1、第四讲第四讲 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术 （一）动物细胞培养 从机体取出立即培养的细胞叫原代细胞（10代）。将原代细胞分离、稀释接种到新的培养中继续培养的细胞为传代细胞。从原代培养细胞中分离出来的可继续传代繁殖到4050的细胞群体叫细胞株，细胞具有接触抑制的行为，有些具有贴壁生长的行为，具有正常的遗传物质。从原代细胞或细胞株中获得的可无限传代的细胞叫细胞系。细胞无接触抑制行为，且具有遗传突变，带有癌细胞的特征。一、细胞培养一、细胞培养 细胞培养就是将动植物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞 或直接以单细胞 生物，给予必要的生长条件，让其在培养瓶中或培养基
2、上继续生长与增殖。（二）动物细胞融合技术即动物细胞融合技术即单克隆抗体技术 1975年英国学者Milestein等开创了将产生抗体的单个细胞同瘤细胞杂交的技术。他们的设计是经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞(B淋巴细胞)与骨髓瘤细胞融合，融合的杂交瘤具有两种亲本细胞的特性即可分泌抗绵羊红细胞的抗体，又可无限增殖。学者们纷纷利用这 一技术来制备针对不同抗原的高度纯一的单克隆抗体。单克隆抗体就是单个杂交瘤细胞增殖产生的克隆细胞群分泌的高度纯一的抗体。动物细胞融合技术即单克隆抗体技术动物细胞融合技术即单克隆抗体技术骨髓瘤细胞？骨髓瘤细胞？体外培养体外培养从培养液中获取从培养液中获取抗原？抗原？淋巴细胞？
3、淋巴细胞？体内培养体内培养从腹水中提取从腹水中提取单克隆抗体单克隆抗体细胞融合细胞融合、筛选、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养（三）植物细胞培养（三）植物细胞培养 1、单倍体细胞培养：花药离体培养。（秋水、单倍体细胞培养：花药离体培养。（秋水仙素）仙素）2、原生质体培养：去壁的植物细胞叫原生质、原生质体培养：去壁的植物细胞叫原生质体。可培养成植株或体细胞杂交植株。体。可培养成植株或体细胞杂交植株。植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交过程过程离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽植物体植物体外植体外植体脱分化脱分化植物激素：植物激
4、素：细胞分裂素、生长素细胞分裂素、生长素再分化再分化植物组织培养植物组织培养条件植物组织培养条件：含有全部营养成分的含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的气、无菌环境、适合的PHPH、适时光照等。适时光照等。植物植物A A细胞细胞植物植物B B细胞细胞去壁去壁原生质体原生质体A A原生质体原生质体B B原生质体融合原生质体融合融合体融合体再生壁再生壁杂种细胞杂种细胞细胞分裂细胞分裂愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株去壁的常用方法：去壁的常用方法：酶解法（纤维素酶、果胶酶等）酶解法（纤维素酶、果胶酶等）原生质体融合方法原生质体融合方法：物理法：离心、振动
