1、基因工程的克隆载体基因工程的克隆载体Genetic Cloning VectorGenetic Cloning Vector基因工程的基本程序及研究策略基因工程的基本程序及研究策略 目的基因的制备目的基因的制备(donor DNA)载体载体DNA及其改造及其改造(Vector DNA)体外体外DNA重组重组(DNA recombination)重组重组DNA的转化的转化(Transformation)重组体的筛选鉴定与重组体的筛选鉴定与克隆扩增克隆扩增(identification&clone amplification)目的目的DNA在受体细胞中的在受体细胞中的表达表达(gene expre
2、ssion)基因工程的目的 基因克隆基因克隆-获得目的基因 基因表达基因表达-使受体的新性状表现，获得大量目的蛋白In vivo expressionIn vitro expression载体载体-基因工程中的重要工具基因工程中的重要工具 载体载体(vector)(vector)：携带外源DNA进入宿主细胞的工具 载体的功能载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件 载体的两种扩增方式载体的两种扩增方式-自主复制型载体自主复制型载体和附加载体和附加载体克隆载体（克隆载体（cloning vector)定义定义(defini
3、tion)特点特点(features)常用载体介绍常用载体介绍(several vectors)第一节第一节 概述概述introductionintroduction一、概念一、概念克隆载体（克隆载体（cloning vector)cloning vector)：用于携：用于携带目的基因（外源基因）进入受体细带目的基因（外源基因）进入受体细胞进行复制、扩增的工具。胞进行复制、扩增的工具。二、特点二、特点(vectors which are used in genetic engineering should:)1、能独立复制，具有、能独立复制，具有复制子复制子（replican)replica
4、n：基因组中能独立复制的最小单位，：基因组中能独立复制的最小单位，含含复制起始点复制起始点(ori)和复制终点。和复制终点。DNA的复制由的复制由ori控制控制 原核细胞的染色体和质粒有固定的原核细胞的染色体和质粒有固定的ori 真核细胞的染色体有多个真核细胞的染色体有多个ori按复制起点划分克隆载体按复制起点划分克隆载体 质粒复制型质粒复制型复制起点来自质粒复制起点来自质粒 ARSARS复制型复制型ARSARS（autonomus replicative sequence)autonomus replicative sequence)，或称，或称染色体复制型染色体复制型 病毒复制型病毒复制型
5、复制起点来自病毒复制起点来自病毒 混合复制型混合复制型 同种生物复制起点混合同种生物复制起点混合质粒形式存在；质粒或病毒形式存在质粒形式存在；质粒或病毒形式存在 不同生物复制起点混合不同生物复制起点混合穿梭载体穿梭载体（shuttle vectorshuttle vector）两种生）两种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中以质粒或病毒形式存在一种生物中以质粒或病毒形式存在复制起点种类与拷贝数间的关系复制起点种类与拷贝数间的关系 1)1)质粒复制起点类型质粒复制起点类型：低拷贝（低拷贝（严紧型严紧型，1-2 c
6、opies1-2 copies，受宿主染色，受宿主染色体基因控制）体基因控制）高拷贝（高拷贝（松弛型松弛型，20 copies20 copies，受宿主染色，受宿主染色体控制较弱）体控制较弱）2)ARS2)ARS型载体型载体：拷贝数较高（约：拷贝数较高（约20 copies20 copies）3)3)病毒型复制起点病毒型复制起点：高拷贝：高拷贝2 2、属于、属于松弛型复制子松弛型复制子(relaxed plasmidrelaxed plasmid)3 3、具有、具有复制非必需区复制非必需区4 4、有一个或多个单一酶切位点，即多克隆位点、有一个或多个单一酶切位点，即多克隆位点多克隆位点（多克隆位
7、点（Multiple cloning site,MCSMultiple cloning site,MCS）：一段人工合成的一段人工合成的DNADNA序列，其上含有密集排列序列，其上含有密集排列的多种单一限制性内切酶位点，以利于不同来的多种单一限制性内切酶位点，以利于不同来源的外源源的外源DNADNA插入载体。插入载体。5、具有筛选标记、具有筛选标记6、分子量合适（、分子量合适（3-10kb)7、高拷贝数、高拷贝数 拷贝数（拷贝数（copy):一个细胞内存在的一个细胞内存在的 分子数分子数8、生物安全性好、生物安全性好三、三、克隆载体必备条件克隆载体必备条件（1 1）具有复制起点）具有复制起点（
8、2 2）具有抗菌素抗性基因（遗传标记）具有抗菌素抗性基因（遗传标记）（3 3）具有若干限制酶单一识别位点，允许外源）具有若干限制酶单一识别位点，允许外源基因插入基因插入（4 4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。四、常用克隆载体种类四、常用克隆载体种类Classification of cloning vectors)质粒（质粒（plasmid)plasmid)噬菌体（噬菌体（bacteriophage bacteriophage )粘粒（粘粒（cosmidcosmid）M13M13噬菌体（噬菌体（bateriophage M13bateriopha
