1、2006-08-24-1-药品无菌保证药品无菌保证基本原理基本原理江苏江苏 无锡无锡 2006-09 2006-09 邓海根邓海根 2006-08-24-2-内内 容容1.微生物基础知识简介微生物基础知识简介2.热力灭菌基本原理热力灭菌基本原理3.药典对最终灭菌产品的无菌标准药典对最终灭菌产品的无菌标准4.注射剂常见灭菌方法注射剂常见灭菌方法5.灭菌工艺的验证灭菌工艺的验证6.常见灭菌设备介绍（示意）常见灭菌设备介绍（示意）7.容器密封可靠性验证容器密封可靠性验证2006-08-24-3-第一部分第一部分微生物基础知识简介微生物基础知识简介2006-08-24-4-一、微生物生存的环境一、微生
2、物生存的环境n人类生活的环境充斥着大人类生活的环境充斥着大量微生物量微生物 n海拔海拔100英里（约英里（约160公里）公里）以上以上n海平面以下海平面以下600英尺（约英尺（约182米）的地方都可以发米）的地方都可以发现微生物的踪迹现微生物的踪迹n1英里英里=5,280英尺或英尺或1.609公里公里2006-08-24-5-一、常见微生物一、常见微生物种类种类基本特点基本特点细菌细菌0.5 5 m，生长态时不耐热，部分，生长态时不耐热，部分能形成耐热芽孢能形成耐热芽孢真菌真菌5 m 50 m，形成芽孢随空气扩，形成芽孢随空气扩散，不耐热散，不耐热病毒病毒小于小于0.1 m，一般不耐热，一般不
3、耐热，0.22m过滤不了过滤不了2006-08-24-6-一、真菌和细菌一、真菌和细菌大小大小真菌真菌 5 m 50 m细菌细菌 0.5 5 m主要成员主要成员酵母、霉菌酵母、霉菌细菌细菌细胞组成细胞组成酵母是单细胞，其它为多细胞酵母是单细胞，其它为多细胞均为单细胞均为单细胞细胞质细胞质成份成份遗传物质遗传物质(DNA)被双层核膜包裹被双层核膜包裹(真真核核)，并且还有如线粒体、叶绿体及，并且还有如线粒体、叶绿体及高卡基体等被膜包裹的细胞器。高卡基体等被膜包裹的细胞器。遗传物质遗传物质(DNA)祼露并游离于细胞质祼露并游离于细胞质内内(原核原核)，并且不含有其它有膜细胞，并且不含有其它有膜细胞
4、器。器。繁殖方式繁殖方式有性（如大型真菌或无性如酵母），有性（如大型真菌或无性如酵母），霉菌则二者兼有霉菌则二者兼有无性（裂殖）无性（裂殖）孢子孢子霉菌产生分生孢子（生长繁殖，类似霉菌产生分生孢子（生长繁殖，类似于植物的种子于植物的种子)，虽不耐热，但会飘，虽不耐热，但会飘浮于空气中而难以消除。浮于空气中而难以消除。酵母不会产生孢子。酵母不会产生孢子。主要只有两个属产生孢子（内生孢主要只有两个属产生孢子（内生孢子），又名芽孢：子），又名芽孢：Bacillus-芽孢杆菌属和芽孢杆菌属和Clostridium-梭菌属梭菌属，细菌芽孢属于，细菌芽孢属于休眠体，一个细菌细胞产生一个芽孢休眠体，一个细菌
5、细胞产生一个芽孢生长条件生长条件20-25oC,3-5天天30-35 oC,1-2天天杀灭程度杀灭程度不耐热，但难用消毒剂消毒（因孢子不耐热，但难用消毒剂消毒（因孢子处于漂浮状态）处于漂浮状态）生长态菌不耐热（极个别除外），但生长态菌不耐热（极个别除外），但形成芽孢后耐热。形成芽孢后耐热。2006-08-24-7-一、微生物分布特点一、微生物分布特点微生物无处不在微生物无处不在气源性微生物革兰氏阳性菌较多气源性微生物革兰氏阳性菌较多它们可形成芽孢，难以杀灭它们可形成芽孢，难以杀灭因此，药品生产需要因此，药品生产需要HVAC水源性则革兰氏阳性菌居多水源性则革兰氏阳性菌居多不会生成孢子不会生成孢子
