对红细胞膜破坏的药品,对静脉注射制剂新药的安全性是一种安全有效准确的评价方法。此外，我们还可以依据本实验，再
32、加入维生素C（膳食、辅助性药物）、乳酸（无氧运动）、血氨（人体正常数值不超过60umol/L）、甘油（注射用溶剂的一种）等物质来探究因为饮食、输液、运动、疾病等原因导致的血液环境改变对红细胞脆性的影响。进一步拓展三、染色中观察到的小颗粒蓝色聚集物是什么？猜想：1、制片问题？2、染液残渣？3、红细胞干扰？4、白细胞破裂释放物质？5、细菌？6、血液中其他物质?1、制片问题？探究过程：我们最开始觉得这种现象的发生可能是因为操作不规范，血片制的太厚，重新制薄片后观察，又出现些许小颗粒聚集现象，猜测可能是染料残留物或者是破碎的红细胞。于是我们又重新做了一遍，将制片洗完全，观察，仍然在视野中发现少量聚集物
33、，于是排除染料残留的可能性。白细胞破裂？对于白细胞破裂的猜测，我们的想法是从血液中分离处理白细胞直接进行染色，于是查阅文献，找寻血液中分离白细胞的方法:1、简单离心分离法：直接取样血液于离心管中3000r/min离心分离10min，取上清液，做成血片，染色观察；2、Ficoll-泛影钠（Ficoll-Hypaque）密度梯度及红细胞裂解法，首先配制白细胞缓冲液，汉克斯液配置好。然后提取好白细胞后，使用对照的方法，对其中一组加不同浓度的低渗盐溶液，或者加不等量的蒸馏水，将白细胞胀破。然后制片染色，显微镜下观察，与对照组做对比，观察是否有相同的聚集现象。后来，由于实验室缺乏所需药品，而且该法对无菌
34、条件的要求严格，我们在进行一半时不得不中途放弃，感到非常遗憾。但这将作为我们今后研究的课题，进一步激发我们对血液细胞研究的兴趣!四、染色方法的改进 1、瑞氏染色法的改进 常规组：瑞氏染色液3-5滴於血膜染色12min 后加蒸馏水6-8滴，2-3min 镜检分类。改进组:血膜片在0.85%的生理盐水溶液中浸泡1-1.5秒然后加入瑞氏染色液3-5滴染色10-15秒后用蒸馏水冲洗，镜检分类。镜检观察 改进组染色片在镜下偶见红细胞淡影，白细胞染色良好。讨论：优点：本方法可以缩短染色时间。白细胞清晰地铺在玻璃片上，偶见红细胞淡影。改进组主要是生理盐水倾溢血膜片上，在血膜外形成一层液态膜，阻止染色液与红细
35、胞直接接触，延缓了红细胞与染色液的结合。2、姬姆萨染色法改进1、染液配制取分析纯姬姆萨氏粉0.5 g,甘油2.5 ml,甲醇2.5 ml。将姬姆萨氏粉置于乳钵,研溶于少量甘油中,再加入全部甘油,倾于烧瓶内,置60水浴2 h,并不断振摇搅拌,促其完全溶解,再加入甲醇混合过滤,存放23 周后使用。临用时取原液以中性蒸馏水或离子水作10 倍稀释。2、抹片制作 血液制成推片,组织制成触片或抹片,渗出液、分泌物和培养物视其黏稠度直接或加生理盐水稀调制作涂片,干燥,火焰固定。3、加温染色 滴加姬姆萨氏染色液覆盖整个抹片,在酒精灯外焰上方约10cm处徐徐摆动玻片,温染色0.5 min,再自然染色3min,蒸