9、ge M13）人工染色体人工染色体(artificial chromosome)(artificial chromosome)第二节第二节 常用克隆载体介绍常用克隆载体介绍Several cloning vectorsSeveral cloning vectors一、质粒（一、质粒（plasmid)（一）（一）一般特性一般特性(features)Plasmid：染色体外能够进行自主复制的遗传单位。染色体外能够进行自主复制的遗传单位。包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸核酸(DNA)(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵
10、母菌和放线分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的菌等生物中染色体以外的DNADNA分子。在基因工程中质粒常被分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体用做基因的载体 多为环状双链多为环状双链DNA 可自我独立复制可自我独立复制 天然存在：天然存在：F质粒、质粒、R质粒等质粒等 编码重要遗传信息编码重要遗传信息 不相容性不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性：是指在：是指在没有选择压力的情况下，没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的主细胞系中稳定地共存的现象。现象。质粒的不相容性分
11、子质粒的不相容性分子基础，主要是由于它基础，主要是由于它们在们在复制功能之间的复制功能之间的相互干扰相互干扰造成的。造成的。（二）分类（二）分类(classification)大小：小型质粒大小：小型质粒(15kb)大型质粒大型质粒(60kb)功能：功能：F质粒、质粒、R质粒质粒 宿主：宿主：窄宿主范围质粒窄宿主范围质粒：ori特异，仅能在特异，仅能在一种宿主中复制一种宿主中复制 宽宿主范围质粒宽宿主范围质粒：ori不特异，可在多不特异，可在多种宿主中复制种宿主中复制 复制类型：复制类型：严紧型质粒严紧型质粒：复制受宿主细胞的严格控制复制受宿主细胞的严格控制 低拷贝数（低拷贝数（1-2copi
12、es/cell)松弛型质粒松弛型质粒：拷贝数高拷贝数高(10-200 copies/cell)复制仅需复制仅需DNA聚合酶聚合酶I，不需蛋白质合成，不需蛋白质合成 宿主细胞蛋白质合成及染色体复制停止时，可宿主细胞蛋白质合成及染色体复制停止时，可大量扩增至上千份（大量扩增至上千份（氯霉素氯霉素）构型构型：超螺旋型（超螺旋型（supercoiled circle,SC)supercoiled circle,SC)oror 共价闭共价闭环双股环双股DNA(covalently closed circle,CCC)DNA(covalently closed circle,CCC)开环型（开环型（ope
13、ned circle,OCopened circle,OC）线形（线形（linear circle,LC)linear circle,LC)（三）质粒的命名（三）质粒的命名 用小写字母用小写字母p p代表质粒代表质粒（plasmidplasmid），在），在p p字母后用字母后用两个两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上，再加上质粒编号质粒编号。如：如：pBR322pBR322：p p表示一种质粒，而表示一种质粒，而“BRBR”则是分别取自该质则是分别取自该质粒的两位主要构建者粒的两位主要构建者F.BolivarF.Bolivar和和R
14、.L.RodriguezR.L.Rodriguez，322322为编号。为编号。（四）克隆质粒的改建（四）克隆质粒的改建(how can cloning vectors be made)1 1、改建质粒的目的、改建质粒的目的调整质粒结构、提高转化率调整质粒结构、提高转化率2 2、常用手段：、常用手段：减小分子量减小分子量 引入引入MCSMCS 引入具有多种用途的辅助序列引入具有多种用途的辅助序列向天然质粒中引入选择标记向天然质粒中引入选择标记,pSC101多个质粒多个质粒重组重组，增强选择标记，增强选择标记,过大过大,pBR313减小复制非必需区减小复制非必需区,缩小分子量缩小分子量,增大容量
15、增大容量,pBR322调整质粒结构，调整质粒结构，完善载体功能完善载体功能（减小分子量、引入（减小分子量、引入MCS及辅助序列）及辅助序列）3 3、克隆质粒的发展趋势、克隆质粒的发展趋势4 4、发展概况、发展概况 第一阶段（第一阶段（19771977年前）：年前）：天然质粒和重组质粒的利天然质粒和重组质粒的利用用，如，如pSC101,colE1,pCR,pBR313pSC101,colE1,pCR,pBR313和和pBR322 pBR322(1977,Bolivar et al)(1977,Bolivar et al)第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多增大载体容量（降低载