6、但会形成细菌内毒素但会形成细菌内毒素耐热性差耐热性差G+G-2006-08-24-8-一、生长态菌及孢子一、生长态菌及孢子n将植物比喻微生物，不恰当而直观将植物比喻微生物，不恰当而直观n如玉米，发芽如玉米，发芽 生长生长 种子，前二种相当于微生物的种子，前二种相当于微生物的生长状态，到了种子，对环境的（水分、温度等）耐生长状态，到了种子，对环境的（水分、温度等）耐受性大大增强受性大大增强n然而，微生物的芽孢，并不是繁殖的手段，而是休眠然而，微生物的芽孢，并不是繁殖的手段，而是休眠体，植物没有这种相对应的东西体，植物没有这种相对应的东西n革兰氏阳性菌：气源性，身体上部，呼吸道革兰氏阳性菌：气源性
7、，身体上部，呼吸道n革兰氏阴性菌：则是水源性的，细胞结构不同革兰氏阴性菌：则是水源性的，细胞结构不同n生物指示剂均为革兰氏阳性菌，灭菌用生物指示剂均为革兰氏阳性菌，灭菌用BI为非致病菌。为非致病菌。2006-08-24-9-一、细菌芽胞（孢）的形成及其特性一、细菌芽胞（孢）的形成及其特性成熟芽孢孢子壁母细胞孢子壁的形成生长态细胞摘自摘自 http:/www.microbe.org/microbes/spores.asp内生孢子内生孢子产生于产生于 Gram+细菌细菌:芽孢杆菌属芽孢杆菌属Bacillus 梭菌属梭菌属Clostridium仅含核酸及少量萌发必需物仅含核酸及少量萌发必需物皮层含皮
8、层含DPA和和Ca2+复合物复合物能抵御各种恶劣环境能抵御各种恶劣环境可休眠上百万年可休眠上百万年真菌孢子因不具上述特性真菌孢子因不具上述特性而不耐热而不耐热DPA：吡啶二羧酸：吡啶二羧酸2006-08-24-10-一、生物指示剂（一、生物指示剂（BIBI）的定义）的定义n对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于定量测定灭菌效力的微生物制剂定量测定灭菌效力的微生物制剂（USP28）n特点特点n用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的耐用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的耐受性、稳定性、易培养、及非致病性受性、稳定性、易培养、及非致病性n相用于被验证产品、灭菌工艺
9、、生产工艺相用于被验证产品、灭菌工艺、生产工艺n符合有关法规的要求符合有关法规的要求2006-08-24-11-一、什么是芽孢？一、什么是芽孢？n当某些细菌遇到不良生存环境条件时，为当某些细菌遇到不良生存环境条件时，为保护自身，在细胞内形成一外壁厚而坚硬保护自身，在细胞内形成一外壁厚而坚硬的体眠体，该体眠体即称芽孢（的体眠体，该体眠体即称芽孢（SporeSpore）或）或孢子。孢子。n由于其对不良环境的耐受性远高于生长态由于其对不良环境的耐受性远高于生长态细胞，常被用于挑战灭菌工艺，以确认被细胞，常被用于挑战灭菌工艺，以确认被灭菌物品无菌的可靠性。灭菌物品无菌的可靠性。2006-08-24-1
10、2-一、芽孢的特性一、芽孢的特性n主要产生于主要产生于Gram+细菌的两个属细菌的两个属n芽孢杆菌属芽孢杆菌属 Bacillusn梭菌属梭菌属 Clostridiumn能抵御各种恶劣环境，可存活上百万年，因为它能抵御各种恶劣环境，可存活上百万年，因为它n有厚的皮层结构有厚的皮层结构n仅含核酸及少量萌发必需物仅含核酸及少量萌发必需物n含水量极低含水量极低n休眠体，内生孢子，不可再生（每个细胞只产生一休眠体，内生孢子，不可再生（每个细胞只产生一个芽孢）；真菌孢子属于分生孢子，不具上述特性。个芽孢）；真菌孢子属于分生孢子，不具上述特性。2006-08-24-13-芽孢的特点芽孢的特点n耐热耐热u80