36、馏水冲洗至不褪色时,吸水纸吸干玻片。4、镜检观察 讨论：1、染色速度快,从染色到镜检仅需6 min;2、染色效果好,抹片染色清晰度高;3、节省染料,固定时不用甲醇,避免了在染色缸内浸泡抹片浪费染色液的问题镜下背景为淡红色,出现大量染成蓝紫色的红细胞！有异常现象！酒精灯固定后的血片3、血涂片的双重染色法的改良 原理：红细胞呈淡红色，中性粒细胞的胞质呈粉红色，含有大小不等的紫红色颗粒。嗜酸性粒细胞，胞质内充满粗大均匀的嗜酸性颗粒，染成桔红色，嗜碱性粒细胞，胞质内含有嗜碱性颗粒，分布不均匀，大小不等，染成蓝紫色，单核细胞，胞质内有嗜天青颗粒，胞质呈灰蓝色，淋巴细胞胞质呈天蓝色 方法：1、新鲜血涂片自
37、然晾干 2、瑞氏染液染色5min蒸馏水冲洗数遍 3、0.05乙酸分色3s，蒸馏水冲洗两遍 4、稀释了的姬姆萨染液染色10min，蒸馏水冲洗数遍，吹干 5、无水酒精脱水15s左右镜检观察 讨论：1、两种染液分别进行染色，避免了成电的产生，用0.05乙酸分色。2、血涂片直接用瑞氏染液固定节省时间，配制染液蒸馏水的pH值为6.77.0，但染液染色的顺序不能颠倒数目极多的红细胞，再次出现异常!讨论：三个白细胞染色法改良的实验中，只有第一个瑞氏的改良法是成功的，而从姬姆萨染色法的改进和双重染色法的改良我们可以看出，实验中被染色的并不是白细胞，而是红细胞。与所查文献中所给结果并不一致，我们多做了几遍，观察
38、的现象依然如此，依然是很多的红细胞，考虑到我们的药品，实验步骤都严格正确的配制和实行。所以猜测原因：1、实验所用血源的不同；2、实验室大环境的不同；3、文献有误。这次试验给我们提了个醒，那就是在我们实验报告的文献查阅中，不能简单的、一股脑的将其全盘照收，要批判性的引用，首先要考虑文献本身的正确性，有些实验结论要亲自实验后才能认同，要知道实践才是检验真理的唯一标准。本次实验基本完成了老师们提出的要求，虽然有诸多不足之处，但在正式实验当中并未出现太大的纰漏，同学们都很顺利、很好的完成了实验。对此，我们要感谢李老师在整个实验过程中给予了我们诸多建设性意见。同时，我们也要感谢实验室中的学姐、学长们教给
39、了我们一些仪器的使用方法。这次实验虽然花了很长很长的时间与很多很多的精力，但同样，让我们收获了很多很多。我们不仅对这个实验有了很深的了解，而且从这个实验中知道了一个科研项目的整个流程、知道了如何去进行一个科研项目，如何从发现问题走到解决问题。我们的这次经历为我们以后的科研道路起到了基石作用。我们会继续努力，不负老师的教导，同学们的支持！尾声参考文献：1 刘墨祥,于红艳,黄樱,等.桔梗总皂苷与其总次皂苷溶血效应的比较研究 J.扬州大学学报,2006,27(4):26-28.2 Nikaido T,KoikeK,Mitsunaga Ketal.Two new triterpenoid saponi
40、n s from platycodon grand if lorum J.Chem Ph arm Bu l,l 1999,47(6):903-904.3 张义兵,田会,李建民,等.离心力与离心次数对MAP洗涤红细胞脆性及损伤的影响 J.河北医药,2005,27(4):386-388.4 郭希超,陈晓刚,陈瑜，等.急性酒精中毒后红细胞膜脆性检查.临床检验杂志.2001,19(3):186-188.5 崔福德.药剂学（第五版）.北京：人民卫生出版社.2007，9：455-4576 权国波,韩颖,杨超,等.海藻糖抑制高浓度葡萄糖诱导的红细胞磷脂酰丝氨酸暴露、渗透脆性增高和膜脂质过氧化损伤的研究.中国实验血液学杂志 2008;16(6):1442-1446Thank you！