16、体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因克隆位点区和新的遗传标记基因。如。如pUCpUC系列载体。系列载体。第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能进一步完善载体功能以满足基因工程克隆以满足基因工程克隆中的不同要求，如中的不同要求，如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。单标记、复制效单标记、复制效率低（平均每个率低（平均每个寄主细胞仅有寄主细胞仅有12个拷贝）个拷贝）双标记，双标记，50%以上以上的复制非必需区的复制非必需区9.09kb物理图谱物理图谱（physical m
17、ap)物理图谱（物理图谱（physical physical map):map):在在DNADNA分子上标分子上标明限制性内切酶位点、明限制性内切酶位点、数目、排列顺序及特数目、排列顺序及特征性功能标记的图形。征性功能标记的图形。又称为又称为限制图谱限制图谱（restriction map)restriction map)载体物理图谱识图要求载体物理图谱识图要求1 1、载体大小、载体大小2 2、载体类型、载体类型3 3、载体组成、载体组成4 4、载体主要元件（特点）、载体主要元件（特点）及其应用及其应用（五）常见人工构建质粒的分类（五）常见人工构建质粒的分类:according to thei
18、r functions,plasmids can according to their functions,plasmids can be classified into:be classified into:人工构建的质粒根据其功能及用途分为人工构建的质粒根据其功能及用途分为:1.1.多拷贝质粒多拷贝质粒 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。扩增外源基因。2.2.测序质粒测序质粒sequencing plasmidsequencing plasmid3.3
19、.整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组便于外源基因准确重组整合整合入受体细胞的染入受体细胞的染色体上色体上4.4.穿梭质粒穿梭质粒shuttle plasmidsshuttle plasmids 含有两个不同的含有两个不同的复制子，能在复制子，能在两种不同的受体两种不同的受体细胞中复制细胞中复制5.5.表达质粒表达质粒expression plasmidsexpression plasmids 装有装有强的启强的启动基因动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效便任何外
20、源基因在受体细胞内的高效表达表达（六）常用质粒介绍六）常用质粒介绍detail introduction of several plasmids质粒命名原则质粒命名原则4.36kb双标记双标记分散的多个单一酶切位点分散的多个单一酶切位点插入灭活插入灭活双抗菌素对照实验双抗菌素对照实验1 1、pBR322pBR3227777年年BoliverBoliver构建构建插入失活、双抗菌素对照实验插入失活、双抗菌素对照实验pBR322衍生质粒衍生质粒2 2、pUC18/19pUC18/19pBR322pBR322的重要衍生质粒的重要衍生质粒1983年构建：年构建：pBR322+M13基本元件：基本元件：
21、ori Ampr MCS 辅助序列：辅助序列：lacZ基因编码基因编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶lacI基因编码阻遏蛋白基因编码阻遏蛋白,使使lacZ不能表达不能表达 诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,lacZ表达表达乳糖操纵子乳糖操纵子(lac Z operon)乳糖操纵子的表达调控乳糖操纵子的表达调控Regulation of Lac Z expressionpUC载体载体(含含lacZ、lacI基因）基因）诱导物诱导物(IPTG)lacZ表达表达-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端片段（端片段（-肽）肽）宿主细胞宿主细胞lacZ M15缺陷型缺陷型-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶X
22、-gal变兰色变兰色pUCpUC载体蓝白斑筛选的原理载体蓝白斑筛选的原理-插入失活插入失活1 1how to select positive clone using a vector with LacZhow to select positive clone using a vector with LacZpUC载体载体(含含lacZ、lacI基因）基因）外源基因插入外源基因插入lacZ失活失活不产生不产生-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端端片段（片段（-肽）肽）X-gal不变色，呈白色不变色，呈白色pUCpUC载体蓝白斑筛选的原理载体蓝白斑筛选的原理-插入失活插入失活2 23 3、pGEMpGEM系