11、 下长期存活下长期存活u100 下有相当高的存活率下有相当高的存活率u100 以上死亡过程符合一级动力学方程以上死亡过程符合一级动力学方程n影响芽孢耐热性的因素影响芽孢耐热性的因素n芽孢存在的介质芽孢存在的介质n受热时的湿度受热时的湿度2006-08-24-14-生物指示剂（生物指示剂（BIBI）n对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于定量测定灭菌效力的微生物制剂定量测定灭菌效力的微生物制剂（USP28）n特点特点n芽孢芽孢n用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的耐用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的耐受性、稳定性、易培养、及非致病性受性、稳定性、易培养、及
12、非致病性2006-08-24-15-第二部分第二部分热力灭菌基本原理热力灭菌基本原理2006-08-24-16-热对微生物的作用热对微生物的作用n当高温破坏了细胞中起生命作用的蛋白当高温破坏了细胞中起生命作用的蛋白质、酶及核酸时，细胞死亡。质、酶及核酸时，细胞死亡。n生命基本物质的破坏本质上是化学变化生命基本物质的破坏本质上是化学变化n实验证明微生物受热死亡速度符合一级实验证明微生物受热死亡速度符合一级动力学方程动力学方程2006-08-24-17-一级动力学方程式一级动力学方程式ndN/dtK(N0Nt)n N0为为t0时，存活的微生物数；时，存活的微生物数；n Nt为为t时被杀灭的微生物数
13、；时被杀灭的微生物数；n N为为t时存活的微生物数时存活的微生物数n K为常数。为常数。n对数规则对数规则2006-08-24-18-微生物存活数与灭菌时间关系图微生物存活数与灭菌时间关系图 半对数座标半对数座标Y轴：微生物取对数轴：微生物取对数X轴：时间为轴：时间为10进制普通座标进制普通座标tlgN102030123Y轴及轴及X轴均为普通座标（示意）轴均为普通座标（示意）t N1020301010010002006-08-24-19-芽孢的耐热参数：芽孢的耐热参数：D值值n指一定温度下将指一定温度下将微生物杀灭微生物杀灭90 或下降一个对数或下降一个对数单位所需要的时单位所需要的时间。间。
14、lgNlgNt t1 12 23 34 4t t1 1t t2 2D D2006-08-24-20-灭菌温度对灭菌温度对D值的影响值的影响 灭菌温度低时，达到同一灭菌效果的时间就长灭菌温度低时，达到同一灭菌效果的时间就长115121125lgNtlgN=1D125D121D1152006-08-24-21-F0值：达到同一灭菌效果的概念值：达到同一灭菌效果的概念 F0值即标准灭菌时间值即标准灭菌时间指产品在灭菌过程中获得的与标准参照条指产品在灭菌过程中获得的与标准参照条件（件（121）相同灭菌效果的曝热时间）相同灭菌效果的曝热时间lgNtLgNoLgNt121117LgNFTFo2006-08
15、-24-22-不同灭菌温度下的灭菌率不同灭菌温度下的灭菌率灭菌温度灭菌温度 灭菌率灭菌率L1000.0081050.0251120.1261150.2511160.3161180.5011200.7941211.0001221.251231.59n灭菌率：为达到与某一温灭菌率：为达到与某一温度下灭菌度下灭菌1分钟相同的灭菌分钟相同的灭菌效果，在效果，在121下灭菌所需下灭菌所需要的灭菌时间要的灭菌时间 n100灭菌时灭菌时1分钟，相当分钟，相当于于121 灭菌灭菌0.008分钟，分钟，即即Fo值为值为0.008分钟。分钟。n105灭菌灭菌40分钟时，分钟时，Fo约为约为 1分钟，能使分钟，能使
16、D值为值为1分钟的芽孢数量下降分钟的芽孢数量下降1个对个对数单位数单位2006-08-24-23-第三部分第三部分药典对最终灭菌产品的无菌标准药典对最终灭菌产品的无菌标准2006-08-24-24-无菌检查的局限性无菌检查的局限性n历史的教训历史的教训：n1962年，美国年，美国FDA颁布第一部颁布第一部GMPn1970-1975年，美国输液污染至败血症年，美国输液污染至败血症400多起多起 -有问题的产品全部通过了无菌检查有问题的产品全部通过了无菌检查n无菌检查的风险（另稿有示例说明）无菌检查的风险（另稿有示例说明）取样量为取样量为20瓶时污染率与通过无菌检查概率的关系瓶时污染率与通过无菌检
