1、第第15章章 色谱分析方法导论色谱分析方法导论15.1 概述概述历史、色谱分离过程、分类历史、色谱分离过程、分类15.2 色谱流出曲线色谱流出曲线色谱图及相关术语色谱图及相关术语15.3 色谱法基本原理色谱法基本原理描述分配过程参数、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述描述分配过程参数、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述(塔板理论及速率塔板理论及速率理论理论)15.4 分离度及色谱分离方程分离度及色谱分离方程分离度及色谱分离方程、影响分离的因素分离度及色谱分离方程、影响分离的因素15.1 概述概述 化学分析方法的基本要求是其选择性要高。即，在分析过程中，待化学分析方法的基本要求是其选择性要高。即，在分析
2、过程中，待测物与潜在的干扰物的分离是最为重要的步骤！测物与潜在的干扰物的分离是最为重要的步骤！20 世纪中期，大量采用一些经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取世纪中期，大量采用一些经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取 现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。迄今为止，色谱方法现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。迄今为止，色谱方法是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域。是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域。历史：历史：1903年，俄国植物学家年，俄国植物学家Mikhail Tswett 最先发明。他采用填充有固最先发明。他采用填充有固体体CaCO3细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物细粒
3、子的玻璃柱，将植物色素的混合物(叶绿素和叶黄素叶绿素和叶黄素 chlorophylls&xanthophylls)加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分 离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱(希腊语中希腊语中 “chroma”=color;“graphein”=write)。50年代，色谱发展最快（一些新型色谱技术的发展；复杂组分分年代，色谱发展最快（一些新型色谱技术的发展；复杂组分分析发展的要求。析发展的要求。1937-1972年，年，15年中有年中有12个个Nobel奖是有关色谱研究的！奖是有关色谱研究的！色谱分
4、离基本原理：色谱分离基本原理：使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。样品中各组份在两相中进行不柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。样品中各组份在两相中进行不同程度的作用。与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，反之，与固定同程度的作用。与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，反之，与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差异，使得混合组相作用弱的组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差异，使得混合组份最终形成各个单组份的份最终形成各
5、个单组份的“带带(band)”或或“区区(zone)”，对依次流出的各个单组份，对依次流出的各个单组份物质可分别进行定性、定量分析。物质可分别进行定性、定量分析。色谱分类方法：色谱分类方法：1.按固定相外形分：按固定相外形分：柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱。柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱。2.按组份在固定相上的分离机理分：按组份在固定相上的分离机理分：吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；离子交换色谱：不同组份在固定相
6、（离子交换剂）上的亲和力不同；离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；凝胶色谱（尺寸排阻色谱）不同尺寸分子在固定相上的渗透作用。凝胶色谱（尺寸排阻色谱）不同尺寸分子在固定相上的渗透作用。3.按两相状态分按两相状态分分类分类 方法方法 固定相固定相 平衡类型平衡类型 气液色谱气液色谱 液体吸附液体吸附于于固体固体 气液间分配气液间分配 气固色谱气固色谱 固体吸附剂固体吸附剂 吸附吸附 气气 相相 色色 谱谱 气相键合色谱气相键合色谱 有机组份键合于有机组份键合于固体表面固体表面 液体和键合体液体和键合体表面间的分配表面间的分配 液液色谱液液色谱 液体吸附液体吸附于于固体固体
7、不相溶液体间不相溶液体间的分配的分配 液固液固(吸附吸附)色色谱谱 固体吸附剂固体吸附剂 吸附吸附 液相键合色谱液相键合色谱 有机组份键合于有机组份键合于固体表面固体表面 液体和键合体液体和键合体表面间的分配表面间的分配 离子交换色谱离子交换色谱 离子交换树脂离子交换树脂 离子交换离子交换 液液 相相 色色 谱谱 凝胶渗透凝胶渗透(尺寸尺寸排阻排阻)色谱色谱 液体附于多孔聚液体附于多孔聚合物合物 分配分配/筛析筛析 超临界超临界流体流体 有机组份键合于有机组份键合于固固体表面体表面 超临界流体和超临界流体和键合相间键合相间分配分配 15.2 色谱流出曲线（色谱图）色谱流出曲线（色谱图）混合组分