23、列系列pGEM-1pGEM-1MCSMCS两侧有两侧有SP6SP6、T7RNAT7RNA聚合酶聚合酶启动子启动子pGEM-1pGEM-1MCSMCS两侧有两侧有SP6SP6、T7RNAT7RNA聚合酶启动子聚合酶启动子1 1、可进行体外转录、可进行体外转录 转录具有特异性转录具有特异性 可分别转录插入片段的两条链可分别转录插入片段的两条链 转录产物可制备转录产物可制备体外翻译的模板、探体外翻译的模板、探针及反义针及反义RNARNA2 2、为插入片段的测序提供特异引物位点、为插入片段的测序提供特异引物位点pGEM-3/4Z-MCS位于位于lacZ基因内部基因内部插入失活插入失活蓝白斑筛选蓝白斑筛
24、选具有具有SP6、T7启动子启动子pGEM-3Zf(+)/(-)-引入丝状噬菌体引入丝状噬菌体f1(+)/(-)复制起始点复制起始点 可以产生单链可以产生单链DNA，并，并分泌至上清中，便于对分泌至上清中，便于对插入片段进行测序插入片段进行测序 F1的方向的方向(+/-)决定复制决定复制哪一条链哪一条链4 4、T-vectorT-vector用于用于PCRPCR产物的直接克隆产物的直接克隆 载体DNA两条链的5端有一个游离的T：PCR产物的直接克隆 SP6、T7启动子：体外转录、为克隆产物的测序提供特异性引物 插入位点两侧的酶切位点：为回收克隆片段进行亚克隆提供便利的酶切位点5 5、pCDNA
25、3-pCDNA3-穿梭载体穿梭载体 穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector)shuttle vector)即可以携带外源基因在原核细胞即可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞中表中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载体达的载体。小小 结结(conclusions)(conclusions)质粒的发展趋势：质粒的发展趋势：调整质粒结构、提高载体效率：减小分子调整质粒结构、提高载体效率：减小分子量、引入量、引入MCSMCS引入多种用途的辅助序列引入多种用途的辅助序列:lacZlacZ、lacIlacI基因：基因：蓝白斑筛选蓝白斑筛选 SP6SP6、T7RNAT7RNA聚合
26、酶启动子：聚合酶启动子：体外转录体外转录 F1F1复制起始点：复制起始点：产生单链产生单链DNADNA 真核启动子：真核启动子：穿梭载体穿梭载体二、二、噬菌体载体噬菌体载体Bacteriolphage Bacteriolphage （一）（一）噬菌体的分子生物学噬菌体的分子生物学biological features of bacterophage biological features of bacterophage 1 1、噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和-DNA-DNA组成组成2 2、-DNA-DNA：线状双链线状双链DNADNA分子，全长
27、分子，全长48.5kb48.5kb 两端各有一个两端各有一个1212核苷酸的互补单链（粘性末端，核苷酸的互补单链（粘性末端，GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGAGGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，称为，称为 CosCos位点位点（cohesive endcohesive end）或或coscos区。区。功能相近的基因在基因组中聚集在功能相近的基因在基因组中聚集在 一起。一起。噬菌体生物学性状介绍噬菌体生物学性状介绍3 3、基因组成：、基因组成：48.5 kb in length；Linear or circular genome(cos ends)CosCos位点
28、（位点（cohesive end)cohesive end)：DNA DNA分子两端各有一个分子两端各有一个1212碱基长的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称碱基长的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称 coscos位点位点 左臂（左臂（编码外壳蛋白编码外壳蛋白）：头部基因（）：头部基因（7 7个）、尾部基因个）、尾部基因（1111个）个）右臂（右臂（负责裂解宿主细胞、负责裂解宿主细胞、DNADNA自主复制以及调控自主复制以及调控)：裂：裂解基因（解基因（2 2个）个）中间段中间段(控制基因组整合到寄主基因的基因控制基因组整合到寄主基因的基因)：DNADNA复制复制及溶菌生长非必需区及溶菌生长非
29、必需区（重组基因、正调控基因、负调控（重组基因、正调控基因、负调控基因）、基因）、DNADNA合成基因合成基因coscos位点的作用位点的作用4 4、生活周期、生活周期温和性噬菌体温和性噬菌体（二）（二）DNADNA载体的构建载体的构建 建立建立克隆载体前需要解决克隆载体前需要解决2 2个问题：个问题：Two key points of preparing Two key points of preparing vectors vectors1 1）包装容量有限）包装容量有限：DNADNA分子只能增加分子只能增加5%5%的的大小，意味着只能插入大小，意味着只能插入3kb3kb的的DNADNA分