17、查概率的关系批产品污染率批产品污染率5101520通过无菌检查的概率通过无菌检查的概率3612412006-08-24-25-药典对无菌保证的定量标准药典对无菌保证的定量标准n1973年的英国药典和年的英国药典和1980年年USP增补版提到了增补版提到了无菌的量化标准无菌的量化标准nFo不小于不小于8分钟分钟n经灭菌后，产品中污染菌存活的概率不大于百经灭菌后，产品中污染菌存活的概率不大于百万分之一。万分之一。n中国药典在中国药典在2000版起，收载了此标准。版起，收载了此标准。n无菌保证值：污染菌存活概率的负对数，经灭无菌保证值：污染菌存活概率的负对数，经灭菌后，产品的无菌保证值不小于菌后，产
18、品的无菌保证值不小于6lgN2345-2-3-41-5-6-101234576891012分分11SAL F0/D lgN0假定假定D121为为1无菌保证值与无菌保证值与Fo、D值及带菌量的关系值及带菌量的关系过度杀灭示意过度杀灭示意生产中生产中Fo=8示意示意2006-08-24-27-“无菌无菌”的标准及概念的标准及概念n“每批产品中，污染品概率不得超过一百万分之每批产品中，污染品概率不得超过一百万分之一一”，无菌的这一量化标准应当可以用试验来证，无菌的这一量化标准应当可以用试验来证明的。用无菌检查法显然是不可能的。明的。用无菌检查法显然是不可能的。n然而，每瓶产品微生物存活的概率却可计算
19、的。然而，每瓶产品微生物存活的概率却可计算的。n这就需要测试产品灭菌前微生物污染数、这就需要测试产品灭菌前微生物污染数、D D值，使值，使用对数规则，并用生物指示剂试验来证实。用对数规则，并用生物指示剂试验来证实。n量化指标量化指标 +计算计算 +试验，使无菌标准成为工业试验，使无菌标准成为工业界可执行的标准界可执行的标准 2006-08-24-28-产品灭菌完全的必要措施产品灭菌完全的必要措施 从公式从公式 SAL F0/D lgN0看灭菌完全的必要措施看灭菌完全的必要措施n足够的足够的F0值值n产品灭菌前污染菌检测产品灭菌前污染菌检测需氧菌总计数（微生物污染水平）需氧菌总计数（微生物污染水
20、平）污染菌耐热性污染菌耐热性2006-08-24-29-产品灭菌完全的必要措施产品灭菌完全的必要措施-2通常采用的中间控制手段：通常采用的中间控制手段：n对每批的灌封开始和结束阶段，分别对灌装好对每批的灌封开始和结束阶段，分别对灌装好的半成品取样检测。的半成品取样检测。样品须作需氧菌总计数样品须作需氧菌总计数将检品液置于将检品液置于100下加热下加热10分钟，检查是否有耐热分钟，检查是否有耐热芽孢存活芽孢存活n须对微生物学检测结果进行趋势分析。须对微生物学检测结果进行趋势分析。2006-08-24-30-产品灭菌完全的必要措施产品灭菌完全的必要措施-3 FDA要求要求 “对于在灭菌前产品污染菌
21、检测中所发对于在灭菌前产品污染菌检测中所发现的耐热孢子，必须与验证灭菌工艺所用现的耐热孢子，必须与验证灭菌工艺所用生物指示剂的耐热性进行对比生物指示剂的耐热性进行对比”2006-08-24-31-产品灭菌完全的必要措施产品灭菌完全的必要措施-4具体要求：具体要求：n如经热处理后检出的微生物是芽孢类微生物。需将其如经热处理后检出的微生物是芽孢类微生物。需将其培养并收集芽孢，测定其的耐热性，将之与验证灭菌培养并收集芽孢，测定其的耐热性，将之与验证灭菌工艺用生物指示剂的耐热性进行对比。工艺用生物指示剂的耐热性进行对比。n如果所分离的污染菌耐热性高于生物指示剂的耐热性，如果所分离的污染菌耐热性高于生物