8、的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应色谱术语：色谱术语：1）基线：在实验条件下）基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线进入检测器时的流出曲线称为基线，称为基线，S/N大的、稳大的、稳定的基线为水平直线。定的基线为水平直线。2）峰高：色谱峰顶点与）峰高：色谱峰顶点与基线的距离。基线的距离。u0tLu 死死时时间间柱柱长长3）保留值）保留值(Retention value,R)a.死时间死时间(Dead time,t0)：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时：不与固定相作用的物质从进样到出现
9、峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据其流速与流动相的流速相近。据 t0 可求出流动相平均流速可求出流动相平均流速 b.保留时间保留时间tr：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间通过柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间。和组份在固定相中滞留的时间。c.调整保留时间调整保留时间 ：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份
10、在固定相中的滞留时间。即份在固定相中的滞留时间。即 由于时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时由于时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。需用保留体积来表示保留值。d.死体积死体积V0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。勿略后两项可得到：和检测器间隙的总和。勿略后两项可得到：其中，其中，Fco为柱出口的载气流速为柱出口的载气流速（mL/min)，其值为：，其值为：F0-检测器出口流速；检测器出口流速；Tr-室温；室温；Tc-柱温；柱温；
11、p0-大气压；大气压；pw-室温时水蒸汽压。室温时水蒸汽压。rt0rrttt co00FtV 0w0rc0copppTTFF e.保留体积保留体积Vr：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。的体积。f.调整保留体积调整保留体积 ：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。g.相对保留值相对保留值r2,1：组份：组份2的调整保留值与组份的调整保留值与组份1的调整保留值之比。的调整保留值之比。注意：注意：r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、
12、柱长L、填充情况及流动、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！中广泛用于定性的依据！具体做法：固定一个色谱峰为标准具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰，然后再求其它峰 i 对标准峰的相对保留值对标准峰的相对保留值，此时以，此时以 表示：表示：1,又称选择因子又称选择因子(Selectivity factor)。cor0FtV rVcor0rrFtVVV 1r2r1r2r1,2VVttr )s(t)i(tsr h.区域宽度：用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有区域宽度：用于衡量柱效及反映色谱
13、操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法：三种表示方法：标准偏差标准偏差：0.607倍峰宽处的一半。倍峰宽处的一半。半峰宽半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354 峰底宽峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。W=4 色谱流出曲线的意义：色谱流出曲线的意义：色谱峰数色谱峰数=样品中单组份的最少个数；样品中单组份的最少个数；色谱保留值色谱保留值定性依据；定性依据；色谱峰高或面积色谱峰高或面积定量依据；定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间
14、距色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。固定相或流动相选择是否合适的依据。15.3 色谱法基本原理色谱法基本原理两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的 热力学热力学性质决定。性质决定。每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程 动力学动力学性质决定。性质决定。因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。一、描述分配过程的参数一、描述分配