30、子。分子。2 2）酶切位点复杂）酶切位点复杂：基因组非常大，对于基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过每一种酶来讲都含有超过1 1个的识别序列，酶切后个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成产生多个片段，连接不能形成基因组。基因组。两种解决方案：两种解决方案：1 1）缩短长度）缩短长度：DNADNA上约有上约有40-50%40-50%的的DNADNA片段是片段是复制、裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。复制、裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。2 2）修饰酶切识别位点：）修饰酶切识别位点：利用自然选择法获得限制利用自然选择法获得限制性位点缺失的性位点缺失的品系。品系。天然的天然的-
31、DNA-DNA上有多个酶切位点，如：上有多个酶切位点，如：EcoRI 5EcoRI 5个，个，HindIII 7HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。个，这些多余的酶切位点必须被修饰。DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong(left)armshort(right)armExogenous DNA(20-23 kb)phage12bp Viruses that can infect bacteria.48.5 kb in lengthLinear or circular genome(cos ends)phageLytic phas
32、e(Replicate and release)Lysogenic phase(integrate into host genome)自然选择法自然选择法：利用一个：利用一个产生产生EcoRIEcoRI的大肠杆菌，的大肠杆菌，大部分侵入细胞的大部分侵入细胞的 DNADNA分子会被限制性酶破分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌这些就是突变型的噬菌体，其体，其EcoRIEcoRI位点缺失了。位点缺失了。（三）（三）噬菌体载体噬菌体载体1 1、基本组成元件、基本组成元件components of components of vectors vectors C
33、osCos位点位点 左臂（头尾基因）左臂（头尾基因）右臂（裂解基因）右臂（裂解基因）酶切位点酶切位点噬菌体载体噬菌体载体2 2、类型、类型types of types of vectors vectors：插入型载体：插入型载体：含有单个或多个单一酶切位含有单个或多个单一酶切位点供外源基因插入点供外源基因插入替换型载体：替换型载体：含有一对或多对酶切位点便含有一对或多对酶切位点便于外源基因替换于外源基因替换 插入型载体插入型载体(insertion vector)(insertion vector)该类载体经改造后的长度为该类载体经改造后的长度为37kb37kb，为包装，为包装的下限，它本身也
34、能被包装，其允许的插入片段的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为最大为17.9kb17.9kb（54.9-37kb54.9-37kb）。）。由于该类载体重组与否均可包装，因而为由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（0-0-17.9kb17.9kb）gt10gt10：可以携带可以携带8kb8kb的的DNADNA分子，插入位于分子，插入位于cIcI基基因内的单一的酶切位点因内的单一的酶切位点EcoRIEcoRI。插入失活导致。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。裂解循环，从而很容易识别重组子。ZAPII
35、ZAPII：含有多聚接头，可以使用六种不同的含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约限制性内切酶插入约10kb10kb的新的的新的DNADNA分子，通分子，通过过lacZlacZ基因的插入失活鉴定重组子，不能形基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。成蓝色的噬菌斑。替换型载体替换型载体(replacement vector)(replacement vector)该类载体经改造后的长度约为该类载体经改造后的长度约为40kb40kb，在非，在非必需区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距必需区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距离为离为14kb14kb长，使用时用酶切开，分离去除