22、指示剂的耐热性，则必须使用耐热性更强的生物指示剂对灭菌工艺重新则必须使用耐热性更强的生物指示剂对灭菌工艺重新进行验证进行验证(可以使用生产中的分离菌可以使用生产中的分离菌)。n如果在生产全过程中，对微生物污染严格控制，那么，如果在生产全过程中，对微生物污染严格控制，那么，这种情况发生的概率是非常小的。这种情况发生的概率是非常小的。2006-08-24-32-无菌保证水平举例无菌保证水平举例n假定灭菌开始时产品中的污染微生物总数（假定灭菌开始时产品中的污染微生物总数（N0）为为100cfu/瓶，污染微生物的耐热参数（瓶，污染微生物的耐热参数（D）为）为1分分钟，要达到药典规定的钟，要达到药典规定
23、的SAL不小于不小于6的标准，灭菌的标准，灭菌F0值应达到多少？相当于值应达到多少？相当于121 和和115 下灭菌多下灭菌多少分钟？少分钟？n答：答：F0=（SALlgN0）D=（6+lg100）1=8分钟，需在分钟，需在121下灭菌下灭菌8分钟。分钟。n换算成换算成115 下的灭菌时间是：下的灭菌时间是：F0/L115=8/0.25=32分钟。分钟。2006-08-24-33-n某复方氨基酸注射液采用某复方氨基酸注射液采用110，30分钟的灭菌分钟的灭菌程序，起始污染微生物仍为程序，起始污染微生物仍为100cfu/瓶，瓶，D值为值为0.5分钟，请计算无菌保证值和残存微生物污染分钟，请计算无
24、菌保证值和残存微生物污染的概率。的概率。n答：其答：其SAL为：为：SAL=F0/D-lgN0=L110t/D-lg100=0.0830/0.5-2=2.8n残存微生物的概率为残存微生物的概率为10-2.80.158n通过无菌检查的概率为通过无菌检查的概率为(1-0.158)20=96.9%。无菌保证水平举例二无菌保证水平举例二2006-08-24-34-第四部分第四部分注射剂常见灭菌方法注射剂常见灭菌方法2006-08-24-35-湿热灭菌湿热灭菌-1-1n湿热灭菌通常指一定压力下的蒸汽灭菌，湿热灭菌通常指一定压力下的蒸汽灭菌，也包括过热水灭菌（水浴式或喷淋式）也包括过热水灭菌（水浴式或喷淋
25、式）n实际上只要微生物处于达到水水蒸气实际上只要微生物处于达到水水蒸气平衡状态下的灭菌过程，都是湿热灭菌平衡状态下的灭菌过程，都是湿热灭菌n例：实验室给微生物取样瓶灭菌时通常加入例：实验室给微生物取样瓶灭菌时通常加入1ml水并密封。水并密封。n水分的存在有利于灭菌水分的存在有利于灭菌2006-08-24-36-湿热灭菌特点湿热灭菌特点n蒸汽有利于蛋白质的变性和酶的失活，从而蒸汽有利于蛋白质的变性和酶的失活，从而杀灭细胞杀灭细胞n 蒸汽热穿透性强蒸汽热穿透性强n 灭菌效率高灭菌效率高n温度相对较低温度相对较低n灭菌时间相对短灭菌时间相对短n灭菌过程不产生任何化学物理污染灭菌过程不产生任何化学物理
26、污染n灭菌设备控制参数少，运行稳定，方便管理灭菌设备控制参数少，运行稳定，方便管理 2006-08-24-37-湿热灭菌工艺之一湿热灭菌工艺之一n美国美国FDA规定的残存概率法规定的残存概率法n灭菌过程灭菌过程8 F01210-6热稳定性好的产品热稳定性好的产品以杀灭微生物作为实现无菌的手段以杀灭微生物作为实现无菌的手段残存概残存概率法率法Fo810-6热稳定性较差产品热稳定性较差产品工艺过程将防止产品被耐热菌污染放在首位，而工艺过程将防止产品被耐热菌污染放在首位，而不是仅依赖最终灭菌去消除污染不是仅依赖最终灭菌去消除污染 流通蒸流通蒸汽法汽法不计算不计算Fo0.1%热不稳定产品热不稳定产品加