5、、电刺激等物理法：离心、振动、电刺激等 化学法：聚乙二醇（化学法：聚乙二醇（PEGPEG）植物体细胞杂交植物体细胞杂交 三、非细胞体系在细胞生物学研究中的作用三、非细胞体系在细胞生物学研究中的作用 来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了正来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了正常生物学反应所需的物质（供能系统和酶反应体系等）常生物学反应所需的物质（供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系。组成的体系即为非细胞体系。四、细胞工程四、细胞工程 应用细胞生物学方法，按照预先的设计，有计划地改应用细胞生物学方法，按照预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传物质的技术以及发展这种技术变
6、或创造细胞遗传物质的技术以及发展这种技术 的领的领域为细胞工程。域为细胞工程。细胞工程所使用的技术主要是细胞培养、细胞分化的细胞工程所使用的技术主要是细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等。定向诱导、细胞融合和显微注射等。（一）细胞融合与细胞杂交技术 真核生物的体细胞经过培养，两个或多个细胞融 合成一个双核或多核细胞的过程叫细胞融合。动物细胞融合一般要用灭活的病毒(如仙台病毒)或 化学物质(如聚乙二醇，即PEG）介导；植物细胞事例时，要用纤维素酶去掉纤维素壁。20世纪80年代又发明了电融合技术。细胞融合可以在基因型相同的细胞间进行，也可以在基因型不同的种内细胞间甚至种间细胞间进行。
7、（二）细胞折合与显微操作技术（二）细胞折合与显微操作技术 细胞拆合就是用物理方法（机械法和短波光）、化细胞拆合就是用物理方法（机械法和短波光）、化学法（用细胞松弛素）把细胞核与质分离开后将不同来学法（用细胞松弛素）把细胞核与质分离开后将不同来源的细胞质与细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。源的细胞质与细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。显微操作技术：即在显微镜下用显微操作装置对细胞显微操作技术：即在显微镜下用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射的技术。进行解剖和微量注射的技术。第四讲 细胞膜与细胞表面第一节 细胞膜与细胞表面特化结构 细胞膜又称质膜，是围绕在细胞最外层，由膜细胞膜又称质膜，是围绕在
8、细胞最外层，由膜脂和膜蛋白构成。脂和膜蛋白构成。一、细胞膜的结构模型一、细胞膜的结构模型流动镶嵌模型流动镶嵌模型 1925年年Gorter（欧文顿）等人提出质膜由双层脂分子（欧文顿）等人提出质膜由双层脂分子构成。构成。1935年年Danielli和和Davson提出三夹板模型。提出三夹板模型。1959年年Robertson（罗伯特森）提出单位膜模型。（罗伯特森）提出单位膜模型。1972年年Singer（桑格）和（桑格）和 Nicolson（尼克森）提出（尼克森）提出流动镶嵌模型。该模型主要强调流动镶嵌模型。该模型主要强调膜的流动性；膜的流动性；膜膜蛋白的分布不对称性；这是生物膜的基本特征。蛋白
9、的分布不对称性；这是生物膜的基本特征。根据已有的实验结果，生物膜具有如下共同特征：镶嵌性。膜的基本结构由脂双层分子层镶嵌蛋白构成，双层脂分子以疏水性尾部相对，极性头部朝向水 相。流动性。蛋白质和类脂分子具有相对侧向流动性，不对称性。膜两侧的分子性质和结构不同。蛋白质极性。多肽链的极性区突向膜表面，非极性部位埋在脂双层内。二、细胞膜（质膜）的成分二、细胞膜（质膜）的成分（一）膜脂膜脂：主要包括磷脂、糖脂、胆固醇三种类型。1、磷脂：甘油磷脂和鞘磷脂（C、H、O、N、P）磷脂构成了膜脂的基本成分，由极性头部和两条疏水尾部组成，为双极性分子（由极性头部和两条疏水尾部组成，为双极性分子）。2、糖脂：为鞘