15、过程的参数 分配系数分配系数(Distribution constant,K)：描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附-脱附过程的参数，称脱附过程的参数，称为分配系数。为分配系数。1.K 只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。msccK 溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度2.分配比分配比(Retention factor or capacity factor,k)：在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和
16、在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，称为分配比。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保流动相中的质量比，称为分配比。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。留因子。其中其中Vm V0，Vs为固定相体积。为固定相体积。分配比分配比 k 的求算：的求算：1）组分滞留因子：）组分滞留因子：2）又，）又，3）因此，）因此，mmssmsVcVcmmk 组分在流动相中的质量组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量组分在固定相中的质量k11mmmuuRsmmss 流流动动相相线线速速度度组组分分线线速速度度0rstLu，tLu 0r0r00r0rVVtttttk
17、)k1(tt 或或3.K 与与 k 的关系：的关系：称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱，称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱，=635；对毛细管柱，；对毛细管柱，=60600。4.选择因子选择因子 ：色谱柱对：色谱柱对A、B两组分的选择因子两组分的选择因子 定义如下：定义如下：A为先流出的组分，为先流出的组分，B为后流出的组分。为后流出的组分。注意：注意：K 或或 k 反映的是某一组分在两相间的分配；而反映的是某一组分在两相间的分配；而 是反映两组分间的分是反映两组分间的分离情况！当两组分离情况！当两组分 K 或或 k 相同时，相同时，=1 时，两组分不能分开
18、；当两组分时，两组分不能分开；当两组分 K 或或 k 相差越大时，相差越大时，越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相间的分配越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。系数不同，是色谱分离的先决条件。和和 k 是计算色谱柱分离效能的重要参数！是计算色谱柱分离效能的重要参数！kVVkV/mV/mccKsmmmssmsABABrrKKkk)A(t)B(t 二、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述二、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述1.塔板理论塔板理论（Plate theory)1952年，年，Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组等人提出的塔板
19、理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。塔板理论假定：塔板理论假定：1）塔板之间不连续；）塔板之间不连续；2）塔板之间无分子扩散；）塔板之间无分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论 塔板高度塔板高度H；4）某组分在所有塔板上的分配系数相同
20、；）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。当塔板数当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数但不对称；当塔板数n50时，峰形接近正态分布。时，峰形接近正态分布。根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数n的公式，用以评价一根柱的公式，用以评价一根柱子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数：子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故
21、塔板数又称理论塔板数：可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。若柱长为若柱长为L，则每块理论塔板高度，则每块理论塔板高度H为为 由上述两式知道，理论塔板数由上述两式知道，理论塔板数n越多、理论塔板高度越多、理论塔板高度H越小、色谱峰越窄，则柱越小、色谱峰越窄，则柱效越高。效越高。但上述两式包含死时间但上述两式包含死时间t0，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常以有效塔板数谱柱的柱效。通常以有效塔板数neff 和有效塔板高度和有效塔板高度Heff 表示：表示：2r22/1r)Wt(16)Wt
22、(54.5n nLH effeff2r22/1reffnLH)Wt(16)Wt(54.5n 有关塔板理论的说明：有关塔板理论的说明：1）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；量、流动相种类及流速、操作条件等；2）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。3）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价
