1、组织切片技术应用分解组织石蜡包埋和切片技术组织石蜡包埋和切片技术 一般步骤：1 取材、固定 保存原有的形态结构 2 洗涤 洗脱固定剂 3 脱水 酒精脱水为透明做准备 4 透明 为透蜡包埋做准备 5 透蜡 为石蜡包埋做准备 6 包埋 为切片做准备 7 切片 一般6-10m 8 贴片 9 染色 10 封片冰冻切片技术 冰冻切片的种类较多,有低温恒冷箱冰冻切片法,二氧化碳冰冻切片法,甲醇循环制冷冰冻切片法等。一般步骤：1 取材 2 冷冻切片 3 贴片 4 酒精固定 5 染色 6 封片其它制片技术整封法 小型材料如鸡胚、蛙胚，经固定、染色、脱水、透明、封片，保存。涂片法 血液、精液、粪便等，经固定、染
2、色、脱水、透明、封片，保存。磨片法 牙齿、骨骼、介壳，磨片、封片。浸渍分离法 利用药品使细胞间质溶解，细胞分离，取单细胞，染色、脱水、透明、封片，保存。撕碎法 材料固定或浸渍到一定程度后，在解剖镜下撕开，取单个细胞或纤维染色、封片。压碎法 柔软的材料，玻片间压碎，染色、封片。组织石蜡包埋和切片技术步骤（一）材料的采集与分割（一）材料的采集与分割 采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进
3、行分割。分割时动作要迅速。分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。（二）杀死与固定（二）杀死与固定 杀死动物的方法很多，但不论哪种，都要杀死动物的方法很多，但不论哪种，都要尽力避免动物产时间的陷于痛苦和濒于死尽力避免动物产时间的陷于痛苦和濒于死亡状态，以免使动物的组织细胞成分结构亡状态，以免使动物的组织细胞成分结构发生变化，或引起病理假象。发生变化，或引起病理假象。动物杀死后应立即取材固定，以免招致会动物杀死后应立即取材固定，以免招致会因失水变形或死后组织变化，组织自溶自因失水变形或死后组织变化，组织自溶自组织死亡后就会开始。组织死亡后就会开始。固定，就是将新鲜的材料
4、从个体上取下后立即投入固定剂中，借助化学药品的作用使细胞、组织的形态结构保存起来，不使其改变形态或变性。固定的意义：防止组织溶解和腐败使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等成分沉积保存下来，保持原有的结构与生活时相仿。因沉淀及凝固的关系，使细胞内成分产生不同的折射率，使的细胞结构变得清晰起来，而且容易染色。1.固定剂兼有硬化作用，增加组织硬度，便于后处理。固定剂的选择可用于固定剂的药品应符合下列条件：具有很好的穿透性。具有快速的渗透力。不会改变组织形态结构。使细胞内的成分凝固或沉淀。增加细胞的媒染作用和染色力。使组织适度硬化，易于切片。1.有保存作用常用固定剂的性质及使用 固定剂有单纯固定剂和混合固定
5、剂之分。单纯固定剂 甲醛（福尔马林）溶液：市售的为40%甲醛含量。使用时稀释为10%即可。特点：渗透力强，但在随后酒精脱水过程中收缩很大；不能使蛋白及核蛋白沉淀，对神经、髓鞘固定很好，可固定线粒体、高尔基体。可保存组织。乙醇 95%，或100%。特点：可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白。酒精固定的标本对核的染色不良，原因是酒精固定的核蛋白易于溶于水。穿透速度快，硬化显著，放置过久会发脆，组织收缩厉害。70%酒精可长期保存材料。乙酸 5%特点：不能沉淀白蛋白，球蛋白，但能沉淀核蛋白，所以染色质固定很好。穿透性很好，一般组织只需固定1小时。组织不会硬化。缺点：组织易膨胀。苦味酸（picric acid）
6、强酸 特点：易溶于酒精、二甲苯、水，可沉淀一切蛋白，成为不溶于水的蛋白结合体，但对脂类无作用。穿透速度较慢，使组织收缩显著，一般不单独使用。4多聚甲醛溶液多聚甲醛溶液 进行免疫组织化学方法研究时常选用该固定液。动物灌注固定及后固定（动物器官经该液灌注后，然后取材，再用该液浸泡2-24小时）也常选该固定液固定。可用于培养细胞的固定。胚胎材料的固定。单独用多聚甲醛固定的细胞不能使抗体进入细胞内，因此,标本固定后必须用非离子去污剂(triton-x 100)透化标本。4多聚甲醛溶液（多聚甲醛溶液（PFA）配制）配制 称取40gPFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力