36、这个长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb14kb长的长的DNADNA片段，然后用外源片段，然后用外源DNADNA片段取代之。片段取代之。特点：特点：容量大，且有一个下限容量大，且有一个下限：40-14kb=26kb40-14kb=26kb，包装下限为包装下限为36.4kb36.4kb，因此其载装下限为，因此其载装下限为10.410.4而上而上限为限为25.5kb25.5kb。WES.BWES.B：两个两个 EcoRIEcoRI位点跨越替换区位点跨越替换区域，根据分子大小筛选重组子。域，根据分子大小筛选重组子。EMBL3EMBL4EMBL4：可以插入可以插入20kb20kb的的DNADNA分
37、子，可利用分子，可利用EcoRIEcoRI、BamHIBamHI、SalISalI替换填充片段，因此替换填充片段，因此可以插入不同粘端的可以插入不同粘端的DNADNA片断。片断。噬菌体载体噬菌体载体3 3、体外包装、体外包装将重组的噬菌体将重组的噬菌体DNADNA分子与噬菌体头、尾分子与噬菌体头、尾部蛋白混合，通过自动包装，体外组部蛋白混合，通过自动包装，体外组成完整的具有极强感染性噬菌体颗粒成完整的具有极强感染性噬菌体颗粒的过程。的过程。噬菌体载体噬菌体载体 外源基因外源基因重组噬菌体重组噬菌体DNADNA替换替换/插入插入噬菌体头、尾蛋白噬菌体头、尾蛋白子代病毒颗粒子代病毒颗粒体外包装体外
38、包装宿主宿主感染感染大量扩增目的大量扩增目的DNA DNA 感染力较低感染力较低感染力极强感染力极强以感染方式导入细胞的频率可达以感染方式导入细胞的频率可达106108/gDNA，而以转染，而以转染（translation）的方式导入的频）的方式导入的频率仅为率仅为103105/gDNA噬菌体载体噬菌体载体4 4、用途：、用途：构建文库，容量大构建文库，容量大5.-DNA5.-DNA作为载体的优点作为载体的优点merits of merits of vectors vectors 1)-DNA1)-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌能高效感染大肠杆菌2
39、)-DNA2)-DNA作为载体，其装载外源作为载体，其装载外源DNADNA的的能力为能力为25kb25kb，远远大于质粒的装载量，远远大于质粒的装载量3)3)重组重组-DNA-DNA的筛选较为方便的筛选较为方便4)4)重组重组-DNA-DNA分子的提取比质粒容易分子的提取比质粒容易 三、三、粘粒（粘粒（cosmid)cosmid)19781978年构建年构建（一）考斯质粒（一）考斯质粒(粘粒，粘粒，cosmid)cosmid)：即含有：即含有-DNA-DNA两端两端coscos区的质粒。区的质粒。cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬
40、菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。将此DNA片段与质粒连在一起，即cosmid,就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍可象-DNA一样，被体外包装，以感染方式，高效的将重组DNA转入大肠杆菌 考斯质粒不能形成子代病毒颗粒，更不能裂解细胞，而是以质粒形式进行复制。由质粒和噬菌体cos位点构建而成，同时具备二者的特点：质粒ori-环状复制 单一酶切位点 选择标记 Cos位点体外包装 构建DNA文库，容量为2945kb（二）（二）考斯质粒的优越性考斯质粒的优越性1)1)能象能象-DNA-DNA一样体外包装，并高效导一样体外包装，并高效导入受体细胞入受体细胞2)2)容量大，如
41、容量大，如coscos区及附近顺序长为区及附近顺序长为1.7 1.7 kbkb，质粒长为，质粒长为3.3kb3.3kb，则该考斯质粒最大可，则该考斯质粒最大可装载装载46.5kb46.5kb的外源的外源DNADNA3)3)由于携带质粒的选择标记，便于筛选由于携带质粒的选择标记，便于筛选4)4)由于质粒上的多种单一酶切位点，便由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。于克隆。以以cosmidcosmid为载体克隆为载体克隆DNADNA的技术路线的技术路线柯斯质粒pHC79系列由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成全长4.3kbDigestionLigationC)Packaging
42、 and infectFormation of a cosmid cloneLigation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers,resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.四、四、M13M13噬菌体载体噬菌体载体Bacterophage M13Bacterophage M13 M13M13噬菌体：噬菌体：E.coliE.coli的丝状噬菌体的丝状噬菌体 闭环正链闭环正链ssDNAssDNA，
43、6.4kb6.4kbM13 M13 生殖周期生殖周期向胞外分泌单链向胞外分泌单链DNADNARFDNAM13M13噬菌体载体的构建：噬菌体载体的构建：M13-DNAM13-DNA上几乎没有非必需区域，因而载体上几乎没有非必需区域，因而载体的构建主要是插入标记基因如，的构建主要是插入标记基因如，lacZlacZ、多、多克隆位点，消除多余的酶切位点。克隆位点，消除多余的酶切位点。Blue-white selection M13M13载体系列载体系列 M13 DNA M13 DNA 上引入上引入lacZlacZ基因基因 M13mp1M13mp1，可以通过插入失活鉴定重组噬菌斑。可以通过插入失活鉴定重