10、氨醇的衍生物。含17个糖残基。3、胆固醇和中性脂质：胆固醇主要存在于动物细胞，可调节膜的流动性、增加膜的稳定性及降低水溶性物质的通透性。某些细菌含有中性脂类。4、膜脂的运动方式 膜脂分子的热运动方式：1、侧向运动；2、自旋运动；3、尾部摆动；4、翻转运动。（二）膜蛋白（二）膜蛋白 1、类型：、类型：膜周边蛋白和膜内在蛋白两类：膜周边蛋白和膜内在蛋白两类：。外在膜蛋白为水溶性蛋白，分布在膜表面，与膜结合较疏松，外在膜蛋白为水溶性蛋白，分布在膜表面，与膜结合较疏松，用温和的方法就可从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。内用温和的方法就可从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。内在蛋白多为跨膜蛋白，也有些插入
11、脂双层中，与脂双层分子在蛋白多为跨膜蛋白，也有些插入脂双层中，与脂双层分子结合紧密。只有用去垢剂使膜崩解后才可分离出。结合紧密。只有用去垢剂使膜崩解后才可分离出。2、膜内在蛋白与膜脂结合的方式：主要方式有、膜内在蛋白与膜脂结合的方式：主要方式有3种种 内在膜蛋白跨膜结构域是与膜脂结合的主要部位。具体作用内在膜蛋白跨膜结构域是与膜脂结合的主要部位。具体作用方式为：方式为：跨膜结构域含有跨膜结构域含有20个左右的疏水氨基酸残基形成个左右的疏水氨基酸残基形成螺旋，其螺旋，其外部疏水侧链通过范德华力与脂双层分相互作用。外部疏水侧链通过范德华力与脂双层分相互作用。某些某些螺旋的外侧是非极性链，内侧极性链
12、，形成特异极性螺旋的外侧是非极性链，内侧极性链，形成特异极性分子的跨膜通道。分子的跨膜通道。某些跨膜蛋白的跨膜结构域常常仅有某些跨膜蛋白的跨膜结构域常常仅有1012个氨基酸残基形个氨基酸残基形成成 折叠结构。折叠结构。3、膜蛋白的分离：去垢剂膜蛋白的分离：去垢剂 是分离与研究膜蛋白的常用试剂，可使细胞膜分解。是分离与研究膜蛋白的常用试剂，可使细胞膜分解。去垢剂有离子型去垢剂去垢剂有离子型去垢剂(如如SDS)和非离子去垢剂和非离子去垢剂(Triton x100)。三、膜的的结构特点：三、膜的的结构特点：（一）流动性流动性1、膜脂的流动：膜脂的流动性主要指脂分子的侧向运动。膜蛋白的运动:（二）膜的
13、不对称性（二）膜的不对称性2、膜脂的不对称性 是指膜脂分子在膜的脂双层中呈不均匀分布，尤其糖脂的分布表现出完全不对称性（在质膜的外表面）。3、膜蛋白的不对称性 膜蛋白的不对称性主要指每种膜蛋白分子(受体、载体蛋白）在细胞膜上都具有明确的方向性。各种生物膜的特征及其生物学功能主要由膜蛋白来决定的各种生物膜的特征及其生物学功能主要由膜蛋白来决定的。四、细胞膜的功能四、细胞膜的功能 细胞质膜的主要功能：为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境；选择性的物质运输并伴随着能量的传递；细胞识别与信息传递；为多种酶提供结合位点；介导细胞与细胞、细胞与基质这间的连接；参与形成细胞表面特化结构。骨架与细胞表面的特化