23、柱效的的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。参数。但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释：学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释：v 峰形为什么会扩张？峰形为什么会扩张？v 影响柱效的动力学因素是什么？影响柱效的动力学因素是什么？2.速率理论速率理论（Rate theory）1956年，荷兰化学工程师年，荷兰化学工程师van Deemter提出了色谱过程动力学速率理提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高论：吸收了塔板理论中的板高H概念，考
24、虑了组分在两相间的扩散和传概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了质过程，从而给出了van Deemter方程：方程：u 为流动相线速度；为流动相线速度；A，B，C为常数，其中为常数，其中 A分别表示涡流扩散系数；分别表示涡流扩散系数；B分子扩散系数；分子扩散系数；C传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。，从而提高柱效。Cuu
25、BAH 1）涡流扩散项）涡流扩散项(Multipath term,A)在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性的不均匀性同一组分运行路线长短不同同一组分运行路线长短不同流流出时间不同出时间不同峰形展宽。峰形展宽。展宽程度以展宽程度以A表示：表示：A=2 dp其中其中dp填充物平均直径；填充物平均直径；填充不规则因子。填充不规则因子。可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小可
26、见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。对于空心毛细，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即管柱，无涡流扩散，即A=0。流动方向流动方向2）分子扩散项）分子扩散项(Longitudinal diffusion term,B/u)纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞塞子子”状分布。随着流动相的推进，状分布。随着流动相的推进，“塞子塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为，使谱峰展宽。其大小为B=2 D 称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的
27、阻碍情况；称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；D组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以Dg或或Dm表示；表示；讨论：讨论：q 分子量大的组分，分子量大的组分，Dg小，即小，即B小小q Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；q 流动相分子量大，流动相分子量大，Dg 小，即小，即 B 小；小；q u 增加，组份停留时间短，纵向扩散小；增加，组份停留时间短，纵向扩散小；（B/u）q 对于液相色谱，因对于液相色谱，因Dm 较小，较小，B 项可勿略。项可勿略。)M/1D(g流
28、流动动相相因因为为 球状颗粒；球状颗粒；大分子量流动相；大分子量流动相；适当增加流速；适当增加流速；短柱；短柱；低温。低温。3）传质阻力项）传质阻力项(Mass-transfer term,Cu)因传质阻力的存在，使分配不能因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同。下面分别作讨论。同。下面分别作讨论。a）气液色谱：传质阻力项）气液色谱：传质阻力项C包括气相传质阻力系数包括气相传质阻力系数Cs和液相传质阻
29、力系数和液相传质阻力系数Cl。Dd)k1(k32Dd)k1(k01.0CCCl2f2g2p22lg 流动相流动相固液界面固液界面固定固定液液组分分子组分分子ClCg讨论：讨论：F 减小填充颗粒直径减小填充颗粒直径dp；F 采用分子量小的流动相，使采用分子量小的流动相，使Dg增加；增加；F 减小液膜厚度减小液膜厚度df，Cl下降。下降。但此时但此时k又减小。又减小。因此，当保持固定液含量不变时，可通过因此，当保持固定液含量不变时，可通过 增加固定液载体的比表面来降低增加固定液载体的比表面来降低df。但比。但比 表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。F 增加柱温，可增加增
30、加柱温，可增加Dl，但，但k值也减小，为保值也减小，为保 持合适持合适Cl值，应控制柱温。值，应控制柱温。b）液液色谱：传质阻力项）液液色谱：传质阻力项C包括流动相传质阻力系数包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力和固定相传质阻力系数系数Cs。讨论：讨论：v 流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力Cm、滞留的流动相传、滞留的流动相传 质阻力质阻力Cs。分别与填充物大小。分别与填充物大小 dp、扩散系数、扩散系数(Dm)、微孔大小及其数量等、微孔大小及其数量等 有关。有关。因此，降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在因此，降低流