44、组噬菌斑。M13mp1M13mp1载体通过体外定点突变载体通过体外定点突变,在基因的在基因的起始端，获得含有起始端，获得含有6 6碱基的序列碱基的序列GCATTC GCATTC(EcoRI(EcoRI位点位点)M13mp2)M13mp2。合成短的多聚核苷酸合成短的多聚核苷酸(polylinker),(polylinker),插入到插入到M13mp2M13mp2的的EcoRIEcoRI位点上位点上,就将限制性内切酶就将限制性内切酶位点引入到位点引入到lacZlacZ基因基因 M13mp7M13mp7。M13M13噬菌体载体：用于制备单链噬菌体载体：用于制备单链DNADNA、测序、测序M13M13
45、克克隆载体隆载体分子结分子结构图构图五、噬菌粒载体五、噬菌粒载体噬菌粒载体噬菌粒载体 由由质粒质粒载体和载体和单链噬菌体单链噬菌体载体结合而成载体结合而成的新型的载体系列。的新型的载体系列。它具有它具有质粒质粒的复制起点、选择性标记、的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便多克隆位点等，方便DNADNA的操作，可在细胞的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生殖，产生单链的子代噬菌体单链的子代噬菌体。1.1.具有较小分子量，可克隆具有较小分子量，可克隆10
46、kb10kb的外源的外源DNADNA片段，并片段，并易于进行分离与操作；易于进行分离与操作；2.2.编码一个编码一个ampampr r基因作为选基因作为选择记号，便于转化子的选择记号，便于转化子的选择；择；3.3.拷贝数含量高，每个寄主拷贝数含量高，每个寄主可高达可高达500500个；个；4.4.存在着一个多克隆位点区，存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外因此许多种不同类型的外源源DNADNA片段，不经修饰便片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；可直接插入到载体分子上；常用的噬菌粒载体常用的噬菌粒载体pUC118pUC118和和pUC119pUC1195.5.lacZlacZ基因插
47、入失活基因插入失活，可按照，可按照IPTGIPTG组织化学显色反应组织化学显色反应试验，筛选重组子；试验，筛选重组子；6.lacZ6.lacZ基因是置于基因是置于laclac启动子启动子的控制之下，这样插入的的控制之下，这样插入的外源基因便会以外源基因便会以融合蛋白质的形式表达融合蛋白质的形式表达；7.7.含有含有质粒的复制起点质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链制形成大量的双链DNADNA分子分子8.8.带有一个带有一个M13M13噬菌体的复制噬菌体的复制起
48、点起点，在有辅助噬菌体感染，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出的寄主细胞中，可以合成出单链单链DNADNA拷贝，并包装成噬拷贝，并包装成噬菌体颗菌体颗分泌分泌到培养基中；到培养基中；9.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；10.可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。pBluescript噬菌粒载体基本结构：1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；2.同时具有一个
49、单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA；3.编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子记号；4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。T7T3用于体外转录六、六、人工染色体人工染色体克隆大片段克隆大片段DNADNA1 1、真核生物染色体中的关键部位（分裂、真核生物染色体中的关键部位（分裂、复制必需区）复制必需区）着丝粒着丝粒(centromere,CEN):(centromere,CEN):分裂分裂 端粒端粒(telomere,TEL)(telomere,TEL)：保护
50、染色体、维持：保护染色体、维持染色体复制染色体复制 自主复制序列自主复制序列(autonomously(autonomously replication sequencereplication sequence，ARS)ARS)：复制起始：复制起始位点位点2 2、人工染色体：、人工染色体：以真核生物的以真核生物的CENCEN、TELTEL、ARS ARS 为骨架，可携带插入的外源基因进行为骨架，可携带插入的外源基因进行复制，即为人工染色体复制，即为人工染色体3 3、种类：、种类：酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeat yeat artificial chromosome,YAC)artifi