14、结构骨架与细胞表面的特化结构 细胞表面的细胞表面的特化结构包括膜骨架、鞭毛、纤毛、特化结构包括膜骨架、鞭毛、纤毛、变形足和微绒毛等，变形足和微绒毛等，它们都是细胞质膜与膜内细胞骨它们都是细胞质膜与膜内细胞骨架纤维形成的复合结构，分别于维持细胞的形态、细架纤维形成的复合结构，分别于维持细胞的形态、细胞的运动、细胞与环境的物质交换等功能有关。胞的运动、细胞与环境的物质交换等功能有关。（一）膜骨架（一）膜骨架 膜骨架是指细胞质膜下与膜蛋白相连的由膜骨架是指细胞质膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋纤维蛋白组成的网架结构白组成的网架结构，它参与维持细胞质膜的形状并协，它参与维持细胞质膜的形状并协助完成多种功能。
15、助完成多种功能。红细胞的膜骨架成分主要包括：血影蛋白、肌动红细胞的膜骨架成分主要包括：血影蛋白、肌动蛋白、蛋白、锚蛋白锚蛋白等。等。（二）细胞外被细胞外被(cell coat)又叫糖萼。一般指动物细胞又叫糖萼。一般指动物细胞外表由糖蛋白或糖脂构成的绒絮状物质。起保护细胞和识外表由糖蛋白或糖脂构成的绒絮状物质。起保护细胞和识别细胞的作用。别细胞的作用。（三）三）胞外基质胞外基质是指分布于细胞外空间，由细胞分泌的是指分布于细胞外空间，由细胞分泌的蛋白和多糖所构成的网状结构，它将细胞粘连在一起构成蛋白和多糖所构成的网状结构，它将细胞粘连在一起构成组织，在细胞中或组织之间起支持作用。组织，在细胞中或组
16、织之间起支持作用。细胞外基质的基本成分是由细胞外基质的基本成分是由胶原蛋白和弹性蛋白胶原蛋白和弹性蛋白组成组成的的纤维蛋白、层粘连蛋白和纤粘连蛋白纤维蛋白、层粘连蛋白和纤粘连蛋白组成的组成的粘连蛋白粘连蛋白和和由由糖胺聚糖糖胺聚糖形成的水合胶体构成的复杂的结构体系。层粘形成的水合胶体构成的复杂的结构体系。层粘连蛋白和纤粘连蛋白具有多个结合位点，在细胞与胞外基连蛋白和纤粘连蛋白具有多个结合位点，在细胞与胞外基质成分相互粘着中起重要作用。质成分相互粘着中起重要作用。（四）基底膜：（四）基底膜：胶原蛋白胶原蛋白 1、胶原蛋白的类型及分子结构 胶原蛋白蛋白是胞外基质最基本成分之一，是动物体内含量最丰富
17、的蛋白，目前已发现20种。型胶原是形成纤维的胶原，型纤维为片状(或网状)结构，基膜所特有。胶原纤维的基本分子结构是原胶原。原胶原由3条多肽连盘绕成3股螺旋结构，长300nm直径1.5nm，具有Glyxy（甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸）重复序列。2、胶原蛋白蛋白的功能 胶原在细胞外基质中含量最高，刚性和抗张力强度最大，构成细胞外基质的骨架结构，对细胞具有粘连作用。胶原基质能影响培养细胞的生长和分化。糖胺聚糖和蛋白聚糖糖胺聚糖和蛋白聚糖 1、糖胺聚糖 糖胺聚糖由重复的氨基已糖+糖醛酸二糖单位构成的长链多糖。可分为7类。如透明质酸、肝素等。透明质酸是一种重要的糖氨聚糖是细胞增殖和迁移细胞胞外基质的主要成
18、分，尤其在胚胎组织中。在胞外基质中，透明质酸使结缔具有抗压能力。2、蛋白聚糖 蛋白聚糖是由糖胺聚糖与核心蛋白的丝氨酸残基共价连接形成的分子，这样的单体可借连接蛋白以非共价键与透明质酸结合形成多聚体。层粘连蛋白和纤粘连蛋白层粘连蛋白和纤粘连蛋白 这两种蛋白均为高分子量糖蛋白。1、层粘连蛋白 层粘连蛋白是动物组织基膜的主要结构组分，对基膜基质的组装起关键作用，可介导细胞粘着于胶原进而铺展，并促进细胞生长。通常细胞不直接与型胶原或蛋白聚糖结合，而是通过层粘连蛋白将细胞锚定于基膜上。2、纤粘连蛋 纤粘连蛋白的主要功能是介导细胞粘着。弹性蛋白弹性蛋白 弹性蛋白是弹性纤维的主要成分。弹性纤维与胶原纤维共同