31、动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在 固定相和流动相中的扩散系数固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。、适当降低线速度、短柱。v 固定相传质阻力与液膜厚度固定相传质阻力与液膜厚度df、保留因子、保留因子 k 和扩散系数和扩散系数Ds等有关。等有关。因此，降低固定相传质阻力的方法有：与气液色谱中液相传质阻力的因此，降低固定相传质阻力的方法有：与气液色谱中液相传质阻力的表述相同。表述相同。s2fsm2psmmsmDdDd)(CCC sm4）流速）流速u 由由van Deemter方程方程 H=A+B/u+Cu知道：知道：当当u一定时，仅在一定时，仅在A、B、C较小时，较小时
32、，H较小，柱效较高；反之则柱效较低，较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。色谱峰将展宽。以以u对对H作图，可得作图，可得H-u曲线（如图），从该曲线得到：曲线（如图），从该曲线得到：C/B BC2A 涡流扩散项涡流扩散项A与流速与流速u无关；无关；低流速区低流速区(u小小)，B/u大，分子扩散项占主导，大，分子扩散项占主导，此时选择分子量大的气体如此时选择分子量大的气体如N2和和Ar为载气，可为载气，可 减小扩散，提高柱效；减小扩散，提高柱效；高流速区高流速区(u大大)，Cu大，传质阻力项占主导，大，传质阻力项占主导，此时选择分子量小的气体如此时选择分子量小的气体如H2和和He为载气，
33、为载气，可增加扩散系数，提高柱效；可增加扩散系数，提高柱效；曲线的最低点对应最佳线速曲线的最低点对应最佳线速uopt()下的下的 最小板高最小板高Hmin()；LC的的Hmin和和uopt均比均比GC的小一个数量级，即在的小一个数量级，即在 LC中，较低流速可获得较大的柱效。中，较低流速可获得较大的柱效。板高，板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u5）固定相颗粒大小对板高的影响）固定相颗粒大小对板高的影响 实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响越小。即，在实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响越小。即，在HPLC分析中采分析中采用细粒作固定相的理论根据！用细粒作固定相
34、的理论根据！但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现HPLC的分析要求。的分析要求。上面分别介绍了影响色谱分离的基本原理以及影响柱效的各种因素，但是上面分别介绍了影响色谱分离的基本原理以及影响柱效的各种因素，但是如何从总体上定量描述色谱分离效能？如何将各种影响因素对分离的影响定量如何从总体上定量描述色谱分离效能？如何将各种影响因素对分离的影响定量地表述出来呢？地表述出来呢？板高板高,H(cm)15.4 分离度及色谱分离方程分离度及色谱分离方程一、分离度一、分离度(Resolution,R)同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效
35、能指标或分同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：辨率。其定义为：利用此式，可直接从利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度色谱流出曲线上求出分离度R。R 越大，相邻组分分离越好。当越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达时，分离程度可达99.7%，因此，因此R=1.5通常用作是否分开的判据。通常用作是否分开的判据。W)tt(WW)tt(2)WW(21ttR121212rr21rr21rr R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间保留时间 t,min)1(4nR)k1k)(1(4nReff 或或二、色谱分离方程二、色谱分离方程 R
36、的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，R 未与影响其大小未与影响其大小的因素：柱效的因素：柱效n、选择因子、选择因子 和保留因子和保留因子 k 联系起来。联系起来。对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数 K 相差小，可合理假设相差小，可合理假设k1 k2=k，W1 W2=W。因此可导出。因此可导出R与与n（neff）、）、和和 k 的关系：的关系：k1k14nkk1114nk)k1(k)kk(4n)k1(t)kk(t4nt2)tt(24nR WW)tt(2R)k1(ttt14nW1)Wt16(n 2
37、22221220120rrr21rr0rrr21212 ：并整理如下并整理如下代入到代入到将上式及将上式及因因附附,具体推导过程如下：具体推导过程如下：有关色谱方程的讨论：有关色谱方程的讨论：1）分离度）分离度R与柱效的关系与柱效的关系 分离度分离度R与理论塔板数与理论塔板数n有关，即有关，即R受热力学性质的影响。受热力学性质的影响。对具一定相对保留值对具一定相对保留值 的物质对，的物质对，R与有效塔板数与有效塔板数neff有关，说明有关，说明neff可正确代可正确代表柱效能。表柱效能。由色谱方程可得：由色谱方程可得：因此可通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展因此可通过