7、搅拌至60-65,使成乳白色悬液。用1.0mmol/L 的NaOH调PH至使呈清亮状（滴加），再加入约500 ml 2 PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中）。可再检测一下PH，过滤后定容至1000ml，室温或4（保存备用）。混合固定剂 Zenker氏液 升汞（氯化汞，极毒），重铬酸钾，硫酸钠 1g，蒸馏水100ml 以上为储存液，储于棕色瓶中，用时取95ml储存液，临时加入冰醋酸5ml。常用固定剂，固定时间12-36小时，流水冲洗12小时，70%酒精保存（0.5%碘），脱汞。Bouin氏液 苦味酸饱和水溶液（0.9-1.2%）75ml，甲醛（37-40%）25ml，冰醋酸5ml 常用良好的固定
8、剂，适用于一般组织。渗透迅速，固定均匀，组织收缩少，可把一般的细微结构显示出来，对苏木精及酸性复红易于着色。固定12-24小时，固定后70%酒精洗涤，保存。特别适用于睾丸活检组织的固定。Carnoy氏液：100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4保存备用。常用于细胞学，尤其适于固定染色体，中心粒，固定有丝分裂期细胞。固定时间20-40分钟，大型材料一般不超过3-4小时，小鼠睾丸固定30-50分钟。不能固定太久，否则组织膨胀，硬化。固定液（改良液）：95%-100%酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml。固定液 福尔马林(38%甲醛)5 ml:冰醋酸5ml:70%酒精90
9、ml 又称标准固定液,万能固定液。适用于一般根,茎,叶,花药,子房组织切片.在植物形态解剖研究上应用极广，此固定液最大优点是兼有保存剂作用,但对染色体的观察效果较差。（三）洗涤与脱水 洗涤，把固定剂从组织中洗脱。酒精无需冲洗；水溶性固定剂，用流水冲洗；含铬酸或重铬酸钾的固定剂，必须流水冲洗，冲洗时间与固定时间相同；含苦味酸的固定剂，流水冲洗12小时；含氯化汞的固定剂，70%酒精加碘脱汞；去汞后用5%硫代硫酸钠去碘。脱水 是为了组织透蜡，但透蜡之前，要经过二甲苯先行透入。可用的脱水剂：乙醇 梯度酒精脱水是常用的方法。丙酮 脱水能力比酒精强，但对组织收缩较大。正丁醇 脱水力弱，但对组织收缩少，可与
10、酒精混合脱水，能溶解石蜡，可不经透明直接包埋。（四）透明 便于透蜡、包埋。常用透明剂：二甲苯 甲苯，可替代二甲苯，但透明较慢。内置12-24小时组织也不变脆，故由于二甲苯。苯 氯仿 香柏油 缺点是透明慢，不宜被石蜡替代。松酯醇 适用于一些易碎的组织。可于二甲苯1：4混合透蜡。（五）透蜡及包埋 包埋蜡的熔点：软蜡42-45，45-50，硬蜡52-54，56-60 要使石蜡硬度与组织硬度相近，组织较硬时用硬蜡，反之用软蜡；切片较薄时用软蜡（8m及以下）；室内温度很重要：10-19 选用52-54 蜡，室温高时用56-58 蜡。包埋用相应的石蜡。使用蜡杯或自制的蜡纸盒包埋。先将一部分液化的石蜡加入杯
11、/盒中，取透蜡好的组织按方位放置与杯/盒，再加入一些液化石蜡，用加热过的镊子在组织周围游动两圈，消除组织周围形成的蜡膜，再加一些液化石蜡，轻吹液化石蜡表面，待出现蜡膜后倒置杯/盒于水中降温硬化。（六）切片及贴片 使用切片机连续切片。厚度6-10m。注意切片机的使用。刀的选择。毛笔的旋转方向。贴片 把切片贴于干净的载玻片上。可购买多聚赖氨酸载玻片，也可以自制蛋白液，用时涂于洁净的载玻片上。滴加一些蒸馏水，将切片放置于蒸馏水上。加温，展片，去水，晾干，保存。（七）染色及封片 染色剂：普通组织染色剂 苏木精，伊红，（HE染色法）；碱性染料 结晶紫、亚甲蓝、天青 酸性染料 伊红。结缔组织染色剂 Mal
12、lory三色染色法：苯胺蓝、橘黄G、酸性复红。神经组织染色剂：银染 银盐沉淀。染料的性质 发色团 助色团 染料的分类 根据化学反应分为三类：碱性、中性、酸性 根据染色对象分类：核、胞质、脂肪染料。石蜡包埋及切片、染色、封片流程 1 取材、固定 （Bouin氏液）0.5X0.5X0.2 12-24h 2 洗涤 12h 3 脱水 70%酒精 45-60min 80%酒精 45-60min 95%酒精 45-60min 100%酒精 30-45min 1：1酒精：二甲苯 20-30min 4 透明 二甲苯 15-20min 5 透蜡 二甲苯：石蜡1：1 20-30min 蜡1，2，3 各20-30min 6 包埋 7 切片 一般6-10m 8 贴片 37过夜干燥 9 染色 二甲苯脱蜡1，2 各3-5min 二甲苯：酒精 1：1 3-5min 100%酒精 1-2min 95%酒精 1-2min 80%酒精 1-2min 50%酒精（可省略）1-2min 碘酒精脱汞（只用于升汞固定材料）3-5min 蒸馏水 1-3min