27、热是无菌生产工艺（除菌过滤）的补充手段加热是无菌生产工艺（除菌过滤）的补充手段除菌除菌过滤法过滤法LRV70.1%不能加热的产品不能加热的产品LRV=log reduction value 过滤对数下降值，一般过滤对数下降值，一般上游为上游为107下游为下游为1，则，则LRV=7由于后续无菌操作较多，最终产品达到的无菌保由于后续无菌操作较多，最终产品达到的无菌保证水平远低于除菌过滤的本身的能力证水平远低于除菌过滤的本身的能力2006-08-24-42-干热灭菌机理干热灭菌机理n干热灭菌干热灭菌与与湿热灭菌湿热灭菌的动力学特征相似，的动力学特征相似，符合符合“对数规则对数规则”，但灭菌的机理却并
28、，但灭菌的机理却并不相同。不相同。n干热灭菌为何需较高的温度？干热灭菌为何需较高的温度？n水份的影响：湿度低水份的影响：湿度低n机理不同：干热灭菌是使微生物氧化而不机理不同：干热灭菌是使微生物氧化而不是使蛋白质变性是使蛋白质变性2006-08-24-43-干热灭菌要点干热灭菌要点干热灭菌的介质通常是热空气干热灭菌的介质通常是热空气n用对数规则描述微生物杀灭过程，准确性用对数规则描述微生物杀灭过程，准确性较差较差n温度高，温度高，200 以上，有可能到以上，有可能到320 n用于玻璃容器、手术器械等用于玻璃容器、手术器械等n无菌生产工艺中安瓿、西林瓶的灭菌和去无菌生产工艺中安瓿、西林瓶的灭菌和去
29、热源热源2006-08-24-44-干热灭菌与去热原的关系干热灭菌与去热原的关系n去热原的工艺条件比孢子杀灭程序要苛去热原的工艺条件比孢子杀灭程序要苛刻得多，通常相当于标准干热灭菌时间刻得多，通常相当于标准干热灭菌时间FH 的数十倍。的数十倍。n如果干热法去热原工艺能使细菌内毒素如果干热法去热原工艺能使细菌内毒素下降下降3个对数单位，就不必再进行微生个对数单位，就不必再进行微生物的生物指示剂挑战性试验。物的生物指示剂挑战性试验。2006-08-24-45-第五部分第五部分灭菌工艺的验证灭菌工艺的验证2006-08-24-46-灭菌工艺的验证灭菌工艺的验证n灭菌工艺验证资料是国外药品（注射剂）注
30、册的必报材料灭菌工艺验证资料是国外药品（注射剂）注册的必报材料n灭菌工艺条件（灭菌介质、温度时间参数、装载方式等）灭菌工艺条件（灭菌介质、温度时间参数、装载方式等）n灭菌设备和灭菌工艺的验证（前者与后者不同）灭菌设备和灭菌工艺的验证（前者与后者不同）n灭菌工艺验证资料包括灭菌工艺验证资料包括n灭菌设备的安装确认灭菌设备的安装确认n灭菌设备的运行确认灭菌设备的运行确认n灭菌工艺的验证灭菌工艺的验证n先对设备温度仪表和验证用仪表进行校准先对设备温度仪表和验证用仪表进行校准n空载热分布找到灭菌过程中灭菌设备的最冷点空载热分布找到灭菌过程中灭菌设备的最冷点n不同装载形式、不同装量规格产品的热穿透试验产
31、品获得的不同装载形式、不同装量规格产品的热穿透试验产品获得的F0n生物指示剂验证生物指示剂验证-微生物挑战性试验微生物挑战性试验2006-08-24-47-灭菌过程的灭菌过程的Fo 示意示意灭菌过程的温度-时间曲线产品温度腔室温度保温升温冷却TL（灭菌率）t（分）2006-08-24-48-热力灭菌常用生物指示剂热力灭菌常用生物指示剂灭菌方式灭菌方式 微生物（孢子）微生物（孢子）D值范围（分）值范围（分）湿湿 热热121嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌 Bacillus stearothermophilus 1.5-3.0 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 0.3-
32、0.7凝结芽孢杆菌凝结芽孢杆菌 Bacillus coagulans 0.4-0.8梭状芽孢杆菌梭状芽孢杆菌 Clostridium sporogenes 0.4-0.8干热干热 150 枯草芽孢杆菌黑色变种枯草芽孢杆菌黑色变种 Bacillus subtilis var.niger 1.0 资料来源：参数放行专题材料资料来源：参数放行专题材料2006-08-24-49-第六部分第六部分 常见灭菌设备介绍常见灭菌设备介绍2006-08-24-50-灭菌设备灭菌设备1、混合蒸汽灭菌柜、混合蒸汽灭菌柜2、下排式蒸汽灭菌柜、下排式蒸汽灭菌柜3、脉动真空蒸汽灭菌柜、脉动真空蒸汽灭菌柜4、旋转喷淋灭菌柜