19、存在，分别赋予组织以弹性及抗张性。（五）、植物细胞壁（五）、植物细胞壁 植物细胞壁可看作是高等植物细胞的胞外基质，主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质、伸展蛋白和蛋白聚糖等。细胞壁不仅起支持保护作用，而且其中的某些寡糖具有信号分子的作用。胞外基质不仅提供细胞外的网架赋予组织以抗压和抗张力的机械性能，而且还与细胞的增殖分化和凋亡等重要生命活动有关。第二节 细胞连接 细胞连接是多细胞有机体中相邻细胞之间通过质膜相互联系、协同作用的重要结构。主要有3种类型：封闭连接、锚定连接、通讯连接封闭连接、锚定连接、通讯连接 一、封闭连接一、封闭连接 封闭连接的主要形式是紧密连接。紧密连接存在于上皮细胞之间，通过
20、嵴线使相邻细胞质膜紧靠在一起，可阻止可溶性物质沿细胞间隙渗入体内。同时还起到膜蛋白的隔离作用。二、锚定连接二、锚定连接 锚定连接使相邻细胞的骨架系统或将细胞与基质相连形成 一个坚挺有序的群体。（一）桥粒与半桥粒 桥粒在细胞之间形成纽扣式的结构将相邻细胞铆接在一起，同时也是细胞内中等纤维的锚定位点。桥粒相邻细胞质膜的间隙约30nm。在质膜的胞质面有一致密斑，中间纤维直接与其相连。相邻两细胞的致密斑由跨膜连接糖蛋白连接。（二）粘合带与粘合斑 粘合带位于上皮组织的下方，相邻细胞间形成一个连续的带状结构。粘合带处相邻细胞质膜的间隙约1520nm。与粘合带相连的是微丝（又称肌动蛋白纤维），在细胞中形成平
21、行质膜的可收缩的纤维束。粘合斑是肌动蛋白纤维与细胞外基质的连接方式。在粘合斑处，跨膜连接糖蛋白向外通过纤粘连蛋白与胞外基质结合，其胞内结构域则通过微丝结合蛋白与肌动蛋白纤维结合。粘合带及粘合斑均起细胞附着与支持作用。三、通讯连接三、通讯连接（一）间隙连接 间隙连接相邻处质膜间的间隙为23nm。连接的基本单位是连接子。连接子由6个相同或类似的跨膜蛋白亚单位环绕。形成直径越1.5nm的孔道。相邻细胞质膜上的两个连接子相对形成间隙连接单位。间隙连接在细胞间代谢耦联和细胞通讯中具有重要作用。（二）胞间连丝 高等植物细胞之间通过胞间连丝相互连接，完成细胞通讯联络。（三）化学突触 化学突触是存在于可兴奋细
22、胞之间的细胞连接方式，它通过释放神经递质来传导神经冲动。四、细胞表面的粘着因子（了解）四、细胞表面的粘着因子（了解）细胞与细胞之间的粘连是由特定的细胞粘着因子钙粘素等介导的，细胞之间的锚定连接也需要粘着因子钙粘素与整联蛋白等参与。粘着因子均为整合膜蛋白，在胞内与细胞骨架成分相连。多数要依赖Ca2+或Mg2+才起作用，少数不需要Ca2。1、钙粘素 同亲性依赖Ca2+的细胞粘连糖蛋白，对胚胎发育中的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官构成具有主要作用。目前已发现几十种钙粘素，如E钙粘素、P钙粘素等。2、选择素 异亲性依赖于Ca2+的糖蛋白，主要参与白细胞与脉管内皮细胞之间的识别与粘着。3、免疫球蛋白超家族的CAM 分子结构中具有与免疫球蛋白类似的结构域CAM超家族。其粘着作用不依赖于Ca2+。其中了解最多的为NCAMs，它在神经组织细胞间的粘着中起主要作用。4、整联蛋白 一类重要的细胞粘着因子，是由和两个亚基形成的异源二聚体糖蛋白。介导细胞与基质、细胞与细胞之间的粘着。思考题 1、生物膜的基本特征是什么？2、何谓膜内在蛋白？膜内在蛋白以什么方式与膜脂相结合？3、细胞表面有哪些特化结构？膜骨架的基本结构与功能是什么？4、细胞连接有哪几种类型，名有何功能？5、胞外基质的组成？6、细胞质膜的功能？