38、增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度宽！为提高柱效，用减小塔板高度 H 的方法比增加柱长更有效。的方法比增加柱长更有效。2）分离度）分离度R与保留因子与保留因子 的关系的关系 越大，柱选择性越好，对分离有利。越大，柱选择性越好，对分离有利。的微小变化可引起的微小变化可引起 R 较大改变。较大改变。如，当如，当 从从1.01增加至增加至1.10(增加增加9%)时，时，R 则增加则增加 9 倍倍(但但 1.5,R增加不大增加不大)。改变改变 的方法有：降低柱温、的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成改变流动相及固定相的性质和组成。3）分
39、离度）分离度R 分配比分配比 k 的关系的关系 k 增加，分离度增加，分离度R 增加，但当增加，但当k10，则，则R的增加不明显。通常的增加不明显。通常k在在210之间。之间。改变改变 k 的方法有：适当增加柱温的方法有：适当增加柱温(GC)、改变流动相性质和组成改变流动相性质和组成(LC)以及固定以及固定相含量。相含量。2121221LLnn)RR(70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂溶剂(流动相流动相)组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响(梯度淋洗梯度淋洗)1：9,10-蒽醌；蒽醌；2：2-甲基甲基-9,1
40、0-蒽醌；蒽醌；3：2-乙基乙基-9,10-蒽醌蒽醌4：1,4-二甲基二甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；5：2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；改变组成使 k 最佳色谱分离中的问题色谱分离中的问题 由于分析物组成复杂，以某一组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，由于分析物组成复杂，以某一组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温（GC）和梯和梯度淋洗度淋洗（LC）来解决这个问题。来解决这个问题。三、分析时间三、分析时间 t 分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。分
41、析时间通常指最后一个组分出峰的时间。由以下三式：由以下三式：得到得到 可见，分析时间与可见，分析时间与R，k、H/u等参数有关。等参数有关。R增加增加1倍，分析时间则是倍，分析时间则是原来的原来的 4 倍。倍。实际工作中，即要能获得有效的分离，又要在较短时间内完成分析。实际工作中，即要能获得有效的分离，又要在较短时间内完成分析。)3.().k1k)(1(4nR)2.(.HLn)1.().k1(uL)k1(tt0r 2322rk)k1()1(uHR16t 参数参数 符号符号 测定或计算测定或计算 死时间死时间(迁移时间迁移时间)，不参，不参与分配组分与分配组分 0t 色色谱谱图图 保留时间，组分
42、保留时间，组分 1 和和 2 21rrt，t 色色谱谱图图 调整保留时间，组分调整保留时间，组分 1 r1t 0rrttt11 峰宽，组分峰宽，组分 1 和和 2 W1，W2 色色谱谱图图 柱长柱长 L 直接直接测测量量 流速流速 Fco 直接直接测测量量 流流(固固)定相体积定相体积 Vm，Vs 填填充充制制备备记录记录 流流(固固)定相浓度定相浓度 cm，cs 分析分析和和制制备备记录记录 概念、表示方法及计算公式汇总概念、表示方法及计算公式汇总表表-1参数参数 符号符号 测定或计算测定或计算 线速线速 0t/Lu 流动相体积流动相体积 co0mFtV 保留因子保留因子 00rt/)tt(
43、k msVKVk 分配系数分配系数 smVkVK msccK 选择因子选择因子 0r0rtttt12 1212KKkk 分离度分离度 211r2rWW)tt(2R )k1k)(1(4nR 塔板数塔板数 2r)Wt(16n 222)kk1()1(R16n 板高板高 NLH 保留保留(分析分析)时间时间 2322rk)k1()1(uHR16t 表表-2例：两物质例：两物质A和和B在在30cm长的色谱柱上的保留时间分别为长的色谱柱上的保留时间分别为16.4和和17.63min，有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保留时间为，有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保留时间为1.30 min。物质。物
44、质A和和B的峰底宽分别为的峰底宽分别为1.11和和1.21min。试问：。试问：1）柱分辨率）柱分辨率R；2）柱平均理论塔板数）柱平均理论塔板数nav3）平均塔板高度）平均塔板高度Hav4）若要求）若要求R达到达到1.5，则柱长至少应为多少？，则柱长至少应为多少？5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R达到达到1.5，该柱的塔板高度，该柱的塔板高度应为多少？应为多少？1）2）3）4）06.1min)21.111.1(min)40.1663.17(2Rs 333a
45、v32B32A1044.32/)1040.31049.3(n1040.3)1.2163.17(16；n1049.3)11.140.16(16n cm60107.810.96HnL109.6nn1044.35.106.1；nnRR：，HLk3332232121 因因此此即即因因此此可可得得到到无无关关或或塔塔板板高高度度与与柱柱长长或或 cm107.81044.330nLH33av 5）6）min35)t()5.106.1()t(63.17RR)t()t(2r22r22212r1r cm10.34H，1HH)RR()(t)(t，。B,k)k1()1(uHR16t3-221221BrBr232r 得得代代入入各各值值分分析析时时间间相相等等辨辨率率条条件件下下本本题题要要求求在在达达到到相相同同分分之之比比物物质质在在两两柱柱上上分分析析时时间间得得到到由由式式 36谢谢！谢谢！