33、、旋转喷淋灭菌柜5、隧道式洗瓶灭菌柜工作原理图、隧道式洗瓶灭菌柜工作原理图2006-08-24-51-混合蒸汽灭菌柜混合蒸汽灭菌柜热交换器热交换器隔板风机SAM=steam air mixture蒸汽空气混合灭菌柜蒸汽空气混合灭菌柜混合汽体灭菌柜混合汽体灭菌柜进蒸汽的管没画出进蒸汽的管没画出顶上用一风扇，使灭菌均匀顶上用一风扇，使灭菌均匀无风扇时，灭菌容易不均匀无风扇时，灭菌容易不均匀热交换器控制冷却速度热交换器控制冷却速度2006-08-24-52-蒸汽进排放蒸汽档板空气温度计压力表下排式蒸汽灭菌柜下排式蒸汽灭菌柜热蒸汽在上热蒸汽在上冷空气在下冷空气在下蒸汽挤空气蒸汽挤空气2006-08-2
34、4-53-脉动真空蒸汽灭菌柜脉动真空蒸汽灭菌柜有高真空及有高真空及脉动真空二种形式脉动真空二种形式第二种比较常见第二种比较常见抽抽99%，剩，剩1%3次真空，残存的空气次真空，残存的空气为为0.1%密封圈密封圈工业蒸汽纯蒸汽补气0.45钛滤器A0.45钛滤器B气动阀C气动阀A气动阀B气动阀D水环泵气动阀E手动阀C手动阀A手动阀B验证接口夹套压力设定腔室真空设定腔室压力设定过滤阀A过滤阀BPt100接记录仪Pt100接温控仪地漏地漏灭菌腔室夹套2006-08-24-54-旋转喷淋灭菌柜旋转喷淋灭菌柜工业蒸汽冷却水循环泵纯化水或注射用水纯化水或注射用水作传热介质作传热介质-过热水过热水灭菌灭菌加热
35、时开工业蒸汽加热时开工业蒸汽冷却时，可用冷冻冷却时，可用冷冻水或自来水冷却水或自来水冷却产品转动，受热均匀产品转动，受热均匀软袋灭菌时，用过热水软袋灭菌时，用过热水较多，但需加压缩空气较多，但需加压缩空气2006-08-24-55-干热灭菌柜干热灭菌柜加热器高效过滤冷却器高效过滤温度探头冷却水循环风机导流板导流板高效过滤常见程序：常见程序：1802小时，细菌内毒素下降小时，细菌内毒素下降3对数单位对数单位2006-08-24-56-隧道式洗瓶灭菌柜工作原理图隧道式洗瓶灭菌柜工作原理图瓶清洁瓶清洁排水汽排水汽预热预热去热原去热原冷却冷却干热灭菌干热灭菌层流层流保护保护洗瓶及灭菌、去热原为联动线洗
36、瓶及灭菌、去热原为联动线B区区2006-08-24-57-冰浴冰浴0.01油浴油浴121数据采集器数据采集器参照仪参照仪验证仪校准验证仪校准2006-08-24-58-第七部分第七部分 容器密封可靠性验证容器密封可靠性验证2006-08-24-59-密封系统完好性密封系统完好性-物理法物理法待确认的密封口待确认的密封口WFI支架支架氯化钠溶液氯化钠溶液容器容器经灭菌后，氯化钠有否进入瓶内？经灭菌后，氯化钠有否进入瓶内？2006-08-24-60-密封系统完好性密封系统完好性-挑战试验挑战试验待确认的密封口待确认的密封口培养基培养基支架支架菌液菌液如如108个菌个菌/ml容器容器大肠埃希氏菌、铜
37、绿假单胞菌或粘质沙雷氏菌大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌或粘质沙雷氏菌2006-08-24-61-产品存放期密封可靠性检查产品存放期密封可靠性检查-1微生物侵入试验微生物侵入试验n往产品容器内灌入培养基并按常规方式压塞轧盖，灭往产品容器内灌入培养基并按常规方式压塞轧盖，灭菌后冷却备用。菌后冷却备用。n将冷却后的容器倒置，并将瓶口完全浸没于高浓度的将冷却后的容器倒置，并将瓶口完全浸没于高浓度的运动性细菌溶液运动性细菌溶液(如如108个菌个菌/ml)内，如有大肠埃希氏菌、内，如有大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌或粘质沙雷氏菌。铜绿假单胞菌或粘质沙雷氏菌。n将容器外表面消毒并培养，看容器内是否有挑战性细将容器外
38、表面消毒并培养，看容器内是否有挑战性细菌生长。菌生长。2006-08-24-62-产品存放期密封可靠性检查产品存放期密封可靠性检查-2n此试验条件比实际储存和运输时产品遭微生物污此试验条件比实际储存和运输时产品遭微生物污染的条件要苛刻得多。染的条件要苛刻得多。n另应多留一些装有培养基产品的容器，并置于与另应多留一些装有培养基产品的容器，并置于与稳定性样品相同的贮存条件下存放。稳定性样品相同的贮存条件下存放。n每隔一定的时间间隔（如每隔一定的时间间隔（如12，24，36和和48个月个月等），取出部分容器，按上述方法进行检测，以等），取出部分容器，按上述方法进行检测，以确定密封系统的稳定性。确定密
39、封系统的稳定性。2006-08-24-63-产品存放期密封可靠性检查产品存放期密封可靠性检查-3n应证明产品经最长灭菌时间后，容器应证明产品经最长灭菌时间后，容器/胶塞系统依然保持良好的密封性。胶塞系统依然保持良好的密封性。n如果某产品在生产过程中不止灭菌一次，如果某产品在生产过程中不止灭菌一次，那么在密封完好性验证方案中，应取灭那么在密封完好性验证方案中，应取灭菌程序最长时间的样品作验证试验。菌程序最长时间的样品作验证试验。2006-08-24-64-小小 结结n细菌芽孢死亡规律符合一级动力学方程细菌芽孢死亡规律符合一级动力学方程n无菌检查有明显的局限性无菌检查有明显的局限性n药典规定最终灭
40、菌产品的污染概率不超过百万分之一，药典规定最终灭菌产品的污染概率不超过百万分之一，即无菌保证值即无菌保证值SAL不小于不小于6nSAL F0/D lgN0nF0值标准灭菌时间值标准灭菌时间nD值微生物耐热参数值微生物耐热参数nN0灭菌开始前微生物污染数灭菌开始前微生物污染数2006-08-24-65-小小 结结-续续nFDA将湿热灭菌工艺分为二类：将湿热灭菌工艺分为二类：n过度杀灭法过度杀灭法 Fo不小于不小于12n残存概率法残存概率法Fo不小于不小于 8nFo值低于值低于8时，应采用无菌制造工艺，并用加时，应采用无菌制造工艺，并用加热方法提高无菌保证水平热方法提高无菌保证水平n这是一种补充手
41、段，可看作消毒这是一种补充手段，可看作消毒n非最终灭菌产品的无菌保证水平为非最终灭菌产品的无菌保证水平为0.1%2006-08-24-66-思考题思考题1.请解释药典的无菌标准请解释药典的无菌标准2.除菌过滤的除菌过滤的LRV指什么，生产中指什么，生产中实际能达到何种无菌保证水平？实际能达到何种无菌保证水平？无菌制造工艺的污染风险主要来无菌制造工艺的污染风险主要来自过滤，此理解对否？自过滤，此理解对否？3.LVP产品药液是均一的，因此污产品药液是均一的，因此污染也是均一的，对否？说明再由染也是均一的，对否？说明再由4.100 30分钟灭菌后，产品无菌分钟灭菌后，产品无菌检查合格，该批是否符合无
42、菌要检查合格，该批是否符合无菌要求？求？5.热力灭菌工艺最终灭菌产品的无热力灭菌工艺最终灭菌产品的无菌取决于什么？菌取决于什么？6.灭菌程序验证中，应将耐热性最灭菌程序验证中，应将耐热性最强的芽孢，以强的芽孢，以106浓度接入产品中，浓度接入产品中，并在灭菌后下降并在灭菌后下降6D或或12D，此理，此理解对否？解对否？7.简述湿热灭菌工艺的生物指示剂简述湿热灭菌工艺的生物指示剂验证，验证，BI的装载要求的装载要求8.使用残存曲线法测定使用残存曲线法测定D值时，如值时，如何确定试验参数？何确定试验参数？9.灭菌时发生停电，第一次灭菌灭菌时发生停电，第一次灭菌Fo为为2，再次灭菌为，再次灭菌为6，问灭菌是否，问灭菌是否完全？完全？
